本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种小麦抗条锈病基因yrz15-1370及其分子标记和应用。
背景技术：
小麦条锈病是由小麦条锈菌引起的世界性重要病害。我国历史上出现过多次条锈病大流行，严重的年份可导致小麦减产40％以上，甚至绝收。由于条锈菌生理小种的变异频繁，新的毒性生理小种的出现，常导致小麦品种抗性快速“丧失”，引发条锈病大流行，威胁小麦安全生产。小麦条锈病的持续有效防控是一个长期的国际难题。因此，发掘和利用新的抗条锈病基因，增加抗条锈病基因的多样性，培育推广抗条锈病小麦品种是有效控制该病害最经济安全和环保的措施。
单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)指的是基因组内dna某一特定核苷酸位置上存在转换、颠换、插入、缺失等变化而引起的dna序列多态性。其技术是利用己知序列信息来比对寻找snp位点，再利用发掘的变异位点设计特异性的引物来对基因组dna或cdna进行pcr扩增，得到基于snp位点的特定的多态性产物，最后利用电泳技术分析产物的多态性。snp标记的优点是数量多，分布广泛；在单个基因和整个基因组中分布不均匀；snp等位基因频率容易估计。
kasp是由lgc公司(laboratoryofthegovernmentchemist)(http://www.lgcgenomics.com)研发的竞争性等位基因特异性pcr技术(kompetitiveallelespecificpcr,kasp)具有低成本、高通量特点的新型基因分型技术，通过引物末端碱基的特异匹配来对snp以及indel位点进行精准的双等位基因分型，在水稻、小麦、大豆等作物的分子标记辅助选择中得到广泛应用。
野生一粒小麦(triticumboeoticum,2n＝2x＝14,abab)是栽培一粒小麦(triticummonococcuml.ssp.monococcum,2n＝2x＝14,amam)的祖先种，是普通小麦应对各种生物和非生物胁迫的重要基因源。虽然很久以前人们就已经认识到野生物种改良小麦很大的潜力，但是野生物种的遗传多样性至今仍未被有效开发和利用。目前为止，从野生一粒小麦导入普通小麦的抗性基因非常有限，包括抗白粉病基因pmtb7a.1和pmtb7a.2,pm25，抗秆锈病基因sr22。目前，仅在野生一粒小麦pau5088的5ab上定位了一个成株抗条锈病qtl(qyrtm.pau-5a)，且已利用硬粒小麦为桥梁将该抗性qtl成功转入了普通小麦中。已有研究表明，大多数的野生一粒小麦高抗条锈病。因此，将更多的野生一粒小麦的条锈病抗性基因转入普通小麦是非常重要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种小麦抗条锈病基因yrz15-1370，以及与该基因紧密连锁的分子标记及其应用，该分子标记能准确跟踪小麦抗条锈病基因yrz15-1370，预测小麦品种是否含抗条锈病基因yrz15-1370的特性，进而方便进行分子设计育种。
为了达到上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
基于以上目的，利用具有外源抗病基因来源的野生一粒小麦渐渗系z15-1370为母本，以小麦品种‘铭贤169’为父本杂交，得到杂种f1，f1代单株自交获得f2，f2自交获得f2:3家系，群体大小为410个株系，以此来构建遗传作图群体。对f2、f2:3家系群体条锈病表型进行鉴定，提取亲本‘z15-1370’、‘铭贤169’和f2:3家系群体30株高抗纯合植株与30株高感纯合单株rna，本发明使用混池转录组测序bsr-seq(bulkedsegregantrna-seq)来定位小麦抗条锈病基因yrz15-1370。
具体的，一种小麦抗条锈病基因yrz15-1370，来自母本‘z15-1370’，该基因位于小麦6a染色体长臂上，在refseqv1.0基因组版本的物理位置为601.47mb-603.30mb(图1)。
所述的小麦抗条锈病基因yrz15-1370可显著增加小麦条锈病抗性。
在本发明的另一方面，根据转录组数据，结合亲本与混池表型，利用r-studio构建snp密度图。在6a染色体长臂上的592.2mb-608.39mb区间扫描出了高密度的snp位点，对该区域标记进行物理定位并对获得多态性位点并进行分子标记开发，设计引物，结合群体的抗条锈病表型数据，kasp标记分析结果，最终得到标记kasp-1370-1与抗条锈病基因yrz15-1370紧密连锁。
一种与小麦抗条锈病基因yrz15-1370紧密连锁的分子标记kasp-1370-1，该分子标记为snp分子标记，其与小麦抗条锈病基因yrz15-1370共定位于6a染色体长臂上，其snp位点位于基因yrz15-1370(601.47mb-603.30mb)区间内，所述分子标记的多态性为a/g。
所述的分子标记kasp-1370-1可通过核苷酸序列如seqidno.1～3所示的引物组扩增得到。
进一步的，核苷酸序列如seqidno.1～2所示的引物在5’端分别添加不同的荧光修饰基团，或在3’端分别添加不同的荧光修饰基团。
优选的，所述荧光修饰基团包括但不限于fifc、fam、tet、hex、joe、tamra或bhq。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于检测小麦抗条锈病基因yrz15-1370的引物组，所述的引物组含有3条引物，其核苷酸序列分别如seqidno.1～3所示。
