本发明属于医学生物化学领域，具体涉及一种nova1促smn2外显子7列入的验证方法及其应用。
背景技术：
：研究表明sma是由于第五号染色体上运动神经元生存1（survivalofmotorneuron1,smn1）基因发生点突变或缺失导致该基因不能表达有功能的全长smn蛋白。和动物不同，人类因为染色体5q13区的倒转复制（invertedduplication）产生了一个smn1的平行同源基因称作smn2；而两个基因包含9个外显子（1、2a、2b、3、4、5、6、7、8），编码完全相同294个氨基酸的smn蛋白。两者的关键不同之处在于外显子7第6位核苷酸由smn1中的c转变为smn2中的t（c6t），虽然没有造成翻译中氨基酸的改变，却严重影响了该外显子列入(exoninclusion)。smn2的成熟转录产物中约有90%不包含外显子7，而没有外显子7的蛋白（称作smn∆7）基本没有功能且极不稳定。smn2表达的少量全长smn蛋白虽然不足以补偿smn1基因的缺陷，却对病人的生存至关重要。随着生物技术的飞速发展，crispr/cas9基因编辑技术及基因治疗已成为研究热点。近年来国际权威期刊《科学》杂志（science），频繁报道crispr/cas9基因编辑技术应用于型肌营养不良（duchennemusculardystrophy,dmd）基因治疗的论文，以dmd动物模型-mdx小鼠为研究对象，进行动物体内试验。借助aav载体运载基因编辑的crispr/cas9进入体内细胞，做删除式基因编辑。删除了含有无义突变的23号外显子，形成永久性不含外显子23的dmd基因。治疗后肌肉病理得到改善，肌肉细胞膜上重新出现dystrophin蛋白，小鼠肌肉力量得到增加。但是该项技术在sma小鼠的治疗中尚没有相关研究报道，急需要开展新方法的探索研究。基因表达rna的异常剪接常常导致人类疾病，研究表明，超过60％的人类致病突变影响剪接，与基因突变造成的rna剪接位点的错误选择有关，而不是直接影响编码序列。所有遗传性疾病中有三分之一可能具有剪接成分。在人类体内表达smn蛋白有两个基因：smn1和smn2，但是起主要作用的smn1基因突变失去功能后，由于smn2基因外显子7大部分被剪切而仅有少量smn全长基因，少量smn有功能蛋白，目前最有效的方法是aso反义寡核苷酸，靶向互补内含子7第10-27序列，比如商业化的spinraza，靶向封闭内含子7剪接沉默子iss序列，促进外显子7列入比例，但是aso半衰期较短，必须持续性给药。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种nova1促smn2外显子7列入的验证方法及其应用，研究证实nova1是通过结合外显子7靶向序列促进smn2外显子7列入，并显著提升smn蛋白的表达，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达，不用持续性给药。为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种nova1促smn2外显子7列入的验证方法，包括如下步骤：（1）通过rt-pcr及酶切电泳分析smn2全长基因在不同组织中的表达；（2）寻找smn2全长基因在中枢系统中高表达的机制；（3）验证nova1是促进smn2全长基因表达重要的剪接因子；（4）通过体外细胞实验证明敲降和过表达nova1显著抑制和促进smn2外显子7列入；（5）构建smn2外显子7中nova1靶向结合位点突变以及rnapulldown实验，证实nova1是通过结合外显子7靶向序列促进smn2外显子7列入，并显著提升smn蛋白的表达；（6）构建小鼠模型：构建lenti-virusnova1过表达病毒，皮下注射sma刚出生小鼠，与fastgreen组进行比较，结果显示：nova1治疗脊髓、脑、肌肉smn2列入比例均明显上升，其中大脑中smn2外显子7列入上调具有显著差异。其中，步骤（1）的具体步骤为：smai型对照和i型小鼠冰上麻醉后，取出相应组织迅速入液氮，组织匀浆后trizol法提rna。rna逆转录，5×rtbuffer4μl；dntpmix（10nmeach）1μl；oligo（dt）18(50μm)1μl；rnaseinhibitor(40u/µl)1μl；reversetranscriptase(200u/μl)1μl；rna1μg；rnase-freeddh2oto20µl；pcr反应体系，2×taqmastermix12.5μl；引物e6-fcy5-ataattcccccaccacctcc1μl；引物e8-467rttgccacatacgcctcacatac1μl；cdna1μl；ddh2o9.5μlto25µl；半定量扩增了28个循环(94℃30s，55℃30s和72℃25s）；pcr产物用ddei酶进行酶切，并用2％琼脂糖凝胶进行电泳，imagej图像软件进行定量分析，外显子7的列入表示为fl与剪接转录本总量的百分比。其中，步骤（2）的具体步骤为：smai型小鼠中smn2外显子7列入的组织间差异，推测存在某些剪接因子，其在不同组织中表达具有差异，从而引起smn2外显子7列入差异。三类经典的剪接因子，即hnnrp、sr及nova家族是神经疾病研究密切相关。