本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及一种利用基因组合转化制备稀有人参皂苷ck的方法及应用，具体涉及一种利用大肠杆菌共表达枯草杆菌α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶和双歧杆菌β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷rc制备稀有人参皂苷ck的方法。
背景技术：
：人参皂苷是人参中最重要的活性成分，人参皂苷属于四环三萜类化合物，根据其苷元上c-3、c-6和c-20位置的糖苷键(glycosidicbond)的种类和数量的不同，人参皂苷可分为达玛烷型和齐墩果酸型皂苷，其中达玛烷型皂苷又分为原人参二醇型皂苷(ppd型皂苷，主要包括包括rb1，rb2，rc和rd等)和原人参三醇类皂苷(ppt型皂苷，包括re和rg1等)。根据人参皂苷在植物中的含量高低分为主要人参皂苷(majorginsenoside，如rb1、rb2、rc、rd、re和rg1等)和稀有人参皂苷(rareginsenoside，如rg3、rh1、rh2、f1、f2、ck、c-o、cy和c-mc)等。迄今，在人参植物中已发现了100余种人参皂苷。但是，rb1、rb2、rc、rd、re和rg1占总皂苷的80％以上，这些主要的人参皂苷分子通常含有含3～4个糖基，由于其糖基多，很难被人体直接吸收，导致生理活性普遍比糖基少的稀有人参皂苷低。在目前已知的人参皂苷中，低糖基的人参稀有皂苷如f2、rg3、rh2和ck等在人体中的吸收率高。这些稀有人参皂苷在抗癌、抗肿瘤、抗血栓、提高免疫、抗炎、抗衰老、抗糖尿和抗焦虑、预防和缓解老年痴呆等方面具有重要的应用价值。研究表明人参皂苷ck具有很好的抗细胞突变、抑制肿瘤细胞转移、诱导肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤细胞耐药性和抗肿瘤诱导的血管生成等方面具有其它人参皂苷无法取代的独特优势。它与放疗和化疗结合试验，可以增强放疗和化疗的效果。除此之外，人参皂苷ck还有具有抗过敏和抗炎活性，并且可以起到神经保护作用，抗糖尿病作用和抗皮肤衰老作用。并且人参皂苷ck的药理活性具有多靶点、高活性和低毒性的特点。为了获得糖基含量低的高活性人参稀有皂苷，已有大量的利用肠道细菌、微生物和克隆酶转化等方面的研究报道。研究发现，人参皂苷ck是原人参二醇型皂苷在服用后，是人肠道内的最主要的代谢产物。而且大多数原人参二醇型皂苷只有被代谢为ck后才能被人体吸收，所以人参皂苷ck原人参二醇型皂苷在体内发挥药理作用的真正分子，而其它二醇型人参皂苷只是药物前体。虽然人参皂苷ck在人体中发挥十分重要的药理活性，但由于它们在自然界中含量极其稀少，通过传统的方法从人参等植物中分离变得十分困难，这对稀有人参皂苷ck的利用带来了很大限制。根据主要人参皂苷的结构看，和稀有人参皂苷的主要差异在于糖基的种类和位置不同。目前，关于稀有人参皂苷制备方面的研究，主要采用的是化学水解法和糖苷酶生物转化法。我们熟知的化学水解法选择性差、产率低、不易纯化、同时容易造成环境污染。利用生物体所产生的特定类型的糖苷酶转化制备稀有人参皂苷，具有选择性好、得率高、副产物少、无污染和易于规模化生产等优势。虽然生物转化的方法需要经历的途径比较复杂，但是可以获得化学法难以得到的稀有人参皂苷如ck。利用生物体所产生的糖苷酶转化生产稀有人参皂苷已进行了大量的研究，目前，主要集中在利用从土壤微生物、真菌等微生物中筛选菌株或酶来转化主要人参皂苷，研究和优化转化条件以实现较高水平的制备稀有人参皂苷。hong等通过筛选获得真菌monascuspilosuskmu103，利用其转化红参中人参皂苷，得到了一系列稀有人参皂苷，如rh1、rh2、rg3等。cheng等从土壤中筛选到caulobacterleidyiagp45，研究发现其中的β-葡萄糖苷酶可以将rb1转化为ck。liu等发现aspergillusniger中人参皂苷酶(ginsenosidase)属于糖苷酶的一种，可以经不同的途径将ppd型主要人参皂苷rb1、rb2、rc和rd转化为c-o、f2、c-mc、cy和ck等多种稀有人参皂苷。bae等采用肠道乳酸菌转化ppd型人参皂苷制备人参皂苷ck，结果发现运用双歧杆菌b.minimumkk-1和豚双歧杆菌b.choerinumkk-2共发酵转化rb1时效果最好，转化率可达到41％左右。尽管已有利用人参皂苷rb1生物转化法制取人参皂苷ck的相关报道。但是其转化效率较低，仍不能满足生产的要求。rc也是主要人参皂苷中含量较高的品种之一，如何将人参皂苷rc专一、高效转化制备成人参皂苷ck仍然是亟待解决的难题之一。利用双歧杆菌(bifidobacteriumbreve689b)和枯草芽孢杆菌所产生的糖苷酶在体外能够高效率转化人参皂苷rc为稀有人参皂苷ck的研究未见报道。该方法具有特异性高、成本低、反应条件温和、选择性高、安全性好的优点，是一种切实可行的生产稀有人参皂苷ck的方法。技术实现要素：本发明旨在克服现有的天然酶难以获取、单一酶活性不高、对人参皂苷等糖苷类化合物具有高度选择性、操作复杂等技术缺陷和不足，提供一种大肠杆菌共表达密码子优化的枯草杆菌α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶和双歧杆菌β-葡萄糖苷酶转化人参皂苷rc制备稀有人参皂苷ck的方法，该方法简单、高效和环保。