本发明涉及生物技术领域，具体地指一种辣根过氧化物酶基因作为报告基因的应用。
背景技术：
各种化学分子、多肽、蛋白质等生物活性分子，能通过结合细胞表面的相应受体激活或者抑制信号通路，完成生物学功能作用。这些生物学活性包括：促进靶细胞的增殖和分化，增强抗感染和细胞杀伤效应，促进或抑制其他细胞因子和膜表面分子的表达，促进炎症过程，影响细胞代谢等。这些生物活性分子已经广泛的应用到科研试剂和药物研发领域。因此，如何建立一个高效和稳定的生物活性分子的检测体系是科研和生产的关键。
报告基因(reportergene)编码着方便检测的蛋白质或酶的基因，可用于检测目的生物系统的变化，从而鉴定和并筛选得到需要的实验结果。根据不同信号通路特征的，在特定的信号通路的dna响应原件后加一个报告基因，在信号刺激的情况下，报告基因的表达会发生变化。常用的报告基因系统包括：荧光素酶基因(luc)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、绿色荧光蛋白基因(gfp)等。但是以上报告基因系统要么需要特殊的试剂和荧光读取仪器，要么成本比较高，要么不能肉眼观察，不方便实验。因此研发新的报告基因检测方法不仅可弥补其他检测方法的不足，而且有望获得更为简便可靠的检测方法，这对于客观评价生物活性分子的活性具有重要的意义。
辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，简称为hrp)存在于植物辣根中，在生物化学领域有着广泛地应用，主要是因为它具有将微弱信号放大及增强靶标分子可检测度的能力。hrp做成产品不但广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类(elisa)试剂盒。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种辣根过氧化物酶基因作为报告基因的应用，为鉴定转染试剂、化学分子、多肽、抗体、蛋白、抗体等的活性提供了新的思路，解决了现有检测方法耗时长、步骤繁杂、成本昂贵、敏感性较低等缺点。
为实现上述目的，本发明所提供的辣根过氧化物酶基因作为报告基因的应用，其步骤为：首先设定待鉴定目标物，根据目标物和所激活的信号通路，确定所述信号通路对应的启动子相应原件的dna，将所述原件的dna与hrp基因的联合基因克隆到表达载体里，然后转染细胞，再用单一或多种浓度的目标物处理转染后的细胞，激活信号通路，使hrp基因表达，之后再加入hrp的显色底物，进行定性或定量评价。
上述方案中，所述定量评价是通过多种浓度的目标物处理含有报告基因转染后的细胞，检测hrp显色底物的显色值，计算ec50值，以进行评价。
可选地，所述hrp的显色底物为tmb。
上述方案中，所述待鉴定目标物选自转染试剂、化学分子、多肽、抗体、蛋白、抗体中一种。
可选地，所述hrp基因的序列如基因库genbank中编号ans10151.1所示。
本发明还提供了一种基于hrp报告基因的活性鉴定载体，所述载体上包含预设的hrp基因，且hrp基因前设有可编辑的启动子插入位点。
本发明原理：由于hrp不存在于哺乳动物细胞和昆虫细胞里，我们就将hrp基因替代荧光素酶基因(luc)或者其他报告基因，转染到细胞，再用待检验的分子诱导细胞，能快速简便地鉴定该物质的活性。通过加hrp的底物显色，不但用肉眼就可以看到实验趋势，而且还可以通过酶标仪读取od450值，更精确得到待检测物质的活性。该方法不依赖荧光显微镜和化学发光的仪器，具有灵敏、简洁、成本低、高通量、适用范围广等优点。该方法可以扩大到转染试剂、化学分子、多肽、抗体、蛋白、抗体等生物试剂和活性物质的检测和鉴定。
hrp基因是gfp基因或luciferasereporter基因的替代，它作为报告基因的应用能快速简便地鉴定多种生化物质。与荧光素酶基因或绿色荧光蛋白相比，无需依赖荧光显微镜和化学发光的仪器材。本发明对仪器要求不高，能适用于普通的实验室，而且在很短的时间内，就可以肉眼观察到大致的信号差别，这样可以根据信号调整实验方案。因细胞因子的半最大效应浓度能够精确获得，所以hrp作为报告基因灵敏度极高。
本发明的有益效果：本发明操作过程简单快速，不依赖特定细胞，不依赖特殊培养基，不依赖荧光显微镜和化学发光的仪器，可以推广到更普通的生物学实验室，有很好的实用价值。由于使用报告基因细胞对少量的细胞因子引起的变化就能反映出来，这样就能节约成本。细胞通路变化比细胞生长或者毒性实验要快速，所以应用hrp报告基因能够节约使宝贵的实验时间。可以该方法为基础，做成检测细胞活性物质或转染试剂的试剂盒。