因此，筛选了hnnrp、sr及nova（引物如表1）家族部分成员共21个基因，检测其在smaⅰ型小鼠中的表达差异，反应体系为2×chamquniversalsybrqpcrmastermix5μl，f0.5μl，r0.5μl，cdna1μl，ddh2o3μl；反应条件为：95℃5min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，45个循环；60℃60s，95℃15s，统计剪接因子在中枢神经和周围非神经组织中的表达差异。其中，步骤（3）的具体步骤为：在smai型小鼠p1、p4及p7各时间点，提取rna及蛋白后，采用qpcr及westernblot方法分别检测nova1和smn全长基因及蛋白水平表达变化。结果显示在p1、p4及p7阶段，smn全长基因和蛋白表达随nova1呈递减趋势。其中，步骤（4）的具体步骤为：在细胞培养6孔板中，种适量密度的u87mg细胞，并添加2ml完全培养基，在细胞培养箱中培养过夜；次日，待细胞汇合达到50%时，分别将0.5μgnova1过表达质粒或5μl20μmnova1sirna与1μgsmn2minigene加入100μlopti-mem中混匀，室温放置5min。同时，将3μlpei加入100μlopti-mem中吹打混匀，室温放置5min；将上述两种混合液加入同一离心管中，轻轻吹打混匀，室温静置20min。弃去6孔板中培养基，加800μl无血清培养基，再均匀加入配置好的转染混合物，十字摇晃混匀后培养；6h后，用2ml新鲜预热的完全培养基换液。36~48h后检测smn2外显子7列入。其中，步骤（2）中，qpcr检测了21个剪接调控基因，发现nova1在中枢即大脑脊髓中高表达。其中，步骤（4）的体外细胞实验中通过靶向沉默nova1和过表达nova1，smn2全长基因和蛋白表达相应下调和上调，差异具有显著性。其中，步骤（5）的具体步骤为：根据nova1能够通过其kh结构域（khdomain）与靶基因mrna前体中的ycay基序（yacymotif；y为嘧啶：y=u或c）结合的特点，预测smn2外显子7第34-37位ucac序列是nova1结合位点，通过定点删除和突变，把ucac删除或突变为uaac后，smn2全长基因显著下调，rnapulldown实验表明该位点ucac为nova1结合基序；进一步分二类突变该ycay基序，其一，改变ycay中y的组合，发现smn2全长基因有所下降，其二，改变ycay中核心结合序列ca，发现smn2全长基因极显著下降，有两个例外推测可能引入新的剪接因子；综上证明：nova1通过结合smn2外显子7第34-37位ucac序列促进外smn2全长基因的表达，其中ucac序列中ca最为重要。本发明还提供一种nova1促smn2外显子7列入的应用，用于制备延长脊髓型肌肉萎缩症小鼠存活时间的药物。本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明首次发现nova1过表达质粒，可以靶向结合smn2外显子7第34-37位tcac序列，显著上调smn2促进外显子7列入，并促进smn蛋白的表达上升，包装的过表达nova1病毒在sma小鼠体内显著延长了小鼠的生存时间，并促进体内smn2外显子7列入比例，而且该重组质粒可以整合入宿主细胞基因组内，在细胞内持续性表达，一次性转染即可，并且过表达病毒可以整合到基因组中持续表达。附图说明图1为本发明中smn2外显子7在type1cnotrol和type1出生4天体内组织中的列入比例；图2为本发明中不同剪接因子在type1cnotrol和type1出生4天体内不同组织中的表达热图；图3为本发明中nova1和smn蛋白表达相关与运动神经元共定位图；图4为本发明中nova1与smn2外显子7列入的表达关系图；图5为本发明中nova1在smn2外显子7剪接结合靶点验证结果图；图6为本发明中lenti-virusnova1过表达病毒在typei小鼠体内实验结果图。具体实施方式为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。本发明提供一种nova1促smn2外显子7列入的验证方法，包括如下步骤：（1）通过rt-pcr及酶切电泳分析smn2全长基因在不同组织中的表达；具体步骤为：smai型对照和i型小鼠冰上麻醉后，取出相应组织迅速入液氮，组织匀浆后trizol法提rna。rna逆转录，5×rtbuffer4μl；dntpmix（10nmeach）1μl；oligo（dt）18(50μm)1μl；rnaseinhibitor(40u/µl)1μl；reversetranscriptase(200u/μl)1μl；rna1μg；rnase-freeddh2oto20µl；pcr反应体系，2×taqmastermix12.5μl；引物e6-fcy5-ataattcccccaccacctcc1μl；引物e8-467rttgccacatacgcctcacatac1μl；cdna1μl；ddh2o9.5μlto25µl；半定量扩增了28个循环(94℃30s，55℃30s和72℃25s）；pcr产物用ddei酶进行酶切，并用2％琼脂糖凝胶进行电泳，imagej图像软件进行定量分析，外显子7的列入表示为fl与剪接转录本总量的百分比。