本发明涉及一种基于aip诱导的生物传感器及其应用，属于基因工程
技术领域：
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背景技术：
：来源于金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)的agr群体感应系统(agrqs)系统是目前研究最为透彻的群体感应系统，与s.aureus的致病性调控有关。agrqs系统主要包括编码信号分子前体的基因agrd，加工aip合成的基因agrb，传递aip浓度信号的agrc、agra双组份系统和效应启动子等主要组分。其利用c端含有环化硫酯键的自诱导肽(auto-inducingpeptide，aip)作为信号分子，成熟aip含有8个氨基酸。aip的合成随着s.aureus的生长同步进行，当s.aureus种群数量达到一定丰度时，高浓度的aip积累可以激活其受体蛋白agrc，agrc磷酸化转录因子agra，进一步激活下游一系列基因表达，增强s.aureus的致病性。因此，aip是s.aureus种群数量及致病性检测的一个关键指标。作为一种小分子肽，aip的检测比较困难，缺乏简便易行的方法。目前，需要进行复杂的提纯、浓缩，然后使用超高效液相色谱技术才能检测s.aureus产生的aip。利用基因表达调控元件(如启动子、转录因子、核糖开关和抗终止子)改造和构建生物传感器是检测生物活性物质的一种有效手段。例如，lummymariaoliveiramonteiro等通过改造arac转录因子，使其响应阿司匹林，并在大肠杆菌(escherichiacoli，e.coli)中构建阿司匹林生物传感器。该传感器有望在人体内通过服用阿司匹林来诱导抗肿瘤药物的合成，进而应用于肿瘤的生物治疗。(monteirolmo,arrudalm,sanches-medeirosa,etal.reverseengineeringofanaspirin-responsivetranscriptionalregulatorinescherichiacoli[j].acssyntheticbiology,2019,8(8).)alicjadaszczuk等通过dna微阵列技术高通量筛选枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis，b.subtilis)启动子，得到一系列枯草芽孢杆菌暴露于腐败肉类时上调表达的启动子，并利用上调表达幅度最高启动子psboa构建了可以检测肉类腐败程度的生物传感器。(daszczuka,dessalegney,drenth,ismaêl,etal.bacillussubtilisbiosensorengineeredtoassessmeatspoilage[j].acssyntheticbiology,2014,3(12):999-1002.)如何成功的构建一种灵敏度高、操作简单、成本低且稳定性高的生物传感器，用以检测样本中的aip的含量成为研究的难点，开发一种简单、快速、高效的检测样本中的自诱导多肽aip的含量的方法，对于临床上用于s.aureus种群数量及致病性检测均具有重要意义。技术实现要素：为了得到一种简单、快速、高效的检测样本中的自诱导多肽aip含量的方法，本发明首先提供了一种生物传感器，所述生物传感器含有启动子p3、启动子p43、agrc基因、agra基因和编码标记物的基因；所述启动子p43调控agrc基因和agra基因的表达，所述启动子p3调控编码标记物的基因表达，所述启动子p3上包含agra基因结合位点的序列。在本发明的一种实施方式中，所述agrc基因可感受aip浓度信号；所述agra基因受agrc磷酸化激活。在本发明的一种实施方式中，所述启动子p3、启动子p43、agrc基因、agra基因位于载体上，所述启动子p3和启动子p43转录方向相反。在本发明的一种实施方式中，所述启动子p3的核苷酸序列如seqidno.1所示。在本发明的一种实施方式中，所述启动子p43的核苷酸序列如seqidno.2所示。在本发明的一种实施方式中，所述agrc基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。在本发明的一种实施方式中，所述agra基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。在本发明的一种实施方式中，所述载体包括pht系列质粒、pma09系列质粒、pub系列质粒、pkor系列质粒。在本发明的一种实施方式中，所述标记物为荧光蛋白。本发明还提供了一种重组细胞，所述重组细胞以染色体上含有启动子p43、agrc基因和agra基因的细胞为宿主细胞，以含有启动子p3和标记物基因的质粒为表达载体；所述启动子p43调控agrc基因和agra基因的表达，所述启动子p3调控标记物基因表达，所述启动子p3上包含调控agra基因结合位点的序列。在本发明的一种实施方式中，所述标记物为荧光蛋白。在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。在本发明的一种实施方式中，所述启动子p3的核苷酸序列如seqidno.1所示。在本发明的一种实施方式中，所述启动子p43的核苷酸序列如seqidno.2所示。在本发明的一种实施方式中，所述agrc基因的核苷酸序列如seqidno.3所示。在本发明的一种实施方式中，所述agra基因的核苷酸序列如seqidno.4所示。在本发明的一种实施方式中，所述荧光蛋白sfgfp基因的核苷酸序列如seqidno.5所示。