同时，含有上述引物组的试剂盒也在本发明的保护范围之内。
在本发明的另一方面，还提供了上述分子标记kasp-1370-1或引物组在小麦分子育种、培育转基因小麦或小麦抗病资源改良中的应用。
具体的，上述分子标记kasp-1370-1或引物组在培育抗条锈病小麦或鉴定具有抗条锈病基因yrz15-1370小麦品种中的应用。
在本发明的另一方面，还提供了一种鉴定小麦抗条锈病基因yrz15-1370的方法，以待鉴定材料的dna作为模板，用序列分别为seqidno.1～3所示的特异性引物对进行pcr扩增并读取荧光值，若为seqidno.2所示引物标记的荧光可判断为含有抗条锈病基因yrz15-1370的小麦。
具体的，包括以下步骤：
1)提取待测植株的基因组dna；
2)以待测植株的基因组dna为模板，利用上述引物组进行pcr扩增反应并读取荧光值；
3)检测pcr扩增产物荧光，如果能够读取hex荧光，则待测植株为具有抗条锈病基因yrz15-1370的小麦。
进一步的，所述的pcr扩增体系为：5μlmastermix，混合引物1.4μl，模板dna5ng，双蒸水加至总量为10μl，至少3个独立的以双蒸水代替dna模板的空白。
所述的混合引物为以引物seqidno.1、2和3按照10ng/μl的浓度，分别按体积比加入12％、12％和30％，并添加46％的ddh2o进行混合。
进一步的，所述的pcr扩增程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。
本发明的有益效果为：
本发明公开了位于小麦6a染色体上的与小麦抗条锈病基因yrz15-1370连锁的分子标记kasp-1370-1，该分子标记是小麦6a染色体长臂上抗条锈病基因yrz15-1370的侧翼标记，连锁度高。该标记可用来检测小麦6a染色体上的抗条锈病基因yrz15-1370，快速筛选具有该位点的植株，进而方便进行高抗条锈病小麦的分子辅助育种。本发明提供的分子标记kasp-1370-1与6a染色体上的小麦抗条锈病基因yrz15-1370紧密连锁，可用来对小麦抗条锈病这一性状进行定位，从而在育种过程中，增加新型抗条锈病来源，进而增加抗条锈病抗性，最终达到选育抗条锈病小麦新品种的目的。
1)本发明首次公开了来自野生一粒小麦渐渗系‘z15-1370’的抗条锈病基因yrz15-1370，位于小麦6a染色体长臂上，显著增加小麦条锈病抗性。该基因在小麦抗条锈病育种增加新型抗条锈病来源具有较高的利用价值。
2)本发明首次公开了基于荧光定量pcr平台精确检测来自野生一粒小麦渐渗系‘z15-1370’的分子标记kasp-1370-1，且为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定。
3)本发明公开的分子标记kasp-1370-1与抗条锈病基因yrz15-1370极显著相关，呈现紧密连锁标记特征，用于分子标记辅助选择的准确性高，且成功率高。
附图说明
图1为本发明来自野生一粒小麦渐渗系‘z15-1370’的抗条锈病基因yrz15-1370在6a染色体上的定位；
图2为bsr-seq抗池与感池比对多态性位点密度图；
图3为本发明实施例2中野生一粒小麦渐渗系‘z15-1370’×小麦品种‘avocets’的f2验证群体植株分子标记kasp-1370-1检测的荧光读值结果；其中，fam(蓝色正方形，‘avocets’)荧光为感条锈病植株，hax(黄色圆形，‘z15-1370’)荧光为抗条锈病植株；绿色三角形荧光为杂合株系；黑色菱形荧光为空白对照。
具体实施方式
下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中所用的小麦种质资源均来自四川农业大学小麦研究所刘登才教授种质资源库。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1抗条锈病基因yrz15-1370及其分子标记kasp-z1370-1的获取
本发明利用具有外源抗病基因来源的野生一粒小麦渐渗系z15-1370为母本，以小麦品种‘铭贤169’为父本杂交，得到杂种f1，f1代单株自交获得f2，f2自交获得f2:3家系，群体大小为410个株系，以此来构建遗传作图群体。对f2、f2:3家系群体条锈病表型进行鉴定，提取亲本‘z15-1370’、‘铭贤169’和f2:3家系群体30株高抗纯合植株与30株高感纯合单株rna，本发明使用混池转录组测序bsr-seq方法来定位小麦抗条锈病基因yrz15-1370。
根据转录组数据，结合亲本与混池表型，利用r-studio构建snp密度图。在6a染色体长臂上的592.2mb-608.39mb区间扫描出了高密度的snp位点(图2)，对该区域标记进行物理定位并对获得多态性位点并进行分子标记的开发，共设计了5对共15条kasp引物，结合群体的抗条锈病表型数据，kasp标记分析结果，最终得到标记kasp-1370-1与抗条锈病基因yrz15-1370紧密连锁。
具体过程为：
1)利用野生一粒小麦渐渗系‘z15-1370’为母本，以小麦品种‘铭贤169’为父本杂交，得到杂种f1，f1代单株自交获得f2，f2自交获得f2:3家系，群体大小为410个株系，以此来构成遗传作图群体。