（2）寻找smn2全长基因在中枢系统中高表达的机制，qpcr检测了21个剪接调控基因，发现nova1在中枢即大脑脊髓中高表达；具体步骤为：smai型小鼠中smn2外显子7列入的组织间差异，推测存在某些剪接因子，其在不同组织中表达具有差异，从而引起smn2外显子7列入差异。三类经典的剪接因子，即hnnrp、sr及nova家族是神经疾病研究密切相关。因此，筛选了hnnrp、sr及nova（引物如表1）家族部分成员共21个基因，检测其在smaⅰ型小鼠中的表达差异，反应体系为2×chamquniversalsybrqpcrmastermix5μl，f0.5μl，r0.5μl，cdna1μl，ddh2o3μl；反应条件为：95℃5min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，45个循环；60℃60s，95℃15s，统计剪接因子在中枢神经和周围非神经组织中的表达差异。表1namef(5’-3’)r(5’-3’)mgapdhccgtagacaaaatggtgaaggtcgtgagtggagtcatactggaamhnrnpkagaagaaaccttccccaacacctgcgcaattcaaccatctcatcmhnrnplagtggaagctgaccttgtggaagagcacgtcttcaaactctaccagmhnrnpllagctgaccttgtggaggcacaggcacatctgcagcaaatgmhnrnpuagtctcctcagccacctgttgagcactcagacggtctctcgmhnrnpdatcgacgccagtaagaacgagtgtggtgtcccagctaaggmhnrnph3tgccatttggttgcagcaaagaggcctcccctgtgcttcmhnrnpmaccttttgatgtgaaatggcagtcagagctccacgtatgttacctcmhnrnph2agccgtttgagggaagaagaagaccctgttagagtttcttccaggmhnrnpftcgggtggagtttgagttcgtaagaccaccacagatgccttctgmsrsf10acgtctctgttcgtcaggaacgaccataacgaccaaattcccgmsrsf1ttcgccttcgttgagttcgagcggtagccgtcgtagtcgtagmsrpk1tctagggtctgacgatgacgagagtgtccccagcccaattttcmsrsf3atttgaggatccccgagatgctcttttcaccattcgacagttccmsrsf6tgccgtgtacgagctcaacagagttctccgactgctgtatccmsrsf2agcccacccaagtctccagaagatggaccgatggactgagtttgmsrsf4atcctggaggtggatctgaagacacaggtctttgccgttcagmsrsf5actcagagagcgcagttgatttgtctccctcgctgctggatttagmsrsf7attccaagctagagccgagtacactctcctttaccagcaccagmsrsf9agatcgagctcaagaaccggacactggccataatcgtaaccgmnova1actggagccactatcaagctgatccatgaactgcgttcagcgmnova2agacaggagccaccatcaagagacaggagccaccatcaaghgapdhgaaggtcggagtcaacggattggaagatggtgatgggatthsmn1/2accaccccacttactatcatgcgaatgtgagcaccttccttctthnova1gccatcttccccaactaccatgctccattacagccttcaca（3）验证nova1是促进smn2全长基因表达重要的剪接因子；具体步骤为：在smai型小鼠p1、p4及p7各时间点，提取rna及蛋白后，采用qpcr及westernblot方法分别检测nova1和smn全长基因及蛋白水平表达变化。结果显示在p1、p4及p7阶段，smn全长基因和蛋白表达随nova1呈递减趋势。（4）在体外细胞实验中，通过靶向沉默nova1和过表达nova1，smn2全长基因和蛋白表达相应下调和上调，差异具有显著性，进一步表明nova1促进smn2全长基因和蛋白表达表达，敲降和过表达nova1显著抑制和促进smn2外显子7列入；具体步骤为：在细胞培养6孔板中，种适量密度的u87mg细胞，并添加2ml完全培养基，在细胞培养箱中培养过夜；次日，待细胞汇合达到50%时，分别将0.5μgnova1过表达质粒或5μl20μmnova1sirna与1μgsmn2minigene加入100μlopti-mem中混匀，室温放置5min。同时，将3μlpei加入100μlopti-mem中吹打混匀，室温放置5min；将上述两种混合液加入同一离心管中，轻轻吹打混匀，室温静置20min。弃去6孔板中培养基，加800μl无血清培养基，再均匀加入配置好的转染混合物，十字摇晃混匀后培养；6h后，用2ml新鲜预热的完全培养基换液。