本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及启动子gmlcla1在时间特异性精细调控基因响应脱落酸处理和水分胁迫中的应用。
背景技术：
水分是大豆等植物生长发育过程中的关键环境因素。充足的水分供给对于大豆的产量至关重要，尤其是在花期和灌浆期，水分胁迫会导致大豆减产30％-80％。脱落酸(aba)调控种子休眠与萌发、气孔闭合、植株生长与衰老以及多种生物和非生物胁迫等过程，是植物响应水分胁迫过程中的重要激素。开发响应水分胁迫和脱落酸表达的启动子对于植物对水分胁迫的响应调节具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是提供能够响应脱落酸处理或水分胁迫并时间特异性精细调控基因呈现近日节律性表达的大豆启动子。
为实现上述目的，本发明对大豆多个功能基因的上游序列(启动子区)进行了大量筛选，本发明发现，gmlcla1基因的上游序列能够响应水分胁迫和脱落酸处理上调基因表达，而且，还能够在水分胁迫和脱落酸处理条件下保持近日节律性表达。本发明还发现选取gmlcla1基因上游不同长度的序列片段，其对于水分胁迫、脱落酸处理的响应以及节律性表达的相位和表达强度明显不同，其中，如seqidno.1所示的启动子可驱动基因在水分胁迫条件下高水平近日节律性表达，表达振幅升高约1倍；驱动目标基因在脱落酸处理后，在清晨时间段表达水平上调约1倍，而在夜间维持低水平表达。该启动子能够驱动目标基因在脱落酸处理或水分胁迫条件下，时间特异性微调基因表达，使得目标基因发挥功能更具有靶向性，降低目标基因过量表达的负面效应。与现有技术中对水分胁迫或脱落酸处理响应十分剧烈的启动子、能够响应水分胁迫和aba的但不具有驱动基因呈现近日节律性表达功能的启动子、以及能够调控基因呈现近日节律性表达，但并不响应水分胁迫或脱落酸处理的启动子相比，本发明提供的启动子gmlcla1的功能具有显著进步。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在调控基因在植物中响应脱落酸处理表达中的应用。
优选地，所述应用为调控基因响应脱落酸处理上调表达。
第二方面，本发明提供启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在调控基因在植物中响应水分胁迫表达中的应用。
优选地，所述应用为调控基因响应水分胁迫上调表达。
第三方面，本发明提供启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在调控基因在植物中响应脱落酸处理调控近日节律表达水平中的应用。
优选地，所述应用为调控基因在植物中响应脱落酸处理近日节律表达水平上调。
第四方面，本发明提供启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在调控基因在植物中响应水分胁迫调控近日节律表达水平中的应用。
优选地，所述应用为调控基因在植物中响应水分胁迫近日节律表达水平上调。
第五方面，本发明提供启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在调控植物响应脱落酸处理或水分胁迫的性状中的应用。
第六方面，本发明提供启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在制备植物响应脱落酸处理或水分胁迫的性状改变的转基因植物中的应用。
本发明所述的植物优选为双子叶植物，更优选为豆科植物，最优选为大豆。
本发明所述的启动子gmlcla1的核苷酸序列如seqidno.1所示。
本发明所述的含有启动子gmlcla1的表达盒可以为在启动子gmlcla1的下游可操作地连接任意目标基因序列得到的表达单元。
本发明所述的含有启动子gmlcla1的载体可以为克隆载体、表达载体、整合载体或转座子等任意本领域已知的载体。
本发明所述的微生物包括但不限于大肠杆菌、农杆菌等。
本发明所述的基因可以为功能基因、功能基因的反义基因或能够干扰功能基因表达的小rna基因。
第七方面，本发明提供一种调控基因在植物中响应脱落酸处理或水分胁迫表达的方法，具体为：将所述基因可操作性地连接于启动子gmlcla1的下游，以启动子gmlcla1驱动所述基因在植物中响应脱落酸处理或水分胁迫上调表达。
具体地，所述方法包括：将所述基因可操作性地连接于启动子gmlcla1的下游，以启动子gmlcla1驱动所述基因的表达；将含有启动子gmlcla1的表达盒或载体导入植物中。
以上所述的方法中，所述植物为优选为双子叶植物，更优选为大豆，所述启动子gmlcla1的核苷酸序列如seqidno.1所示。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供一种能够响应脱落酸处理或水分胁迫并调控基因呈现近日节律性表达的大豆启动子gmlcla1，该启动子的活性受aba激素信号、水分胁迫和生物钟共同调控，具有调控基因在脱落酸处理或水分胁迫条件下近日节律表达显著上调的功能，在植物的水分胁迫响应、植物基因表达调控以及具有优良性状的转基因植物构建和育种中具有较高的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例2中在aba处理条件下，转化ph2gw7δ-gmlcla1:luc的大豆中，luc基因在大豆发状根中节律性表达分析结果，其中mock代表未进行aba处理的对照组。
