本发明属于基因工程技术领域，涉及与棉花色素腺体表达相关启动子，特别是指一种棉花启动子pcgp1及其应用。
背景技术：
启动子是一段位于结构基因5’端上游区的dna序列，能活化rna聚合酶使之与模板dna准确的结合并具有转录起始的特异性。启动子是调控基因表达的重要顺式作用元件，主要由核心启动子区及其上游启动子元件组成。位于转录起始位点上游-20～-30bp处的tatabox为启动子核心元件，是富含at的保守序列区，其作用是使转录精确地开始，是绝大多数植物启动子正确表达所必需的。tatabox上游的保守序列称为启动子上游元件，包括上游-70～-80bp处的caatbox和-80～-110bp附近的gcbox等一般上游启动子元件及其他特殊的上游元件。上游启动子元件调控基因的表达部位、表达时期及表达强度（焦勇等，2019；bucsenezetal.,2012）。
色素腺体是棉属植物特有的一种溶生腔结构，这些溶生腔结构中含有大量的次生代谢物，表现为黑色的点状结构（fryxellpa,1965）。色素腺体的发育包括细胞溶生过程和程序性细胞死亡过程。色素腺体起源于表皮下的一簇腺体原始细胞，腺体原始细胞通常含有高密度的细胞质和大核仁为特征。成熟的腺体由溶原性空腔组成，由中央原始细胞降解后形成一个大的溶生腔，周围被多层厚壁细胞包围（周亚福，2011；liuetal.,2010）。色素腺体溶生腔中储存的大量次生代谢物，这些次生代谢物保护植物免受病原体、昆虫和食草动物的侵害，而且往往具有很高的药用价值。其中，棉酚是色素腺体中研究最多的次生代谢物。棉酚是一种黄色多酚羟基双萘醛类化合物，主要存在于棉花的根、茎、叶、种子和花瓣内，棉籽仁中含量最高（史冬平和曲健木，2006）。棉酚具有抑制精子发生和精子活动的作用。可作为一种有效的男用避孕药。棉酚还被用于治疗妇科疾病，包括月经过多或失调、子宫肌瘤、子宫内膜异位症等。棉酚在抗肿瘤方面也有作用，体外实验表明棉酚对起源于淋巴及粒细胞、肾上腺、乳腺、宫颈、直肠和中枢神经系统的多种肿瘤细胞株均有明显的增殖抑制活性（liuetal.,2001;shailendrakapoor,2013）。色素腺体是棉属植物次生代谢物的主要贮藏场所，可以作为棉酚等物质的生物容器。研究色素腺体特异启动子对棉花育种、棉酚等物质的积累和应用具有重要意义。
技术实现要素：
本发明提出一种棉花启动子pcgp1及其应用，解决了启动目的基因在棉花色素腺体细胞中特异表达的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种棉花启动子pcgp1，所述pcgp1启动子的核苷酸序列如seqidno.1所示。
所述pcgp1启动子的核苷酸序列为与seqidno.1所示的序列同源性大于70%的核苷酸序列或与seqidno.1所示的序列的功能相当的亚片段。
上述棉花启动子pcgp1在作为探针，从基因组文库中筛选到核苷酸序列如seqidno.1所示的启动子或其同源的启动子中的应用。
上述棉花启动子pcgp1在驱动基因转录方面的应用。
上述棉花启动子pcgp1在调控基因在棉花色素腺体细胞中特异表达的应用。
上述应用，步骤为：将棉花启动子pcgp1目标基因连接后转入植物细胞中，构建转基因植物。
本发明具有以下有益效果：
本发明为分子育种提供了一种新方法。这种方法包括将pcgp1启动子与目标基因连接后转入棉花中，通过该启动子在腺体细胞中驱动基因的表达，提高色素腺体次生代谢物的合成、积累和提取效率。将克隆的启动子连接目标基因转入植物，可以避免植物过量表达目标基因造成的不利影响。
本发明能够进一步提供或利用上述dna片段获得转基因植株和相应的种子，以及用本发明的启动子或者基于该启动子的重组体转化的植株或者由这类植株获得的种子。可以用有性杂交的方式将本发明的启动子转入其它的植株。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为是本发明实施例中pcgp1启动子pcr扩增结果图。
图2为棉花pcgp1启动子的基本结构， 1是预测的转录起始位点；预测的tata框是rna聚合酶和dna单链的结合部位；预测的caat框调控转录起始频率。
