本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法。
背景技术：
类黄酮广泛存在于多数植物体内，是大部分植物花色形成的决定性色素群，同时可提高植物的抗逆性等，还是一种天然有机抗氧化剂，具有较高的营养和保健价值。类黄酮是一大类次级代谢产物的统称，主要存在于花瓣表皮组织细胞的液泡中，其中黄酮（flavone）、黄酮醇（flavonol）等属黄色系，花青素（anthocyanin）属红色系，多酚（polyphenols）为无色系。
金花茶（camellianitidissima）花色金黄，不仅具有极高的观赏价值，还是黄花茶花育种的珍稀遗传资源。前人通过研究发现，金花茶花色形成的主要原因是花瓣中黄酮醇的含量较高导致的，而fls基因（黄酮醇合酶基因）是黄酮醇合成的关键基因，但是前人仅是通过单独过表达金花茶cnfls基因，很难使模式植物的黄酮醇的含量显著升高，进行形成金黄色的花朵。fls基因与f3’h基因存在底物竞争作用，多项研究中发现fls基因表达量升高，f3’h基因的表达量降低，更利于黄酮醇的合成，从而形成黄色花。
技术实现要素：
针对上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于设计提供一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法。本发明利用pcr扩增得到金花茶的cnfls、人工合成烟草f3’h基因反义序列，使用oscr克隆技术，进行酶切构建过表达cnfls 反义表达f3’h的双基因表达载体，将得到的双基因表达载体转化本氏烟草，使阳性株系的黄酮醇含量得到显著提高。
一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）克隆金花茶cnfls基因，合成烟草反义表达f3’h基因的干扰序列；
2）构建cnfls 反义f3’h双基因载体；
3）将cnfls 反义f3’h双基因载体转入大肠杆菌，测序正确后，提取质粒转入农杆菌中，采用农杆菌介导的叶盘法转化本氏烟草；
4）采用pcr鉴定转基因烟草阳性株系，利用hplc方法测定阳性株系花朵的黄酮组分、多酚组分、花青素苷组分含量，并计算黄酮总量、多酚总量、花青素苷总量。
所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤1）中克隆cnfls基因具体为：根据金花茶的cnfls基因序列设计引物pfls-f和pfls-r，使用extaq酶进行pcr扩增，扩增产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，所述pfls-f的核苷酸序列如seqidno.1所示，pfls-r的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述pcr扩增反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min。
所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤1）中合成干扰序列具体为：根据烟草f3’h基因的序列，设计并合成反义f3’h基因干扰序列，所述反义表达f3’h基因的干扰序列的核苷酸序列如seqidno.3所示。
所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤2）具体为：将步骤1）得到的cnfls基因、反义f3’h基因干扰序列分别构建至带有酶切位点的pbwa(v)和pbwd(la)载体中，得到pbwa(v)ks-fls、pbwd(la)1c-antif3’h中间载体，利用oscr克隆技术进行酶切连接，回收产物得到cnfls 反义f3’h双基因载体。
所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述酶切体系为：buffer:2µl，bsmbi/esp3i:1µl，t4_ligase:1µl，pbwa(v)ks-fls:4µl，pbwd(la)1c-antif3’h:4µl，h2o:8µl，total:20µl，所述酶切连接反应程序为：37℃20min；37℃10min，20℃10min，5个循环；37℃20min；80℃5min。
所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤3）中cnfls 反义f3’h双基因载体转入大肠杆菌，测序正确后提取质粒转入农杆菌具体为：cnfls 反义f3’h双基因表达载体转化大肠杆菌感受态，涂抗性lb平皿，37℃倒置培养12h，挑菌进行pcr鉴定和测序，对应测序正确提取质粒，利用热击法将cnfls 反义f3’h双基因载体连接至农杆菌中。