附图说明
图1为表达hrp报告基因的载体的结构示意图。包括上游的启动子和hrp报告基因等基本原件。
图2为以本发明方法检测humantnfα活性的ed50值。
图3为以生物学检测法检测humantnfα活性的ed50值。
图4为以本发明方法检测mousetnfα活性的ed50值。
图5为以本发明方法检测il-1β活性的ed50值
图6为以本发明方法检测各种转染试剂对哺乳动物细胞的转染效率。
图7为以本发明方法检测转染试剂对哺乳动物细胞hek293细胞的ec50值；其中a、b、c分别对应highgene、expi293、pei三种转染试剂。
图8为以本发明方法检测三种试剂对昆虫细胞sf9的转染效率。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述。以下实施例中采用的试剂或产品，未标明出处的均为市售，不用于限制本发明。
以下实施例为对本发明方法的验证。
hrp报告基因方法的具体实施方法如下：
1.信号通路选取：根据检测鉴定的生化物质来选取信号通路。
hek293是最常用的细胞。接着基因合成启动子和hrp基因序列(genbank:ans10151.1)。
2.重组质粒制备：将合成好的hrp基因片段克隆到用pcdna3.1或者类似的表达载体的多克隆位点上，然后用合成的特定的启动子序列换掉载体原先的启动子，将质粒转化扩大提取备用。
3.转染：准备好hek293细胞(也可以根据实验需要选取其他的细胞，进行尝试)。
按highgene(货号abclonalrm09014；abclonalscienceinc.产品)转染试剂使用说明进行转染，参照以下方法，根据实验情况合理调整：
1)第一天，在细胞培养六孔板中接种适量细胞(不同的细胞的接种密度不同，条件需要摸索)，使第二天转染时细胞密度能达到70％～90％(要控制好细胞密度，密度对转染效率和转染后细胞状态有很大影响)；
2)第二天，先取4μg质粒加入到盛有200μl无血清dmem基础培养基离心管中，吹打混合均匀，然后加入8μlhighgene转染试剂，吹打混合均匀(加入highgene后建议轻柔吹打)；
3)将200μl质粒/highgene转染试剂复合物均匀滴加到6孔细胞培养板孔中，轻轻晃动细胞培养板使其混合均匀；
4)细胞转染4～6小时后，半量更换新鲜完全培养基。
4.细胞处理：转染1天后，收取细胞进行细胞计数，按0.5×105个/孔接种96孔板，100μl/孔，过夜培养使细胞贴壁。
5.蛋白处理：将待测蛋白用转染所用细胞的培养基进行梯度稀释，最大浓度1μg/ml，10倍或5倍梯度稀释，稀释成9个梯度，设置一个无蛋白对照，每个梯度设置2～3个复孔，按100μl/孔加入稀释好的蛋白。
6.酶标仪检测：蛋白处理4h后[具体时间要根据不同蛋白摸索]，加入100μl/孔tmb显色液，或者离心，小心吸弃上清，边显色边观察，显色15min左右，加入50μl/孔终止液，用酶标仪检测od450(用od630作为参比波长)。
7.数据分析：用origin8将数据处理成图片，求出ec50值(ec50，半最大效应浓度是指能引起50％最大效应的浓度，也是引起50％个体有效的剂量)。
需要说明的是，上述具体操作步骤是本发明方法的一种实施方式，在理解本发明的基础之上，本领域技术人员可以采用其他相同或相似操作来替代其中的步骤，因此上述具体操作步骤不用于限制本发明的权利范围。
实施例1
tnf-α通过结合受体来激活nf-κb和mapk信号通路。这两个信号通路在hek293细胞都是存在的。nf-κb结合位点的dna序列作为启动子克隆在图2的载体上。
以本发明方法检测了humantnfα(abclonalrp00993_9692082805)的活性，得到的ed50为：23pg/ml(图2)；生物学检测法(细胞毒性实验)得到的ed50值为：20pg/ml(图3)。hrp报告基因方法得到的检测结果与细胞毒性实验检测法几乎完全一致，这充分说明了hrp报告基因方法的可行性以及结果的可靠性。而细胞毒性实验需要特殊的实验材料，一般实验室不容易获得。可见hrp报告基因的方法的优势。
实施例2
信号通路和启动子有一定的保守性。我们用重组小鼠的tnfα在人的细胞系hek293上验证nf-κb结合位点的dna序列的保守性。按照上述实验方案，我们用hrp报告基因的方法检测了检测了mousetnfa(abclonalrp01071_9693041602)的活性，得到的ed50为：0.23ng/ml(图4)。这说明跨物种的细胞因子也可以在相同的载体上使用，这样就将减少构建质粒的工作量。