图3为pcgp1启动子与gus（β-葡萄糖醛酸酶）报告基因连接，构建到带有卡那霉素抗性的质粒中。
图4为遗传转化植株中gus的表达模式说明pcgp1启动子启动基因在色素腺体细胞中特异表达。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所涉及的taqdnapolymerase、phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase购于南京诺唯赞生物科技有限公司；cycle-purekit购于普洛麦格（北京）生物技术有限公司；peasy-bluntsimplecloningkit购于北京全式金生物技术有限公司；植物基因组dna提取试剂盒、快速质粒小提试剂盒购于天根生化科技（北京）有限公司；植株转化、组织培养相关培养基，x-gluc染色液购自北京酷来搏科技有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成，经page方法纯化，使用时稀释到10μm；测序由上海生工生物工程有限公司完成。
实施例1：分离克隆pcgp1启动子
1.棉花dna模板的获得
选取状态良好的陆地棉tm-1种子，在不损伤胚的前提下，剪去其种壳尖端，使胚根露出，将其浸泡在水中4h-6h，之后用湿纱布包裹浸泡过的种子，放置在30℃生化培养箱中过夜萌发，取下胚轴长度一致的种子播种在营养土中，表面覆盖一层地膜进行保湿，放置在光照培养箱中，温度25℃，湿度70%，光照16h，黑暗8h培养，待种子露出子叶后，撤掉地膜。
取生长5天左右的子叶使用植物基因组dna提取试剂盒提取dna。取棉花幼嫩子叶约100mg，液氮速冻，放入研钵中碾碎充分之后按照试剂盒说明书进行dna提取。dna浓度用nanodrop2000c紫外-可见光分光光度计（tbermofisber，美国）测定，dna纯度用1.2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳（150v，15min）进行检测。
2.pcgp1启动子的克隆
通过扩增获得陆地棉tm-1覆盖全长pcgp1启动子序列的片段，pcr体系为：
其中所用扩增引物序列为：cgp1-pf1：5’-gaaataagggtaaaaagggaaaacg-3’，cgp1-pr1：5’-atttatagcttagaatctcattggg-3’。模板为实施例一提取的棉花dna，pcr的程序为95℃3min；95℃10s，58℃30s，72℃40s，35个循环；然后72℃10min，16℃保存。pcr产物用琼脂糖凝胶电泳检测（图1），之后用cycle-purekit纯化回收pcr产物，然后用peasy-bluntsimplecloningkit将pcr产物连入t载体，转化大肠杆菌dh5α，利用taqdnapolymerase做pcr检测，挑选阳性克隆送上海生工生物有限公司测序。经过序列比对，测序正确的克隆利用快速质粒小提试剂盒提取质粒，并将其被命名为pcgp1，序列信息见seqidno:1。
3.pcgp1启动子的结构分析
采用在线生物信息学软件plantcare对所获得的dna片段进行启动子结构和顺式元件预测。分析结果如图2所示，表明该片段包含完整的启动子结构，包括caat框、tata框、转录起始位点和若干预测的启动子顺式元件。
实施例2：pcgp1驱动gus表达的遗传转化载体构建
通过pcr扩增得到带接头的启动子片段，pcr体系为：
其中所用扩增引物序列为：cgp1-paf1：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttgaaataagggtaaaaagggaaaacg-3’，cgp1-par1：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtatttatagcttagaatctcattggg-3’，下划线核苷酸序列是bp反应的接头序列。其中模板为实施例一中含pcgp1dna片段的t载体，pcr的程序为95℃3min；95℃10s，58℃30s，72℃40s，28个循环；然后72℃10min，16℃保存。