所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤3）中叶盘法转化本氏烟草具体为：将含有cnfls 反义f3’h双基因载体的农杆菌于含有50mg/lkan的lb液体培养基中振荡培养，温度28℃，转速200rpm至od600为0.4-0.5，离心收集菌体，用含有100µm/l的乙酰丁香酮的液体培养基，重新悬浮细胞，制成侵染液，取苗龄4-6周的生长健壮的烟草无菌苗叶片，剪成叶盘侵染5-10min后吹干，接种在共培养基上黑暗培养，温度28℃培养3天，将叶片无菌水洗10次后吹干接种于筛选培养基上，在光照周期16h/8h，25℃条件下选择培养，每2周继代一次，将新鲜未处理叶片接种于筛选培养基上作为对照，待不定芽长到1-2cm时，切下转入生根培养基，生根2-3周、生长健壮的本氏烟组培苗，从组培瓶中去除，移至室外培养。
所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤4）具体为：利用试剂盒进行阳性鉴定，pcr程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性植株开花后，采集花朵，液氮冷冻，-80℃保存，利用实时荧光定量pcr测定cnfls 反义f3’h双基因在阳性花朵中的相对表达量。
所述方法得到的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体。
所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体在促进植物黄酮醇合成中的应用。
本发明通过过表达金花茶的cnfls基因，同时干扰f3’h基因的表达合理设计，cnfls基因过表达促进合成黄酮醇，降低了f3’h基因对fls基因的底物竞争作用，减少了多酚、花青素的合成，同时增加了黄酮醇的合成，提高了植物中黄酮醇的含量，可达到能使植物的花色变黄的目的。
附图说明
图1为转基因阳性株系中多酚总量、黄酮总量的含量；
图2为转基因阳性株系中多酚组分、黄酮组分的含量，其中egc：表没食子儿茶素、gc：没食子儿茶素、cg：儿茶素没食子酸酯、ecg：表儿茶素没食子酸酯为多酚组分。qu3r：槲皮素3-芸香糖苷、ru：芦丁、qu7g：槲皮素7-o-β-d-葡萄糖苷、qu3g：槲皮素3-o-葡萄糖为黄酮组分。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
1.金花茶cnfls基因的克隆、烟草反义表达f3’h基因的干扰序列合成：
（1）根据金花茶cnfls基因的序列（genbankid：jf343560.1）设计引物的核苷酸序列如seqidno.1和2，见表1所示，使用extaq酶（rr902，takara）进行pcr扩增获得目的基因全长cds序列。pcr反应程序如下：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min。
（2）pcr产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（110v，45min）分析检测。用axygen公司的凝胶回收试剂盒（ap-mn-p-250，axygen）对扩增产物进行回收纯化。
（3）根据烟草f3’h基因的序列，设计其反义表达干扰序列的核苷酸序列如seqidno.3所示，并人工合成干扰序列。
2.cnfls 反义f3’h双基因载体的构建：
（1）将cnfls基因、反义f3’h基因干扰序列分别构建至带有酶切位点的pbwa(v)和pbwd(la)载体中，得到pbwa(v)ks-fls、pbwd(la)1c-antif3’h中间载体。
（2）利用oscr克隆技术进行酶切链接，酶切体系如下：
buffer:2µlbsmbi/esp3i:1µlt4_ligase:1µlpbwa(v)ks-fls:4µlpbwd(la)1c-antif3’h:4µl
h2o:8µltotal:20µl连接反应过程：37℃20min；37℃10min，20℃10min，5个循环；37℃20min；80℃5min。
（3）反应完成后，回收产物，将5µl连接产物转化大肠杆菌感受态，转化涂（卡纳霉素）抗性lb平皿，37℃倒置培养12小时，挑选单菌落进行pcr鉴定和测序。待测序结果出来后，对应测序正确的提取质粒，得到cnfls 反义f3’h双基因载体。利用热击法将cnfls 反义f3’h双基因载体连接至gv3101农杆菌中。
3.叶盘法转化本氏烟草：
（1）将含有cnfls 反义f3’h双基因载体的gv3101农杆菌于含有为50mg/lkan的lb液体培养基中，28℃条件下200rpm振荡培养至od600：0.4~0.5，8000rpm4℃离心收集菌体。用含100µm/l的乙酰丁香酮(as)的液体培养基，重新悬浮细胞，制成侵染液。
（2）取苗龄4-6周的生长健壮的烟草无菌苗叶片，剪成叶盘，侵染5~10min。吹干，接种在共培养基的培养基上，在28°c条件下，黑暗中共培养3天。
（3）将经过共培养的叶片，无菌水清洗10次，吹干，接种于筛选培养基上，在光照周期16h/8h，25°c条件下，进行选择培养，每2周进行继代一次。将新鲜未处理的叶片接种于筛选培养基上，做为对照。待不定芽长到1~2cm左右时，切下转入生根培养基。生根2~3周（根长2~3cm）、生长健壮的本氏烟组培苗，从组培瓶中取出，移至室外培养。