36~48h后检测smn2外显子7列入。（5）构建smn2外显子7中nova1靶向结合位点突变以及rnapulldown实验，证实nova1是通过结合外显子7靶向序列促进smn2外显子7列入，并显著提升smn蛋白的表达；具体步骤为：根据nova1靶向结合ycay基序（y代表嘧啶）特点，预测smn2外显子7第34-37位ucac序列是nova1结合位点，通过定点删除和突变，把ucac删除或突变为uaac后，smn2全长基因显著下调，rnapulldown实验表明该位点ucac为nova1结合基序；进一步分二类突变该ycay基序，其一，改变ycay中y的组合，发现smn2全长基因有所下降，其二，改变ycay中核心结合序列ca，发现smn2全长基因极显著下降，有两个例外推测可能引入新的剪接因子；综上证明：nova1通过结合smn2外显子7第34-37位ucac序列促进外smn2全长基因的表达，其中ucac序列中ca最为重要。（6）构建小鼠模型：构建lenti-virusnova1过表达病毒，皮下注射sma刚出生小鼠，与fastgreen组进行比较，结果显示：nova1治疗脊髓、脑、肌肉smn2列入比例均明显上升，其中大脑中smn2外显子7列入上调具有显著差异。本发明还提供一种nova1促smn2外显子7列入的应用，用于制备延长脊髓型肌肉萎缩症小鼠存活时间的药物。下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案。脊髓型肌肉萎缩症smn1基因突变或缺失失去功能，仅有的同源基因smn2是治疗的靶点，通过rt-pcr及酶切电泳分析，smn2全长基因在typeicontrol和typei小鼠在不同组织中的表达，发现在中枢即大脑和脊髓高表达，差异有统计学意义如图1所示，其中，图1a为在type1cnotrol和type1小鼠不同组织中smn2外显子7列入电泳图，图1b为图1a的电泳图列入比例统计，“*”表示与liver组相比p＜0.05。因此，smn2全长基因表达差异具有组织特异性，为此，寻找smn2全长基因在中枢系统中高表达的机制，qpcr（实时荧光定量核酸扩增检测系统）检测了21个剪接调控基因，发现nova1在中枢即大脑脊髓中高表达，如图2所示，其中，图2a和图2b分别为type1cnotrol和type1小鼠不同组织中剪接因子的qpcr表达热图，均以liver组为对照，计算2-δδ值，其中nova1在中枢中表达最高。随着疾病发展进程p1、p4、p7nova1和smn蛋白表达具有协同性（图3a-f），nova1在脊髓前角运动神经元中nova1表达（图3g），推测nova1与脊髓性肌肉萎缩小鼠脊髓前角运动神经元退行性病变密切相关。其中，图3a表示nova1基因表达在sma小鼠疾病发生过程表达逐渐下调；图3b和图3c表示nova1蛋白也逐渐下调；图3d和图3e表示smn蛋白也逐渐下调；图3f表示smn2表达全长基因也下调；图3g表示nova1和运动神经元chat表达共定位；图3h表示尼氏染色显示sma小鼠疾病发展过程中运动神经元逐渐空泡化、数量减少、凋亡。在体外细胞实验中，通过靶向沉默nova1和过表达nova1，smn2全长基因和蛋白表达相应下调和上调，差异具有显著性（图4a-j）。进一步表明nova1促进smn2全长基因和蛋白表达表达。其中，图4a为nova1敲降效率图；图4b为u87细胞中敲降nova1后smn2剪接琼脂糖凝胶电泳图；图4c为u87细胞中敲降nova1后smn2剪接水平变化统计图；图4d为u87细胞中敲降nova1后smn蛋白水平变化电泳图；图4e为u87细胞中敲降nova1后smn蛋白水平变化统计图；图4f为u87细胞中过表达nova1后nova1mrna水平变化统计图；图4g为u87细胞中过表达nova1后smn2剪接琼脂糖凝胶电泳图；图4h为u87细胞中过表达nova1后smn2剪接水平变化统计图；图4i为u87细胞中过表达nova1后smn蛋白水平变化电泳图；图4j为u87细胞中过表达nova1后smn蛋白水平变化统计图。根据nova1能够通过其kh结构域（khdomain）与靶基因mrna前体中的ycay基序（yacymotif；y为嘧啶：y=u或c）结合的特点，预测smn2外显子7第34-37位ucac序列是nova1结合位点（图5a），通过定点删除和突变，把ucac删除或突变为uaac后，smn2全长基因显著下调（图5b、c），rnapulldown实验表明该位点ucac为nova1结合基序（图5d）。进一步分二类突变该ycay基序，其一，改变ycay中y的组合，发现smn2全长基因有所下降，其二，改变ycay中核心结合序列ca（图5e），发现smn2全长基因极显著下降，有两个例外推测可能引入新的剪接因子（图5f、g、h）。综上，证明，nova1通过结合smn2外显子7第34-37位ucac序列促进外smn2全长基因的表达，其中ucac序列中ca最为重要。其中，图5a为预测smn2外显子7第34-37位ucac基序示意图；图5b为hek293t细胞中突变ucac序列后smn2剪接琼脂糖凝胶电泳图；图5c为hek293t细胞中突变ucac序列后smn2剪接水平变化统计图；图5d为smn2外显子7nova1结合序列ucacpulldown实验结果图；图5e为分二类突变该ycay基序示意图；图5f、g为nova1结合序列分类突变对smn2外显子7列入的影响图；图5h为对f和g图电泳的定量分析图。