本发明还提供了一种构建上述重组细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将编码如seqidno.1所示的启动子p3和标记物基因依次连接在载体上，构建表达载体；(2)将编码核苷酸序列如seqidno.3所示的agrc基因和编码核苷酸序列如seqidno.4所示的agra基因依次连接在枯草芽孢杆菌的染色体上的启动子p43之后，构建宿主细胞；(3)将步骤(1)的载体导入步骤(2)的宿主细胞中得到重组细胞。在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌wb600、枯草芽孢杆菌wb800、枯草芽孢杆菌3na。本发明还提供了上述生物传感器，或上述重组细胞在检测自诱导多肽aip含量中的应用。本发明还提供了一种检测自诱导多肽aip含量的方法，所述方法为，将上述重组枯草芽孢杆菌接种至培养基中，培养菌体细胞，检测荧光蛋白表达量，通过荧光蛋白表达量的强弱检测自诱导多肽aip含量。在本发明的一种实施方式中，将上述重组枯草芽孢杆菌接种至含有相应抗性的lb固体培养基上划线，挑取单菌落接种至含有5mllb液体培养基的试管中，在200r·min-1，37℃培养12h，得到种子液；然后按2％(v/v)的接种量将种子液转接入含有5mllb液体培养基以及aip的试管中，在37℃，200rpm条件下培养。在本发明的一种实施方式中，所述自诱导多肽aip含量的检测限为0.01-1nm。在本发明的一种实施方式中，所述自诱导多肽aip含量的计算公式如下：其中y是荧光强度，x是aip浓度；本发明还提供了上述生物传感器，或上述重组细胞在制备检测含有自诱导多肽aip的产品中的应用。本发明还提供了一种aip的高通量检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)aip产生菌的构建；(2)aip产生菌的培养；(3)aip感应菌的培养；(4)aip的高通量检测。在本发明的一种实施方式中，步骤(1)aip产生菌的构建：构建含有agrd基因和agrb基因的重组质粒；将重组质粒转化至大肠杆菌jm109(de3)中，获得含有可生成aip的基因的重组菌。在本发明的一种实施方式中，步骤(2)aip产生菌的培养：挑取aip产生菌的单菌落接种至含有600μllb液体培养基的96孔板中，在37℃400rpm培养12h，得到种子液；分别将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至新的含有600μllb液体培养基的96孔板中，同时加入终浓度为1mm的iptg诱导aip的表达，在37℃，400rpm下培养12h。在本发明的一种实施方式中，步骤(3)aip感应菌的培养：按照上述重组细胞(即为aip感应菌)的构建方法构建aip感应菌；挑取aip感应菌的单菌落接种至含有600μllb培养基的96孔板中，在37℃400rpm培养12h，得到种子液；分别将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至新的含有600μllb液体培养基的96孔板中。在本发明的一种实施方式中，步骤(4)aip的高通量检测：向步骤(3)得到的含有种子液的96孔板中加入步骤(2)得到的培养好的aip产生菌，在37℃，400rpm条件下培养12h后；检测sfgfp表达荧光；取200μl细菌培养液至96孔黑壁透明底酶标板，放入synergytmh4荧光酶标仪检测od600和荧光。检测荧光时，激发光波长为485nm，吸收光波长为528nm。通过荧光强度检测aip含量。本发明还提供了一种aip突变体的高通量检测方法，所述方法的具体步骤同aip的高通量检测方法，区别在于，含有aip突变体的重组菌的构建方法：通过pcr方法向aip表达质粒上引入随机突变，并转化至大肠杆菌jm109(de3)中，获得含有不同aip突变体质粒的重组菌。有益效果(1)本发明将金黄色葡萄球菌agrqs中基因表达调控关键元件异源构建至枯草芽孢杆菌中，构建高性能的基于aip诱导的生物传感器。经测试，表明该系统可以高灵敏地响应0.01～1nm浓度范围的aip。(2)本发明通过构建aip突变体库，采用本发明提供的基于aip诱导的生物传感器可以检测哪些aip突变体依然保留激活功能，哪些突变导致aip失去功能；这对于研究aip序列和功能之间的关系具有重要作用。附图说明图1：aip生物传感器功能验证；其中，a：aip诱导sfgfp表达随时间变化；b：12h荧光强度和aip浓度非线性拟合。图2：aip高通量筛选示意图。图3：aip突变体库筛选。具体实施方式下述实施例中所涉及的培养基如下:lb固体培养基(l-1)：胰蛋白胨10g，nacl10g，酵母提取物5g，琼脂粉20g，ph7.0。lb液体培养基(l-1)：胰蛋白胨10g，nacl10g，酵母提取物5g，ph7.0。下述实施例中所涉及的制备方法如下：人工合成aip的方法：本发明中用于测试传感器检测效能的aip由上海科肽公司化学合成，其合成产品为冻干粉末状态。称取粉末溶于20mmtris-hcl(ph7)缓冲液中，终浓度为100mm，配制aip母液。并于-80℃条件下冷冻保存。使用时于冰上融化，并用20mmtris-hcl(ph7)缓冲液进行适当稀释。下述实施例中所涉及的检测方法如下：sfgfp荧光强度的检测方法：取200μl细菌培养液至96孔黑壁透明底酶标板，放入synergytmh4荧光酶标仪检测od600和荧光。