4.转基因烟草的阳性鉴定与指标测定：
（1）利用t5directpcrkit(plant)试剂盒，对生根植株进行阳性鉴定，引物见表1，pcr程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
（2）阳性植株开花后，采集花朵，液氮冷冻，-80℃保存。利用实时荧光定量pcr（qpcr）引物见表1，测定目的基因在阳性株系花朵中的相对表达量。
（3）利用hplc方法测定阳性植株花朵的黄酮组分、多酚组分、花青素苷组分的含量，并计算黄酮总量（tf）、多酚总量（tp）、花青素苷总量（ta），与野生型烟草、单独过表达cnfls基因及单独过表达反义f3’h基因的阳性株系进行比较。
表1引物序列
对比实验1：
结合步骤4，移栽未转化的野生型本氏烟草，在相同环境下种植。利用hplc方法测定植株花朵的黄酮组分、多酚组分、花青素苷组分的含量，并计算黄酮总量（tf）、多酚总量（tp）、花青素苷总量（ta），与cnfls 反义f3’h双基因载体的阳性株系进行比较。
对比实验2：
利用步骤1克隆得到cnfls基因，利用同源重组方法，按照exclone试剂盒说明书（exv09，百格基因科技(江苏)有限公司），设计引物（见表1），进行pcr，程序如下：98℃预变性5min；98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸10min。将正确产物回收后，连接至pcambia1300载体中。利用热击法将pcambia1300载体连接至gv3101农杆菌中。
按照步骤3、步骤4进行转化本氏烟草，并利用hplc方法测定植株花朵的黄酮组分、多酚组分、花青素苷组分的含量，并计算黄酮总量（tf）、多酚总量（tp）、花青素苷总量（ta），与cnfls 反义f3’h双基因载体的阳性株系进行比较。
对比实验3：
根据金花茶f3’h基因序列（genbankid：hq290518.1）设计引物（见表1），克隆获得f3’h基因序列。利用同源重组方法，按照exclone试剂盒说明书（exv09，百格基因科技(江苏)有限公司），设计引物（见表1），进行pcr，程序如下：98℃预变性5min；98℃变性10s，65℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸10min。将正确产物回收后，连接至pcambia1300载体中。利用热击法将pcambia1300载体连接至gv3101农杆菌中。
按照步骤3、步骤4进行转化本氏烟草，并利用hplc方法测定植株花朵的黄酮组分、多酚组分、花青素苷组分的含量，并计算黄酮总量（tf）、多酚总量（tp）、花青素苷总量（ta），与cnfls 反义f3’h双基因载体的阳性株系进行比较。试验结果如图1和图2所示。
从试验结果可知，如表2，通过本发明提供的方法，实施例1的表达cnfls 反义f3’h双基因载体的阳性株系中，多酚总量（tp）和egc、gc的含量要显著低于对比试验3（单独过表达f3’h基因），cg、ecg的含量也低于对比试验3，但差异不显著；黄酮总量及黄酮组分含量在实施例1中均显著高于对比试验1（野生型烟草）和对比试验2（单独过表达fls基因）。表明cnfls 反义f3’h双基因载体抑制了f3’h基因对多酚合成的促进作用，同时促进了黄酮醇的合成，其促进作用大于单独过表达cnfls基因。本发明通过过表达金花茶的cnfls基因，同时反义抑制f3’h基因表达的合理设计，降低了f3’h基因对fls基因的底物竞争作用，减少了多酚的合成，同时增加了黄酮醇的合成，提高了植物中黄酮醇的含量，可达到能使植物的花色变黄的目的。
表2对比实验1-3与实施例的多酚组分、黄酮组分的含量（mg/g）
序列表
<110>中国林业科学研究院亚热带林业研究所
<120>一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>primerpfls-f(引物pfls-f)
<400>1
aggagtgagaaggggaaaa19
<210>2
<211>21
<212>dna
<213>primerpfls-r(引物pfls-r)
<400>2
cgagtgagtgaagaaggctca21
<210>3
<211>200
<212>dna
<213>antisensef3'hgeneinterferencesequence(反义f3’h基因干扰序列)
<400>3
catcaaccccactctctctcccccggatggcatctgacagttgtgaaatcaatggctact60
tcattccaaagggctcaactcttcttgtcaatgtatggccatagcccgtgatccagatgc120
gtgggccgagccattagagtttcggccagaacgattcctacctggtggcgaaaagcccaa180