构建lenti-virusnova1过表达病毒（图6a、b），皮下注射sma刚出生小鼠（图6c），与fastgreen组相比nova1治疗脊髓、脑、肌肉smn2列入比例均明显上升，其中大脑中smn2外显子7列入上调具有显著差异（图6d），与fastgreen组相比nova1治疗组明显延缓了type1小鼠存活最长至15天（图6e）。其中，图6a中，a1为lenti-virusgfp对照，a2-4分别为滴度1×109的lenti-virusnova1体积为5ul、10ul、20ul；图6b为a图qpcr检测统计图，“***”表示与对照组相比，p＜0.0001；图6c为小动物活体成像拍摄小鼠皮下注射荧光图；图6c中，c1为fastgreen注射对照组，c2-4为颈背部皮下注射lenti-virusnova12ul、4ul、8ul；图6d为与fastgreen组相比nova1治疗脊髓、脑、肌肉smn2列入比例上调统计图；图6e为与fastgreen组相比nova1治疗组明显延缓了type1小鼠存活最长至15天，（n=5，n=7，n=8）。本发明的nova1过表达质粒，可以靶向结合smn2外显子7第34-37位tcac序列，显著上调smn2促进外显子7列入，并促进smn蛋白的表达上升，包装的过表达nova1病毒在sma小鼠体内显著延长了小鼠的生存时间，并促进体内smn2外显子7列入比例，而且该重组质粒可以整合入宿主细胞基因组内，在细胞内持续性表达，一次性转染即可，并且过表达病毒可以整合到基因组中持续表达。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>南通大学<120>nova1促smn2外显子7列入的验证方法及其应用<141>2020-12-23<160>52<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>1alathralaalathrthrcyscyscyscyscysalacyscysalacys151015cysthrcyscys20<210>2<211>20<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>2thrthrglycyscysalacysalathralacysglycyscysthrcys151015alacysalathr20<210>3<211>22<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>3cyscysglythralaglyalacysalaalaalaalathrglyglythr151015glyalaalaglyglythr20<210>4<211>22<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>4cysglythrglyalaglythrglyglyalaglythrcysalathrala151015cysthrglyglyalaala20<210>5<211>22<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>5alaglyalaalaglyalaalaalacyscysthrthrcyscyscyscys151015alaalacysalacyscys20<210>6<211>22<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>6thrglycysglycysalaalathrthrcysalaalacyscysalathr151015cysthrcysalathrcys20<210>7<211>23<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>7alaglythrglyglyalaalaglycysthrglyalacyscysthrthr151015glythrglyglyalaalagly20<210>8<211>23<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>8alaglycysalacysglythrcysthrthrcysalaalaalacysthr151015cysthralacyscysalagly20<210>9<211>20<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>9alaglycysthrglyalacyscysthrthrglythrglyglyalagly151015glycysalacys20<210>10<211>20<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>10alaglyglycysalacysalathrcysthrglycysalaglycysala