检测荧光时，激发光波长为485nm，吸收光波长为528nm。下述实施例中所涉及的引物序列如下：表1基于aip诱导的生物传感器构建引物实施例1：含有agrc基因、agra基因的重组枯草芽孢杆菌的构建具体步骤如下：(1)以p43-agrca-p1/p43-agrca-p2为引物，以枯草芽孢杆菌168基因组dna为模板，扩增p43启动子序列。以p43-agr-ca-i1/p43-agr-ca-i2为引物，以pxyla-agrca-i质粒(公开于marchandn,collinsch.peptide-basedcommunicationsystemenablesescherichiacolitobacillusmegateriuminterspeciessignaling[j].biotechnologyandbioengineering,2013.)为模板，扩增得到agrc-agra基因片段，也即，扩增得到agrca基因片段。(2)以p43-agrca-v1/p43-agrca-v2为引物，以pbprpob-sfgfp质粒(公开于hanl,chenq,linq,etal.realizationofrobustandpreciseregulationofgeneexpressionbymultiplesigmarecognizableartificialpromoters[j].frontiersinbioengineeringandbiotechnology,2020,8.)为模板，扩增得到载体骨架。(3)然后通过gibsonassembly方法将步骤(1)和步骤(2)得到的片段进行无缝克隆，构建质粒pbp43-agrca。(4)以pint-agr-i1/pint-agr-i2为引物，以质粒pbp43-agrca为模板，扩增得到p43-agrca片段；以pint-agr-v1/pint-agr-v2为引物，以质粒pax01位模板，扩增得到载体骨架；将扩增得到p43-agrca片段和扩增得到载体骨架通过gibsonassembly方法无缝克隆，构建质粒paxp43-agrca。(5)用引物placa-up-1/placa-down-2扩增质粒paxp43-agrca上的“laca(核苷酸序列如的seqidno.6所示)上游同源臂-p43-agrca-laca下游同源臂”片段，并将该片段转化至枯草芽孢杆菌168中，经红霉素抗性筛选和菌落pcr鉴定，获得在laca位点整合有p43-agrca基因片段的重组枯草芽孢杆菌，并命名为bsca。实施例2：重组质粒的构建具体步骤如下：(1)以pp3-sfgfp-i1/pp3-sfgfp-i2作为引物，以pp-sfgfp质粒(公开于yanx,yuhj,hongq,etal.cre/loxsystemandpcr-basedgenomeengineeringinbacillussubtilis[j].applenvironmicrobiol,2008,74(17):5556-5562.)作为模板，扩增得到p3启动子。(2)以pp3-sfgfp-v1/pp3-sfgfp-v2作为引物，以pht-pawh-sfgfp质粒(公开于hanl,chenq,linq,etal.realizationofrobustandpreciseregulationofgeneexpressionbymultiplesigmarecognizableartificialpromoters[j].frontiersinbioengineeringandbiotechnology,2020,8.)作为模板，扩增sfgfp表达载体骨架。(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的片段通过gibsonassembly方法连接，构建得到重组质粒pht-p3-sfgfp。实施例3：生物传感器的构建及aip浓度的检测具体步骤如下：(1)将实施例2得到的重组质粒pht-p3-sfgfp转化至实施例1得到的bsca中，验证正确之后，得到重组枯草芽孢杆菌，即生物传感器，也即aip感应菌。(2)将步骤(1)得到的重组枯草芽孢杆菌接种至含有5mllb培养基的试管中，在200r·min-1，37℃条件下培养12h，得到种子液；然后按2％(v/v)的接种量将种子液转接入含有5mllb液体培养基的试管中，在37℃，200rpm条件下培养，同时向试管中加入不同浓度的人工合成的aip，检测sfgfp表达。结果如图1和表2所示，不加入aip时，荧光强度非常低，sfgfp仅有极少量的本底表达。随着aip添加浓度提升，sfgfp的表达量也明显提升。从结果得知，该系统能够响应非常宽的aip浓度范围(0.01-1nm)。并且，将sfgfp荧光强度和aip浓度进行非线性拟合，发现其能完美拟合酶促动力学的米氏方程，表明该传感系统能够非常精准地反映培养基中aip的浓度；所述自诱导多肽aip含量的计算公式如下：其中，y是荧光强度，x是aip浓度；表2aip诱导sfgfp表达的12h荧光强度aip浓度(nm)荧光强度(a.u./od600)0.0114760.05653410.11775870.153728110.25152410.257996790.39085360.359585190.410947210.4511771810.512527690.613126670.714212590.814645710.914360731.01509350实施例4：aip突变体库构建和高通量筛选总体思路如下：将金黄色葡萄球菌的agr群体感应系统中负责aip合成的主要元件agrd、agrb在大肠杆菌中表达，以得到aip产生菌。