tgttgatgttagggaaatga200
1.一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）克隆金花茶cnfls基因，合成烟草反义表达f3’h基因的干扰序列；
2）构建cnfls 反义f3’h双基因载体；
3）将cnfls 反义f3’h双基因载体转入大肠杆菌，测序正确后，提取质粒转入农杆菌中，采用农杆菌介导的叶盘法转化本氏烟草；
4）采用pcr鉴定转基因烟草阳性株系，利用hplc方法测定阳性株系花朵的黄酮组分、多酚组分、花青素苷组分含量，并计算黄酮总量、多酚总量、花青素苷总量。
2.如权利要求1所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤1）中克隆cnfls基因具体为：根据金花茶的cnfls基因序列设计引物pfls-f和pfls-r，使用extaq酶进行pcr扩增，扩增产物进行凝胶电泳分析检测后回收纯化，所述pfls-f的核苷酸序列如seqidno.1所示，pfls-r的核苷酸序列如seqidno.2所示，所述pcr扩增反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min。
3.如权利要求1所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤1）中合成干扰序列具体为：根据烟草f3’h基因的序列，设计并合成反义f3’h基因干扰序列，所述反义表达f3’h基因的干扰序列的核苷酸序列如seqidno.3所示。
4.如权利要求1所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤2）具体为：将步骤1）得到的cnfls基因、反义f3’h基因干扰序列分别构建至带有酶切位点的pbwa(v)和pbwd(la)载体中，得到pbwa(v)ks-fls、pbwd(la)1c-antif3’h中间载体，利用oscr克隆技术进行酶切连接，回收产物得到cnfls 反义f3’h双基因载体。
5.如权利要求4所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述酶切体系为：buffer:2µl，bsmbi/esp3i:1µl，t4_ligase:1µl，pbwa(v)ks-fls:4µl，pbwd(la)1c-antif3’h:4µl，h2o:8µl，total:20µl，所述酶切连接反应程序为：37℃20min；37℃10min，20℃10min，5个循环；37℃20min；80℃5min。
6.如权利要求1所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤3）中cnfls 反义f3’h双基因载体转入大肠杆菌，测序正确后提取质粒转入农杆菌具体为：cnfls 反义f3’h双基因表达载体转化大肠杆菌感受态，涂抗性lb平皿，37℃倒置培养12h，挑菌进行pcr鉴定和测序，对应测序正确提取质粒，利用热击法将cnfls 反义f3’h双基因载体连接至农杆菌中。
7.如权利要求1所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤3）中叶盘法转化本氏烟草具体为：将含有cnfls 反义f3’h双基因载体的农杆菌于含有50mg/lkan的lb液体培养基中振荡培养，温度28℃，转速200rpm至od600为0.4-0.5，离心收集菌体，用含有100µm/l的乙酰丁香酮的液体培养基，重新悬浮细胞，制成侵染液，取苗龄4-6周的生长健壮的烟草无菌苗叶片，剪成叶盘侵染5-10min后吹干，接种在共培养基上黑暗培养，温度28℃培养3天，将叶片无菌水洗10次后吹干接种于筛选培养基上，在光照周期16h/8h，25℃条件下选择培养，每2周继代一次，将新鲜未处理叶片接种于筛选培养基上作为对照，待不定芽长到1-2cm时，切下转入生根培养基，生根2-3周、生长健壮的本氏烟组培苗，从组培瓶中去除，移至室外培养。
8.如权利要求1所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体构建促进植物黄酮醇合成的方法，其特征在于所述步骤4）具体为：利用试剂盒进行阳性鉴定，pcr程序为：98℃预变性3min；98℃变性10s，65℃退火10s，72℃延伸1min30s，30个循环；72℃延伸5min，1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，阳性植株开花后，采集花朵，液氮冷冻，-80℃保存，利用实时荧光定量pcr测定cnfls 反义f3’h双基因在阳性花朵中的相对表达量。
9.如权利要求1-8任一所述方法得到的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体。
10.如权利要求9所述的一种金花茶cnfls 反义f3’h双基因载体在促进植物黄酮醇合成中的应用。
技术总结