图2为本发明实施例3中gmlcla1在叶片脱水条件下表达分析结果；取生长6周大豆复叶，离体后置于25℃、光照约80μmol/m2/s、湿度约50％的环境中，分别在0、3、6小时取材。使用实时荧光定量pcr方法分析gmlcla1的表达，结果表明在水分胁迫条件下，gmlcla1表达上调；数据为平均值±标准误，统计学分析方法为student’st-test，***代表p<0.001；其中，control代表未进行水分胁迫处理的对照组，dehydration代表水分胁迫处理组。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，其中，pentr-luc质粒可购自addgene(https://www.addgene.org/17473/)。
实施例1大豆gmlcla1启动子的克隆
利用正向引物5’-cgggatccatgtgttatacaagagaagttgaaccg-3’(seqidno.2)，和反向引物：5’-ggggtacctacaggacgtgagcagctag-3’(seqidno.3)从大豆基因组中pcr扩增获得长度为4034bp的gmlcla1启动子，经测序验证，gmlcla1启动子的核苷酸序列如seqidno.1所示。为方便后续与载体连接，pcr产物两端分别带有bamhi和kpni的酶切位点及保护碱基。
上述pcr扩增体系(总体积为20μl)如下：
pcr扩增程序：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃3min，共28个循环；72℃10min。
实施例2利用大豆gmlcla1启动子驱动luc基因的表达
将实施例1中pcr克隆得到gmlcla1启动子的切胶回收产物用bamhi和kpni双酶切。将载体pentr-1a-luc (为便于连接目的片段，pentr-1a-luc 为在质粒pentr-luc的基础上修改多克隆位点得到，参见xieq,etal.(2014)lnk1andlnk2aretranscriptionalcoactivatorsinthearabidopsiscircadianoscillator.plantcell26(7):2843-2857.)用bamhi和kpni双酶切，回收后与gmlcla1启动子的回收片段用t4dna连接酶(thermo公司，货号el0014)连接。获得中间载体pentr-gmlcla1:luc，再利用lr反应试剂盒(thermo公司，货号11791019)将其重组至植物表达载体ph2gw7δ(xieq,etal.(2014)lnk1andlnk2aretranscriptionalcoactivatorsinthearabidopsiscircadianoscillator.plantcell26(7):2843-2857.)，并转化至大肠杆菌dh5α中扩繁，获得重组植物表达载体ph2gw7δ-gmlcla1:luc。
大肠杆菌感受态细胞的转化和载体鉴定的具体操作如下：
(1)配制含抗生素的lb固体培养基；
(2)将超低温冰箱中保存的感受态细胞在冰浴中融化，加入5μl连接产物或lr反应产物，轻轻混匀，冰浴中静置25分钟；
(3)42℃水浴锅中热激90秒，然后立即在冰浴中静置5分钟；
(4)加入500μllb液体培养基，37℃摇床振荡培养1小时(转速为150rpm)；
(5)取100μl细菌恢复培养液均匀涂于筛选培养基上，37℃倒置培养约15小时，挑取3个单菌落摇培；
(6)提取质粒后酶切鉴定并测序。
将鉴定正确的重组植物表达载体ph2gw7δ-gmlcla1:luc转化发根农杆菌k599，得到阳性转化发根农杆菌k599。
利用发根农杆菌介导的转化方法，将ph2gw7δ-gmlcla1:luc转入大豆ws82，通过生物发光信号筛选获得转化ph2gw7δ-gmlcla1:luc的发状根。
发根农杆菌介导大豆转化的具体方法如下：
(1)取出氯气熏蒸法灭菌12个小时的大豆种子，置于超净工作台吹净剩余氯气后，用无菌的超纯水浸泡约16小时，备用；
(2)挑取带有ph2gw7δ-gmlcla1:luc的发根农杆菌k599单克隆在试管中用液体yep培养基小摇，再转至锥形瓶中摇培至菌液od600约为1.0。4000rpm离心10分钟收集菌体，重悬于转化介质(1/10xgamborgb5盐，30g/l蔗糖，3.9g/lmes，ph5.4，灭菌后加入40mg/l乙酰丁香酮)中；
(3)切下吸涨后大豆的胚根，以下胚轴为外植体，将外植体在重悬菌液中浸入30分钟，完成侵染后在滤纸上吸干浸染液，将侵染后的大豆外植体置于共培养培养基(1/10xgamborgb5盐，30g/l蔗糖，3.9g/lmes，4.25g/l琼脂，ph5.4，灭菌后加入cysteine400mg/l和40mg/l乙酰丁香酮)上避光培养3天；