只需要对质粒上的agrd基因进行突变，便可获得各种aip突变体。成熟aip为8个氨基酸组成的环肽，氨基酸序列为“ystcdfim”，其中第四位的c和第八位的m通过硫酯键成环。该硫酯键为aip活性所必须，因此对除c和m以外的氨基酸位点进行突变体库的建立和筛选(如图2所示)。具体步骤如下：(1)构建pet28a-agrd-agrb质粒：使用引物ppet-agrd-i1/ppet-agrd-i2扩增pt7-agrbd-i质粒(公开于marchandn,collinsch.peptide-basedcommunicationsystemenablesescherichiacolitobacillusmegateriuminterspeciessignaling[j].biotechnologyandbioengineering,2013.)，获得核苷酸序列如seqidno.8所示的agrd片段；使用引物ppet-agrd-v1/ppet-agrd-v2扩增pet28a( )质粒，获得载体骨架；采用gibsonassembly方法连接agrd片段和载体骨架，将agrd克隆至pet28a( )载体中启动子pt7下游，构建得到质粒pet28a-agrd；使用引物ppet-agrb-i1/ppet-agrb-i2扩增pt7-agrbd-i质粒(公开于marchandn,collinsch.peptide-basedcommunicationsystemenablesescherichiacolitobacillusmegateriuminterspeciessignaling[j].biotechnologyandbioengineering,2013.)，获得核苷酸序列如seqidno.7所示的agrb片段；使用引物ppet-agrb-v1/ppet-agrb-v2扩增pet28a-agrd质粒，获得载体骨架；采用gibsonassembly方法将agrb片段和载体骨架连接，将agrb克隆至pet28a-agrd质粒中启动子plac下游，构建得到质粒pet28a-agrd-agrb；(2)使用表3中的引物扩增pet28a-agrd-agrb质粒，将随机突变分别引入y、s、t、d、f、i位点，转化至大肠杆菌jm109(de3)中，得到重组菌(aip产生菌)，构建对应的单位点随机突变体库。(3)分别挑取步骤(2)得到的aip产生菌的单菌落接种至含有600μllb液体培养基的96孔板中，在37℃400rpm培养12h，得到种子液；分别将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至至新的含有600μllb液体培养基的96孔板中，同时加入终浓度为1mm的iptg诱导aip的表达，在37℃400rpm下培养12h。(4)采用实施例3步骤(1)相同的方法制备得到的aip感应菌，挑取aip感应菌的单菌落接种至含有600μllb培养基的96孔板中，37℃400rpm培养12h，得到种子液；分别将种子液按照2％(v/v)的接种量接种至新的含有600μllb液体培养基的96孔板中，得到含有aip感应菌的培养液。(5)向步骤(4)得到的含有种子液的96孔板中加入步骤(3)得到的培养好的aip产生菌，在37℃，400rpm条件下培养12h后，得到培养液；检测sfgfp表达荧光：取200μl培养液至96孔黑壁透明底酶标板，放入synergytmh4荧光酶标仪检测od600和荧光；检测荧光时，激发光波长为485nm，吸收光波长为528nm。将培养好的aip产生菌培养液转移至含有aip感应菌的aip生物传感系统中进行aip活性筛选，结果见图3。如图3所示，该系统可以检测哪些aip突变体依然保留激活功能，哪些突变导致aip失去功能。这对于研究aip序列和功能之间的关系具有重要作用。构建突变体所用引物见表3。表3aip突变体库构建引物虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。sequencelisting<110>江南大学<120>一种基于aip诱导的生物传感器及其应用<130>baa201318a<160>8<170>patentinversion3.3<210>1<211>114<212>dna<213>人工序列<400>1ttaatattttaacataaaaaaatttacagttaagaataaaaaacgactagttaagaaaaa60ttggaaaataaatgcttttagcatgttttaatataactagatcacagagatgtg114<210>2<211>300<212>dna<213>人工序列<400>2tgataggtggtatgttttcgcttgaacttttaaatacagccattgaacatacggttgatt60taataactgacaaacatcaccctcttgctaaagcggccaaggacgctgccgccggggctg120tttgcgtttttgccgtgatttcgtgtatcattggtttacttatttttttgccaaagctgt180aatggctgaaaattcttacatttattttacatttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgc240gcgattatgtaaaatataaagtgatagcggtaccattataggtaagagaggaatgtacac300<210>3<211