2)f2，f2:3家系条锈病表型鉴定：将亲本材料z15-1370、铭贤169以及f1、f2、f2:3家系按照株距10cm，行长2m，行距30cm种植在温江惠和基地，进行田间条锈病抗性鉴定。在小麦拔节前，使用条锈菌混合生理小种(条中32、条中33、条中34、水源11-4、水源11-5)与滑石粉按1:250比例混匀，在诱发行使用涂抹法进行接种。待诱发材料sy95-71发病充分时(严重度>50％且普遍率>80％)对材料进行抗性鉴定。抗性反应调查参照wellings&bariana发表的1-9级分级标准(表1)。抗性调查共进行三次，每十天调查一次，以感病亲本的旗叶发病最严重的为准。分级标准中，1-4为抗病，5为中间型，6-9为感病。
表1小麦条锈病苗期反应型分级及鉴定标准
3)转录组数据分析
a)样本取样及rna的提取：待诱发材料sy95-71发病充分时，取亲本‘z15-1370’、‘铭贤169’叶片和f2:3家系群体30株高抗纯合植株与30株高感纯合单株叶片，放于干冰中保存送样。送至北京诺禾致源科技股份有限公司(https://www.novogene.com/)进行rna的提取及混样。
b)转录组数据分析，在本研究中双亲和作图群体的转录组分析由北京诺禾致源科技股份有限公司(https://www.novogene.com/)测序并完成分析。
c)连锁图谱的构建以及分子标记的获得：根据转录组数据，结合亲本与混池表型，利用r-studio构建snp密度图(图1)。在6a染色体长臂上的592.2mb-608.39mb区间扫描出了高密度的snp位点，对该区域标记进行物理定位并对获得多态性位点并进行分子标记的开发，共设计了5对共15条kasp引物(表2)，结合群体的群体条锈病表型数据，kasp标记分析结果，利用joinmap4.0构建连锁图谱。得到标记kasp-1370-1与抗条锈病基因yrz15-1370紧密连锁。
表25对kasp引物序列
d)抗条锈病基因位点的比较：前人报道抗条锈病基因较多，但在6a染色体长臂上检测到的抗条锈病基因相对较少。至今，已报道的位于小麦染色体6al上的抗条锈病基因只有yr38，该基因来自于沙融山羊草(aegilopssharonensis,2n＝14,sshssh)，为全生育期显性抗病基因。但是，yrz15-1370是一个隐性抗病基因，表现对条锈菌生理小种条中34苗期抗性及对条锈菌混合生理小种(条中34、条中33、条中32、水源11-4和水源11-5)田间抗性，表现出成株期抗性。根据系谱分析、抗谱分析和染色体上的位置，渗入系z15-1370的抗性基因yrz15-1370与6al染色体上的其他抗病基因yr38表现不同，表明yrz15-1370是一个新基因。
设计的5对kasp引物荧光分型结果结合群体条锈病表型数据，利用joinmap4.0构建连锁图谱。得到标记kasp-1370-1与抗条锈病基因yrz15-1370紧密连锁。
实施例2分子标记kasp-1370-1在验证群体‘z15-1370’×小麦品种‘avocets’f2中的应用
1)利用野生一粒小麦渐渗系‘z15-1370’×小麦品种‘avocets’的f2验证群体植株，后代株系68个单株。
2)对所获得的68个单株进行kasp-1370-1标记检测，具体方法为：提取68个单株的dna；将其作为模板，以分子标记kasp-1370-1的特异性引物对为引物进行pcr扩增并进行荧光读值，所述引物为：
fam标签上引物：(下划线部分为fam标签序列)5’-gaaggtgaccaagttcatgctaggagaaagatgagcccaaaa-3’；
hex标签上引物：(波浪线部分为hex标签序列)5’-gaaggtcggagtcaacggattaggagaaagatgagcccaaag-3’；
通用下游引物：5’-ccaagatcgtcctcctactc-3’。
上述pcr扩增的扩增体系为：5μlmastermix、三条引物seqidno：1、2和3按照10ng/μl的浓度，分别按比例加入12％、12％和30％并添加ddh2o46％进行混合后作为混合引物使用，混合引物1.4μl、5ng模板dna、双蒸水加至总量为10μl，同时需添加至少3个独立的以双蒸水代替dna模板的空白。
上述pcr扩增的程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。
荧光读值结果(见图3)，其中fam(蓝色正方形，‘avocets’)，hax(黄色圆形，‘z15-1370’)；绿色三角形荧光为杂合株系；黑色菱形荧光为空白对照。将检测到与‘avocets’一致的fam(蓝色)荧光的植株基因型记为b，为感条锈病植株，同‘z15-1370’一样表现为hax(黄色)荧光的植株基因型记为a，为抗条锈病植株，绿色三角形荧光为杂合株系,记为h，为感条锈病植株。各个单株基因型与条锈病田间表型值如表3所示。实际结果与预期结果基本一致，说明本发明的抗条锈病基因yrz15-1370确实有显著增加小麦条锈病抗性的作用；同时本发明的分子标记kasp-1370-1可以用与跟踪鉴定抗条锈病基因yrz15-1370。
表3z15-1370’בavocets’f2群体kasp-1370-1基因型与表型对应结果
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110>四川农业大学
<120>一种小麦抗条锈病基因yrz15-1370及其分子标记和应用
<160>15
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