151015alaalathrgly20<210>11<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>11alaglythrcysthrcyscysthrcysalaglycyscysalacyscys151015thrglythrthrgly20<210>12<211>20<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>12alaglycysalacysthrcysalaglyalacysglyglythrcysthr151015cysthrcysgly20<210>13<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>13alathrcysglyalacysglycyscysalaglythralaalaglyala151015alacysglyalagly20<210>14<211>19<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>14thrglythrglyglythrglythrcyscyscysalaglycysthrala151015alaglygly<210>15<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>15thrglycyscysalathrthrthrglyglythrthrglycysalagly151015cysalaalaalagly20<210>16<211>18<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>16alaglyglycyscysthrcyscyscyscysthrglythrglycysthr151015thrcys<210>17<211>24<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>17alacyscysthrthrthrthrglyalathrglythrglyalaalaala151015thrglyglycysalaglythrcys20<210>18<211>22<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>18alaglyalaglycysthrcyscysalacysglythralathrglythr151015thralacyscysthrcys20<210>19<211>22<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>19alaglycyscysglythrthrthrglyalaglyglyglyalaalagly151015alaalaglyalaalagly20<210>20<211>23<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>20alacyscyscysthrglythrthralaglyalaglythrthrthrcys151015thrthrcyscysalaglygly20<210>21<211>24<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>21thrcysglyglyglythrglyglyalaglythrthrthrglyalagly151015thrthrcysglythralaalagly20<210>22<211>20<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>22alacyscysalacyscysalacysalaglyalathrglycyscysthr151015thrcysthrgly20<210>23<211>22<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>23alacysglythrcysthrcysthrglythrthrcysglythrcysala151015glyglyalaalacysgly20<210>24<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>24alacyscysalathralaalacysglyalacyscysalaalaalathr151015thrcyscyscysgly20<210>25<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>25thrthrcysglycyscysthrthrcysglythrthrglyalaglythr151015thrcysglyalagly20<210>26<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>26cysglyglythralaglycyscysglythrcysglythralaglythr151015cysglythralagly20<210>27<211>22<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>27thrcysthralaglyglyglythrcysthrglyalacysglyalathr151015glyalacysglyalagly20<210>28<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>28alaglythrglythrcyscyscyscysalaglycyscyscysalaala151015thrthrthrthrcys20<210>29<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>29alathrthrthrglyalaglyglyalathrcyscyscyscysglyala151015glyalathrglycys20<210>30<211>23<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>30thrcysthrthrthrthrcysalacyscysalathrthrcysglyala151015cysalaglythrthrcyscys20<210>31<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>31thrglycyscysglythrglythralacysglyalaglycysthrcys151015alaalacysalagly20<210>32<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>32alaglythrthrcysthrcyscysglyalacysthrglycysthrgly151015thralathrcyscys20<210>33<211>22<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>33alaglycyscyscysalacyscyscysalaalaglythrcysthrcys151015cysalaglyalaalagly20<210>34<211>22<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>34alathrglyglyalacyscysglyalathrglyglyalacysthrgly151015alaglythrthrthrgly20<210>35<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>35alathrcyscysthrglyglyalaglyglythrglyglyalathrcys151015thrglyalaalagly20<210>36<211>21<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>36alacysalacysalaglyglythrcysthrthrthrglycyscysgly151015thrthrcysalagly20<210>37<211>23<212>prt<213>人工合成(artificialsynthesis)<400>37alacysthrcysalaglyalaglyalaglycysglycysalaglythr151015thrglyalathrthrthrgly20<210>38<211>22<21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2 3
技术特征：1.一种nova1促smn2外显子7列入的验证方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）通过rt-pcr及酶切电泳分析smn2全长基因在不同组织中的表达；
（2）寻找smn2全长基因在中枢系统中高表达的机制；
（3）验证nova1是促进smn2全长基因表达重要的剪接因子；
（4）通过体外细胞实验证明敲降和过表达nova1显著抑制和促进smn2外显子7列入；
（5）构建smn2外显子7中nova1靶向结合位点突变以及rnapulldown实验，证实nova1是通过结合外显子7靶向序列促进smn2外显子7列入，并显著提升smn蛋白的表达；
（6）构建小鼠模型：构建lenti-virusnova1过表达病毒，皮下注射sma刚出生小鼠，与fastgreen组进行比较，结果显示：nova1治疗脊髓、脑、肌肉smn2列入比例均明显上升，其中大脑中smn2外显子7列入上调具有显著差异。
2.根据权利要求1所述的nova1促smn2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（1）的具体步骤为：
smai型对照和i型小鼠冰上麻醉后，取出相应组织迅速入液氮，组织匀浆后trizol法提rna；rna逆转录，5×rtbuffer4μl；dntpmix1μl；oligo181μl；rnaseinhibitor1μl；reversetranscriptase1μl；rna1μg；rnase-freeddh2oto20µl；