(4)将共培养后的大豆外植体的下胚轴插入发根诱导培养基(1xgamborgb5盐，30g/l蔗糖，0.59g/lmes，7g/l琼脂，ph5.7，灭菌后加入cefotaxime100mg/l)中，12l/12d条件培养14天诱导发根。
对筛选得到的转化ph2gw7δ-gmlcla1:luc的发状根在25℃、持续光照条件下连续检测luc活性，转化株的luc生物发光检测方法具体如下：
(1)将转化ph2gw7δ-gmlcla1:luc的发状根从外植体上切下，于12.5μm萤火虫荧光素中浸泡1分钟，使用生物发光成像仪检测生物发光；
(2)将筛选出的生物发光信号较强的发状根切为约3cm小段，放入平皿中(每个平皿中放入4个独立的外植体)，培养基中添加0或10μmaba，使用lumicycle在25℃、持续黑暗条件下检测生物发光。生物发光检测结果如图1所示，结果表明，aba处理能够增强gmlcla1启动子在植物根中驱动基因节律性表达的活性，在aba处理条件下，gmlcla1启动子驱动基因的节律性表达水平显著提高，表达振幅升高约1倍，在白天表达水平上调约1倍，而在夜间维持低水平表达。
实施例3大豆gmlcla1在水分胁迫条件下表达上调
取生长6周大豆复叶，在开灯时剪取叶片离体后置于25℃、光照约80μmol/m2/s、湿度约50％的环境中，分别在0、3、6小时取材。提取叶片总rna，利用反转录试剂盒(thermo公司，货号k1622)获得cdna。使用实时荧光定量pcr方法分析gmlcla1的表达，结果表明在水分胁迫条件下，gmlcla1表达上调(图2)。由于gmlcla1节律性表达的峰值在清晨，对照组在开灯后0-6小时间，gmlcla1表达量逐渐降低；而水分胁迫条件下，3小时和6小时的叶片中，gmlcla1表达量升高约1倍。gmlcla1在水分胁迫条件下，白天表达量升高的结果和gmlcla1启动子在aba处理条件下白天活性增强的结果相似。
以上结果表明，gmlcla1启动子可用于植物中驱动目标基因在水分胁迫或aba处理条件下在白天提高表达水平。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>河南大学
<120>启动子gmlcla1在调控基因响应脱落酸处理和水分胁迫中的应用
<130>khp201118728.0
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>4034
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
atgtgttatacaagagaagttgaaccgtttttccccatttcttaaattcatttatggtac60
atatgctttaatttggtgtcttttctttactgttcgttatcttttgacttcttttaagtg120
gaaataatataaactttcttgaagagatatgaattttattgaactaaaaagaattgagag180
aaaaataaattggagtaagaataaagaatttttgaaatcataaagatttttcataatatt240
atttattcataaattattatatatgataaataattaaatatgttactttatgatagttat300
cttaaaagtgataccaaaaataatttttatatagttgatacaagttatatcaatatcgaa360
agtaaaaaaaaaaaatgaagcaaaaagagttacatcaatataacttgtggaaacatacca420
tctttaaaaatatttagacatagttcaaaaaaattataaatattagataaatgatgtaca480
tgttttatttttgttttttatgggcaagtacatgttggatgttataattttatattagga540
attgaaaaaaaaaatcaagaaagtaaaatgtcatggccaggttaaaaagggtcatatata600
gattcgtgcaaaatctaaaaatagagaacaaacatagctcgagcaaattaacaatgaaac660
acatacactaacacacaattataaagagtcacagattcacggtaacaaagaacacgcatt720
aacaatgaaaaatacacattaacaaagagtaaacacactgatatatagcaaacacactta780
ctaactgactaacacacactagtaaatagcaaacataaagtaacaatgacaaactaggag840
caagaatgcatgacacgagaatgtgtcagcattttagcctgagactaattaatggcaact900
gattagaaagtaaatttctacactagttaaattaaaaaccaatctaaagaatttactatg960
atttttttaaatgataagatcgacactcacatttaagattaattggggaaccaatttagg1020