aggagaaagatgagcccaaaa21
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
aggagaaagatgagcccaaag21
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
ccaagatcgtcctcctactc20
<210>4
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gcatataagagacggggtgac21
<210>5
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
gcatataagagacggggtgag21
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>6
agcagaacacatatacacac20
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>7
ttctagttgtagctgaggac20
<210>8
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>8
ttctagttgtagctgaggat20
<210>9
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>9
cagatggccatgaaggcagt20
<210>10
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>10
cgactagctagctagctacaa21
<210>11
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>11
cgactagctagctagctacag21
<210>12
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>12
ggctgagcgacggatcatgg20
<210>13
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>13
atccttaaagaaggatagtaa21
<210>14
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>14
atccttaaagaaggatagtag21
<210>15
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>15
aattgcatccaaaattaaga20
1.一种小麦抗条锈病基因yrz15-1370，其特征在于，所述的小麦抗条锈病基因yrz15-1370位于小麦6a染色体长臂上，在refseqv1.0基因组版本的物理位置为601.47mb-603.30mb。
2.一种与小麦抗条锈病基因yrz15-1370紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述的分子标记与小麦抗条锈病基因yrz15-1370共定位于小麦6a染色体长臂上，其snp位点位于基因yrz15-1370区间内，所述分子标记的多态性为a/g。
3.根据权利要求2所述的一种与小麦抗条锈病基因yrz15-1370紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述的分子标记通过核苷酸序列如seqidno.1～3所示的引物组扩增得到。
4.根据权利要求3所述的一种与小麦抗条锈病基因yrz15-1370紧密连锁的分子标记，其特征在于，核苷酸序列如seqidno.1～2所示的引物在5’端或3’端添加不同的荧光修饰基团。
5.一种用于检测小麦抗条锈病基因yrz15-1370的引物组，其特征在于，所述的引物组含有3条引物，其核苷酸序列分别如seqidno.1～3所示。
6.权利要求2所述的分子标记或权利要求5所述的引物组在小麦分子育种、培育转基因小麦或小麦抗病资源改良中的应用。
7.权利要求2所述的分子标记或权利要求5所述的引物组在培育抗条锈病小麦或鉴定具有抗条锈病基因yrz15-1370小麦品种中的应用。
8.一种鉴定小麦抗条锈病基因yrz15-1370的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提取待测植株的基因组dna；
2)以待测植株的基因组dna为模板，利用上述引物组进行pcr扩增反应并读取荧光值；
3)检测pcr扩增产物荧光，如果能够读取hex荧光，则待测植株为具有抗条锈病基因yrz15-1370的小麦。
9.根据权利要求8所述的一种鉴定小麦抗条锈病基因yrz15-1370的方法，其特征在于，所述的pcr扩增体系为：5μlmastermix，权利要求5引物组混合引物1.4μl，模板dna5ng，双蒸水加至总量为10μl，至少3个独立的以双蒸水代替dna模板的空白。
10.根据权利要求9所述的一种鉴定小麦抗条锈病基因yrz15-1370的方法，其特征在于，所述的pcr扩增程序为：94℃预变性15min；94℃变性20s、61℃复性/延伸60s，共10个循环；94℃变性20s、55℃复性/延伸60s，共26个循环；完成后进行荧光读值。
技术总结