pcr反应体系，2×taqmastermix12.5μl；引物e6-fcy5-ataattcccccaccacctcc1μl；引物e8-467rttgccacatacgcctcacatac1μl；cdna1μl；ddh2o9.5μlto25µl；
半定量扩增了28个循环；
pcr产物用ddei酶进行酶切，并用2％琼脂糖凝胶进行电泳，imagej图像软件进行定量分析，外显子7的列入表示为fl与剪接转录本总量的百分比。
3.根据权利要求1所述的nova1促smn2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：
筛选了hnnrp、sr及nova家族部分成员共21个基因，检测其在smaⅰ型小鼠中的表达差异，反应体系为2×chamquniversalsybrqpcrmastermix5μl，f0.5μl，r0.5μl，cdna1μl，ddh2o3μl；反应条件为：95℃5min；95℃10s，60℃20s，72℃20s，45个循环；60℃60s，95℃15s，统计剪接因子在中枢神经和周围非神经组织中的表达差异。
4.根据权利要求1所述的nova1促smn2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：
在smai型小鼠p1、p4及p7各时间点，提取rna及蛋白后，采用qpcr及westernblot方法分别检测nova1和smn全长基因及蛋白水平表达变化。
5.根据权利要求1所述的nova1促smn2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（4）的具体步骤为：
在细胞培养6孔板中，种适量密度的u87mg细胞，并添加2ml完全培养基，在细胞培养箱中培养过夜；次日，待细胞汇合达到50%时，分别将0.5μgnova1过表达质粒或5μl20μmnova1sirna与1μgsmn2minigene加入100μlopti-mem中混匀，室温放置5min；同时，将3μlpei加入100μlopti-mem中吹打混匀，室温放置5min；
将上述两种混合液加入同一离心管中，轻轻吹打混匀，室温静置20min；
弃去6孔板中培养基，加800μl无血清培养基，再均匀加入配置好的转染混合物，十字摇晃混匀后培养；6h后，用2ml新鲜预热的完全培养基换液；
36~48h后检测smn2外显子7列入。
6.根据权利要求1或3所述的nova1促smn2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（2）中，qpcr检测了21个剪接调控基因，发现nova1在中枢即大脑脊髓中高表达。
7.根据权利要求1或5所述的nova1促smn2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（4）的体外细胞实验中通过靶向沉默nova1和过表达nova1，smn2全长基因和蛋白表达相应下调和上调，差异具有显著性。
8.根据权利要求1所述的nova1促smn2外显子7列入的验证方法，其特征在于，步骤（5）的具体步骤为：
根据nova1靶向结合ycay基序特点，预测smn2外显子7第34-37位ucac序列是nova1结合位点，通过定点删除和突变，把ucac删除或突变为uaac后，smn2全长基因显著下调，rnapulldown实验表明该位点ucac为nova1结合基序；进一步分二类突变该ycay基序，其一，改变ycay中y的组合，发现smn2全长基因有所下降，其二，改变ycay中核心结合序列ca，发现smn2全长基因极显著下降，有两个例外推测可能引入新的剪接因子；综上证明：nova1通过结合smn2外显子7第34-37位ucac序列促进外smn2全长基因的表达，其中ucac序列中ca最为重要。
9.一种nova1促smn2外显子7列入的应用，其特征在于，用于制备延长脊髓型肌肉萎缩症小鼠存活时间的药物。
技术总结本发明提供一种NOVA1促SMN2外显子7列入的验证方法及其应用，验证方法包括如下步骤：（1）RT‑PCR及酶切电泳分析SMN2全长基因在不同组织中的表达；（2）寻找SMN2全长基因在中枢系统中高表达的机制；（3）验证NOVA1是促进SMN2全长基因表达重要的剪接因子；（4）通过体外细胞实验证明敲降和过表达NOVA1显著抑制和促进SMN2外显子7列入；（5）证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入；（6）构建小鼠模型，证实NOVA1治疗脊髓、脑、肌肉SMN2列入比例均明显上升，其中大脑中SMN2外显子7列入上调具有显著差异。本发明证实NOVA1是通过结合外显子7靶向序列促进SMN2外显子7列入，并显著提升SMN蛋白的表达，而且该重组质粒可以在细胞内持续性表达，不用持续性给药。
技术研发人员：吴刘成;孙俊杰;华益民;邵义祥;朱顺星
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2020.12.23
技术公布日：2021.03.12