>1308<212>dna<213>人工序列<400>3atggtccaaactagtatggaattgttaaacagttacaactttgttttgttcgtattaact60caaatgatattaatgtttacaataccagctataattagtggtattaagtacagtaaactt120gattattttttcatcatagtaatttcgacattatcgttatttctatttaaaatgtttgat180agcgcgtccttaatcatattaacttcatttattattataatgtattttgtcaaaatcaaa240tggtattctattttgttgattatgacttcgcagattattctatactgtgctaactacatg300tatatagttatatatgcatatatcaccaaaatttctgatagtatatttgtaatattccct360agcttttttgtagtttatgtgactattagtatactattctcatatataataaatagagtt420ctcaaaaaaattagcacaccatatctaatactaaacaaaggatttttaatagttatttcg480actatcttactgcttactttttcattatttttcttttattcacaaataaactcggatgaa540gctaaagtaataaggcagtattcttttatttttattggtatcactatatttttaagtata600ttaacatttgttatttctcaatttctccttaaagagatgaaatataaacgtaatcaagaa660gaaattgaaacctattatgaatatacattgaagattgaagctatcaacaacgaaatgcgc720aagttccgtcatgattatgtcaatatcttaacgacactttcagaatacattcgagaagat780gacatgcctggcctacgtgattatttcaataaaaatattgtacctatgaaagacaattta840caaatgaatgctataaaattaaatggtatcgagaatcttaaagtacgtgaaattaaaggc900ttaattactgcgaaaattttacgtgcacaagaaatgaatattccgattagtatcgaaata960cccgatgaagtaagtagcattaacttgaatatgatcgatttaagtcgcagtattggtatt1020attcttgataatgcaattgaggcatcaactgaaattgatgaccctatcattcgcgttgca1080tttattgaaagtgaaaattcagtaacgtttattgttatgaataaatgcgctgatgatata1140ccacgcattcatgaattgttccaagaaagtttttctactaaaggtgaaggtcgtggttta1200ggtctatcaactttaaaagaaattgctgataatgcagacaatgtcttattagatacaatt1260atcgaaaatggtttctttattcaaaaagttgaaattattaacaactag1308<210>4<211>765<212>dna<213>人工序列<400>4atgaaaattttcatttgcgaagacgatccaaaacaaagagaaaacatggttaccattatt60aaaaattatataatgatagaagaaaagcctatggaaattgccctcgcaactgataatcct120tatgaggtgcttgagcaagctaaaaatatgaatgacataggctgttactttttagatatt180caactttcaaccgatattaatggtatcaaattaggcagtgaaattcgtaagcatgaccca240gttggtaacattattttcgttacgagtcacagtgaacttacctatttaacatttgtctac300aaagttgcagcgatggattttatttttaaagatgatccagctgaattaagaactcgaatt360atagactgtttagaaactgcacatacacgcttacaattgttgtctaaagataatagcgtt420gaaacgattgaattaaaacgtggcagtaattcagtgtatgttcaatatgatgatattatg480ttttttgaatcatcaacaaaatctcacagactcattgcccatttagataaccgtcaaatt540gaattttatggtaatttaaaagaactgagtcaattagatgatcgtttctttagatgtcat600aatagctttgtcgtcaatcgccataatattgaatctatagattcgaaagagcgaattgtc660tattttaaaaataaagaacactgctatgcatcggtgagaaacgttaaaaaaatataaatc720gaaaatggtttctttattcaaaaagttgaaattattaacaactag765<210>5<211>717<212>dna<213>人工序列<400>5atgagcaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggt60gatgttaatgggcacaaattttctgtccgtggagagggtgaaggtgatgctacaaacgga120aaactcacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccgtggccaacactt180gtcactactctgacctatggtgttcaatgcttttcccgttatccggatcacatgaaacgg240catgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctttc300aaagatgacgggacctacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgtt360aatcgtatcgagttaaagggtattgattttaaagaagatggaaacattcttggacacaaa420ctcgagtacaactttaactcacacaatgtatacatcacggcagacaaacaaaagaatgga480atcaaagctaacttcaaaattcgccacaacgttgaagatggttccgttcaactagcagac540cattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattac600ctgtcgacacaatctgtcctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtcctt660cttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcatggatgagctctacaaataa717<210>6<211>2064<212>dna<213>人工序列<400>6ctaatgtgtgtttacgacaattctcacttcatacttttccatcgtcaggtcgcctgacaa60tatgtctcctgtcattatgtccttcacactctgatcaaacgt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技术特征：1.一种生物传感器，其特征在于，含有启动子p3、启动子p43、agrc基因、agra基因和编码标记物的基因；
所述启动子p43调控agrc基因和agra基因的表达，所述启动子p3调控编码标记物的基因表达，所述启动子p3上包含agra基因结合位点的序列。
2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述启动子p3、启动子p43、agrc基因、agra基因位于载体上，所述启动子p3和启动子p43转录方向相反。
3.根据权利要求1或2所述的生物传感器，其特征在于，所述标记物为荧光蛋白。
4.一种重组细胞，其特征在于，以染色体上含有启动子p43、agrc基因和agra基因的细胞为宿主细胞，以含有启动子p3和标记物基因的质粒为表达载体；所述启动子p43调控agrc基因和agra基因的表达，所述启动子p3调控标记物基因表达，所述启动子p3上包含调控agra基因结合位点的序列。
5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，所述标记物为荧光蛋白；优选的，所述宿主细胞为枯草芽孢杆菌。
6.一种构建权利要求4或5所述的重组细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将编码如seqidno.1所示的启动子p3和标记物基因依次连接在载体上，构建重组载体；
(2)将编码核苷酸序列如seqidno.3所示的agrc基因和编码核苷酸序列如seqidno.4所示的agra基因依次连接在枯草芽孢杆菌的染色体上的启动子p43之后，构建宿主细胞；
(3)将步骤(1)的重组载体导入步骤(2)的宿主细胞中得到重组细胞。
7.权利要求1-3任一所述的生物传感器，或权利要求4或5所述的重组细胞在检测自诱导多肽aip含量中的应用。
8.一种检测自诱导多肽aip含量的方法，其特征在于，将权利要求4或5所述的重组细胞接种至培养基中，培养菌体细胞，检测荧光蛋白表达量，通过荧光蛋白表达量的强弱检测自诱导多肽aip含量。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述自诱导多肽aip含量的计算公式如下，其中y是荧光强度，x是aip浓度；
10.权利要求1-3任一所述的生物传感器，或权利要求4或5所述的重组细胞在制备检测含有自诱导多肽aip的产品中的应用。
技术总结本发明公开了一种基于AIP诱导的生物传感器及其应用，属于基因工程技术领域。本发明将agr群体感应系统感受AIP的关键组分异源构建至枯草芽孢杆菌168中，使其能够在AIP的诱导下表达绿色荧光蛋白sfGFP。利用该系统，可以通过sfGFP的表达荧光反应AIP的浓度。同时将AIP合成相关基因异源构建至大肠杆菌中，使得大肠杆菌能够合成分泌AIP，获得AIP产生菌。在AIP产生菌中建立AIP的突变体库，在AIP感应菌种筛选突变的AIP，实现AIP高通量突变和筛选。该系统能够方便地研究AIP不同位点突变对其功能的影响，并且获得具有不同特性的突变体AIP。
技术研发人员：周哲敏;韩来闯;崔文璟;程中一;刘中美;周丽;郭军玲
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2020.12.09
技术公布日：2021.03.12