对pcr产物进行纯化回收，利用gateway方法将pcgp1连入入门载体pdnor221上，具体操作为：pcr产物0.5μl；pdnor221vector0.5μl；bp酶0.5μl；te（8.0）buffer1μl，25℃反应1.5h。将连接产物转化大肠杆菌dh5α，经pcr检测，挑选阳性克隆送上海生工生物有限公司测序，序列比对后正确的克隆提质粒。配制lr反应体系：bp质粒0.5μl；pgwb433载体0.5μl；lr酶0.5μl；10×te（8.0）buffer1μl，25℃反应1.5h。将连接产物转化大肠杆菌dh5α，经pcr检测，挑选阳性克隆提质粒。通过电击转化将lr质粒转入农杆菌eha05中，经pcr检测，挑选阳性克隆进行混合样保存备用。将正确的质粒和菌液命名为pcgp1::gus，质粒图谱如图3所示。
实施例3：pcgp1启动子的功能验证
1.转基因材料创制
利用农杆菌介导的棉花下胚轴转化方法将eha105农杆菌携带的pcgp1::gus导入棉花中（jin等，2006）。将需要转化的棉花脱壳，浸泡于0.1%的升汞溶液8min；去除升汞之后用无菌水冲洗4次，每次5min。消毒后的种子放置于在无菌苗萌发培养基（1/2ms）暗培养7天。将活化好的携带pcgp1::gus质粒的eha105农杆菌用mgl培养基稀释至0.6的od值；取生长7天之后的棉花无菌苗下胚轴切成0.6cm段放置到od=0.6的农杆菌中至下胚轴组织完全淹没；轻轻摇动7min，滤去菌液，再用无菌滤纸把植物组织表面的多余菌液吸干，然后薄薄的平铺于msb培养基上。避光共培养72h后将下胚轴组织置于含卡那霉素的诱导培养基上诱导胚性愈伤组织。每30天继代1次至愈伤组织发生胚分化，形成转基因棉花。本发明共获得独立转基因系13个。
2.pcgp1启动子驱动的腺体细胞特异表达gus
在t0代的阳性转基因植株中，对不同组织的棉花材料进行gus染色实验。具体操作如下：迅速将棉花组织加入预冷的80%（v/v）丙酮固定30min，在去除丙酮后用预冷的ddh2o冲洗后转移到含有反应底物x-gluc的染色液中，于37℃培养箱中放置8~16小时至完全显色，随后在42℃条件下加入75%酒精使样品充分脱色，最后用faa组织固定液（100ml配方为：90ml70%乙醇、5ml冰醋酸、5ml甲醛）进行材料固定。用体式显微镜（leicamzflⅲ）观察并照相脱色后染色样品。然后将染色的组织切成厚度8μm的切片，再用光学显微镜观察和拍摄（olympusix73，japan）。组织切片如图4显示，gus染色集中在色素腺体中央溶生腔周围的厚壁细胞中。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>河南大学
<120>一种棉花启动子pcgp1及其应用
<141>2021-01-25
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>2
<211>1862
<212>dna
<213>棉属(gossypiumspp)
<400>2
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at1862
1.一种棉花启动子pcgp1，其特征在于，所述pcgp1启动子的核苷酸序列如seqidno.1所示。
2.根据权利要求1所述的棉花启动子pcgp1，其特征在于，所述pcgp1启动子的核苷酸序列为与seqidno.1所示的序列同源性大于70%的核苷酸序列或与seqidno.1所示的序列的功能相当的亚片段。
3.权利要求1或2所示的棉花启动子pcgp1在作为探针，从基因组文库中筛选到核苷酸序列如seqidno.1所示的启动子或其同源的启动子中的应用。
4.权利要求1或2所示的棉花启动子pcgp1在驱动基因转录方面的应用。
5.权利要求1或2所示的棉花启动子pcgp1在调控基因在棉花色素腺体细胞中特异表达的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤为：将棉花启动子pcgp1目标基因连接后转入植物细胞中，构建转基因植物。
技术总结