实施例3
有些细胞因子的活性用生物学检测法以及免疫学检测法检测作用不明显时，就可以hrp报告基因的方法。
例如il-1β(abclonalrp00002_967201031)通过结合il-1r1受体激活下游nf-κb通路。按照上述实验案例1.采取hrp报告基因的方法，得到ed50:5.9pg/ml(图5)。而采用用细胞增值的检测法不明显。
实施例4
本发明还可以检验转染试剂在不同细胞里的转染率。能够通过精确的od值来衡量哪一种转染试剂适合哪一种细胞。并且能够精确测量ec50数值，摸索出最恰当的转染试剂或者质粒需要的量。
1)下面一个例子是探索哪一种转染试剂在哪一种哺乳动物细胞上转染效果最好。
将合成好的hrp基因片段亚克隆到用pcdna3.1(或者类似的哺乳动物表达载体的多克隆位点上)；质粒转化扩大提取备用。
我们分别用如下转染试剂highgene；expi293；pei。
(expi293:thermofisher,a14524expifectamine293transfectionkit)
转染对比如下3种细胞:hek293、hela、u2os。
按照上述实验方案，转染3天后弃上清，细胞加入tmb底物，可以得到如下结论
对于hek293细胞,highgene转染效率接近expi293转染试剂。
对于hela、u2os细胞highgene明显优于其他转染试剂。
结果如图6所示，其中bk组为blank无转染试剂的空白对照。
2)由于转染试剂都有价格上的差异，这样就要求在经济上衡量各种转染效率上有优势。我们接着探索在质粒量和细胞类型固定的情况下比较以上转染试剂最佳转染剂量(ec50数值)。
按照上述实验方案highgene,expi293和pei三种转染试剂对哺乳动物细胞hek293细胞实施转染。pcmv-hrp质粒都是：1μg,采取24孔板转染。转染试剂的浓度加入量依次为：0；0.0625；0.125；0.25；0.5；1；2；4；8；16μl，
转染两天后转移到96孔板中，每种细胞设置三个复孔，待细胞贴壁后加入tmb显色，大概反应15min左右，加入终止液终止反应，计算每种转染试剂的ec50。
结果如图7的a、b、c所示。
highgeneec50为：1.23μl；
expi293ec50为：4.35μl；
peiec50为：3.68μl。
结论是highgene的性价比远远优于expi293
实施例5
同样该发明可以用在其它没有hrp表达的细胞里，比如昆虫细胞sf9。
将合成好的hrp基因片段克隆到昆虫中间载体pfast(或者类似的表达载体的多克隆位点上)。启动子序列如附件序列所示。接着我们按照标准方法制备hrp的bacmid，抽取bacmid后。
1)我们分别用以下转染试剂highgene；expi293；pei转染昆虫细胞sf9。
安按照上述实验方案,转染7天后弃上清，细胞加入tmb底物，可以得到如下结论：
转染sf9细胞，highgene在3种转染试剂中最优，如图8所示，其中bk组为blank无转染试剂的空白对照。
本发明中提供的启动子序列仅为举例，不应用于限制本发明。
1.一种辣根过氧化物酶基因作为报告基因的应用，其步骤为：
首先设定待鉴定目标物，根据目标物和所激活的信号通路，确定所述信号通路对应的启动子相应原件的dna，将所述原件的dna与hrp基因的联合基因克隆到表达载体里，然后转染细胞，再用单一或多种浓度的目标物处理转染后的细胞，激活信号通路，使hrp基因表达，之后再加入hrp的显色底物，进行定性或定量评价。
2.根据权利要求1所述辣根过氧化物酶基因作为报告基因的应用，其特征在于：所述定量评价是通过多种浓度的目标物处理含有报告基因转染后的细胞，检测hrp显色底物的显色值，计算ec50值，以进行评价。
3.根据权利要求1所述辣根过氧化物酶基因作为报告基因的应用，其特征在于：所述hrp的显色底物为tmb。
4.根据权利要求1所述辣根过氧化物酶基因作为报告基因的应用，其特征在于：所述待鉴定目标物选自转染试剂、化学分子、多肽、抗体、蛋白、抗体中一种。
5.根据权利要求1所述辣根过氧化物酶基因作为报告基因的应用，其特征在于：所述hrp基因的序列如基因库genbank中编号ans10151.1所示。
6.一种基于hrp报告基因的活性鉴定载体，其特征在于：所述载体上包含预设的hrp基因，且hrp基因前设有可编辑的启动子插入位点。
技术总结