tataaaaaaaaaattctatatcaattttttcattcaactaatctttttttttttctagac1080
ctattttttagtaactacttttgtttgttttttctgagatttatcagcgagccaatgttc1140
catttcaagactagttcctttagccatatagagattagattttgtcaaatccaacaaaat1200
tttctccatattcatgcattattagaaatttaatttctaataatatgcttaaagaatcca1260
attatttatcaacttatcaattgtgttaaaaatatatttttttttaactatcatggttag1320
gacctttgacttttccatgaatcttaaagtattattacaaatttcagatctttggattaa1380
ctataaaactatctcaattttaaatttaatcatatttaaagtttattttcctgtttaaaa1440
gtgtattatatagagctcaatcatccaagtcttccctggcaatcttaacggatattatta1500
tctgagttatgtctattaaattgtgttagaaaaaattgatattaactaatgtaaaatatt1560
caatatcaatattacaaaaatatccacacattacatcaatttttagacaattgatataga1620
cattgaatgtgaaaaatatattttaaactagtgacgtattcgccgtgtgtgtgtttttaa1680
ttcaaatctttaggacaagttattattcatttgttatttgtgattttatgttgtgccaaa1740
aaatattccactatcaggctttattaagttgtggaggataaaaatattcttttgtcatta1800
aacagatgaaaaaaaaagagcgaaacaaagttataattgtgtattcaactgaaaaaagta1860
aaaaatataattatattaaataactgttacatctttttaatataaaataactgtgactaa1920
gcggtaaaaaagataaaaggattgtttgaaagctttctcctgtgtttcattttctcttat1980
tttagaagaaaaaccttttatgtaaattctactatatttatttttcctttcttttttttt2040
ccagccaaaataaaatgttcattttttttctacatcagctttaatttgctcttttaaatt2100
tttacctgtcaaaatgatgtatgaatattctttaggacttttcttcctaggggatctggt2160
taattattttataaaggaatttttttcctaaatttaatatataaacacaatacatgtata2220
tatttaaaatttgtttgttgtaccaaaaaaaaatatttgtattatttttaaaataaaata2280
aaactacacttttaattattttcctaagacaaaatatataaaacagtaaaacatggcatg2340
atgataaggataattaacccatataagaaaaatgttcaaagtagaaaacaaaagcactgc2400
aagaaccgtacaggttcgcacctgataacagtgtaactcacattctcactcactaaaaac2460
gcacacgtgtccaccgcacgcacgaatggaacacccaccaataaacccccaaagaattgc2520
cacgtgtcggtgaccggaaagtgagtggccacgctgggcgaatatcccaccactaagccc2580
aaatggcccactcgttgcgcaactgggtgaccgggtacagccggtcgacctcgccacgtc2640
acctgcgggcccccaccgtcacaagctggcgacgcttttacggacctaaaacctcagcca2700
tgatgaagtttgtggatgagattcgaggaggaaaaaaaaagattaaaagcttaaagcctc2760
atcccaaaaaaataaataaaaaaagaaagtgataaaaaaaaaataggaaaagtgcaaagg2820
taagcatcagcaccaatagccagtaaatttgcgccacttgtcgcgatcgtacacgccaaa2880
gcttctccgtctcaaaaataaaaaataacgagtcgttaatttccgaaacaaaaaaaatat2940
aaatccacacgaaattgtagtggctgagattgctcctcgcgcttaaacactttcgggcga3000
gtgtgtgtgtagcagtttctggttctgtttttggtttcgtttcagcaaaacctctcttct3060
tcttctgattgattccacctcgcgatttttcgattttcgtttgttttcttctttttcggt3120
ttctgatctgaactcgattcgattcgctattgccggaaaatgagtcctccggcaagtgtc3180
cggtgatgatcgctccctcgagaggttgttgaggttatcgttgttgttcttcgaagtcat3240
ggtttcgatctgaggtattcgttttcctttttatattttttagtttaatttaatttgttc3300
tgtttggtttccgagaaaattgaagcgaactgcgaacggatttacctcatctggatttgg3360
atgtaacaggtgctgtcagtgctcacagcgcgacgctgttgagttgaaatttcgctggtt3420
ttgagttgctttgtgactaattttttttctcggcaaccaaacaggaggattcaaaatttg3480
cactgattaattagtaaagtatatttgtgaaagtgaagatagaaatggttgttgttgttg3540
aatttgtgatgtgatttttcttgtttctgtactaattgtagtttctctctctcttttttc3600
gcgtttgaaaggttttggcgctctcgagttcgttttggtgaggattctgattaaggaaaa3660
ttttcttttattcattcggaggagaagcgtctcaaactctctctctttctccctcggttg3720
tttatttttgaaattttattttcctttttcttctatgtagtactgttttacgtgtgacat3780
gtgaattggaatgcttattccagcttatacaaaacagagacggatctcttcctattgttc3840
tcgctttgtttcttttgcagtagcatcatcatcatcaccataccttgttcagattctgct3900
cactttcaccacaacggctttactatttaccgcgtttcgttttcgtgtcaccgcaaataa3960
tgaaaggaggtgttccctgtatccactcctcgtcagggaagatctgaagcagtgctagct4020
gctcacgtcctgta4034
<210>2
<211>35
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
cgggatccatgtgttatacaagagaagttgaaccg35
<210>3
<211>28
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ggggtacctacaggacgtgagcagctag28
1.启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在调控基因在植物中响应脱落酸处理表达中的应用。
2.启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在调控基因在植物中响应水分胁迫表达中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述应用为调控基因响应脱落酸处理或水分胁迫上调表达。
4.启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在调控基因在植物中响应脱落酸处理调控近日节律表达水平中的应用。
5.启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在调控基因在植物中响应水分胁迫调控近日节律表达水平中的应用。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述应用为调控基因在植物中响应脱落酸处理或水分胁迫近日节律表达水平上调。
7.启动子gmlcla1或含有所述启动子gmlcla1的表达盒、载体或微生物在调控植物响应脱落酸处理或水分胁迫的性状中的应用。
8.根据权利要求1～7任一项所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物，优选为豆科植物，更优选为大豆。
9.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于，所述启动子gmlcla1的核苷酸序列如seqidno.1所示。
10.一种调控基因在植物中响应脱落酸处理或水分胁迫表达的方法，其特征在于，将所述基因可操作性地连接于启动子gmlcla1的下游，以启动子gmlcla1驱动所述基因在植物中响应脱落酸处理或水分胁迫上调表达；
优选地，所述植物为双子叶植物，更优选为大豆，所述启动子gmlcla1的核苷酸序列如seqidno.1所示。
技术总结