为了达到上述目标，本发明提供的技术方案为：所述利用基因组合转化制备稀有人参皂苷ck的方法包括如下步骤：(1)将来自于枯草杆菌(bacillussubtilisstr.168)的α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶基因bsabfa进行密码子优化，得bsabfa-op基因；将来自于双歧杆菌(bifidobacteriumbreve689b)的β-葡萄糖苷酶基因bbbgl2进行密码子优化，得bbbgl2-op基因；并在bsabfa-op基因和bbbgl2-op基因之间插入internalribosomal-bindingsite(irbs)序列；其中，所述bsabfa基因序列如seqidno.1所示，所述bsabfa-op基因序列如seqidno.2所示，所述bbbgl2基因序列如seqidno.3所示，所述bbbgl2-op基因序列如seqidno.4所示，所述irbs序列如seqidno.5所示；(2)将在bsabfa-op基因和bbbgl2-op基因之间插入irbs序列后的基因序列连接至pet28a载体的bamhi和ecori酶切位点之间，获得含有bsabfa-op和bbbgl2-op基因的重组表达载体，命名为pet-bsabfa-bbbgl2-op，所述重组表达载体pet-bsabfa-bbbgl2-op的基因序列如seqidno.6所示；(3)将重组表达载体pet-bsabfa-bbbgl2-op转化至大肠杆菌bl21，然后通过卡那霉素筛选、pcr和测序检测，制备成含bsabfa-op和bbbgl2-op基因的重组菌；(4)将步骤(3)所得的重组菌37℃培养至od600为0.4-0.6时，以0.1-1.0mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导2-10小时，获得重组菌液；(5)将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为1-50g/l的人参皂苷rc底物溶液，然后将人参皂苷rc底物溶液与iptg诱导后的重组菌液按照体积比1：(1-10)混合，于ph4-6，30-50℃条件下反应12-24小时，置于70-80℃，优选为80℃水浴中灭活10-20min，优选为20min后，于室温(优选25℃)条件下离心10-15min，优选为12000rpm离心10-15min，取上清液，得到稀有人参皂苷ck。优选地，所述步骤(2)中，bsabfa-op和bbbgl2-op基因依次位于pet28a载体的t7启动子下游。优选地，所述步骤(4)中，重组菌液中的新鲜细胞浓度为10-40g/l，优选为20g/l。本发明还提供了一种用于制备稀有人参皂苷ck的重组表达载体，所述重组表达载体的基因序列如seqidno.6所示，命名为pet-bsabfa-bbbgl2-op。本发明还提供了一种用于制备稀有人参皂苷ck的重组菌，所述重组菌是将权利要求4所述的重组表达载体pet-bsabfa-bbbgl2-op转化至大肠杆菌bl21，然后通过卡那霉素筛选、pcr和测序检测后，制备而成的含bsabfa-op和bbbgl2-op基因的重组菌。所述重组菌表达的酶比单一组分的酶活性高，酶学性质分析显示共表达的酶最适反应ph为5.0，最适反应温度为40℃，在ph5-7范围内能保持较高活性，在30～50℃范围内，共表达的酶具有较高的温度稳定性，酶活维持在85％以上。下面对本发明作进一步说明：本发明所采用α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶(bsabfa)基因来自于枯草杆菌(bacillussubtilisstr.168)，β-葡萄糖苷酶(bbbgl2)基因来自于双歧杆菌(bifidobacteriumbreve689b)，根据大肠杆菌对密码子的偏好性、人参皂苷的结构特点、酶与底物结合模拟数据(图1和图2)，结果显示bsabfa与人参皂苷rc有良好的结合能力，并且具有良好的选择性，对bsabfa和bbbgl2基因进行了密码子优化，优化后的基因序列bsabfa-op(seqidn0.2)和bbbgl2-op(seqidn0.4)采用全基因合成的方法获得，在两个基因之间加入irbs序列，在串联一起的基因序列上下游分别加入bamhi和ecori酶切位点序列，通过酶切和连接、氯化钙法转化大肠杆菌top10，通过卡那霉素筛选、酶切和测序鉴定后，提取重组质粒(pet-bsabfa-bbbgl2-op)，氯化钙法转化大肠杆菌bl21，卡那霉素筛选后获得能高效表达重组酶(β-葡萄糖苷酶和α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶)的大肠杆菌。将含bsabfa-op和bbbgl2-op基因的重组菌，在37℃培养至od600为0.4-0.6时，以0.1-1.0mmol/l的异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导2-10小时，获得两种酶蛋白活性均比较高的重组菌液。该重组菌中生产的两种酶是通过密码子优化后的bsabfa-op和bbbgl2-op基因在同一细菌中所表达，且具有较高的酶活性，比共表达未优化的基因(bsabfa和bbbgl2)或单一基因优化(bsabfa-op或bbbgl2-op)后表达的酶活性高。β-葡萄糖苷酶和α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶均属于糖苷酶，两种糖苷酶在自然界中大量存在。但是，不同来源、即使同一来源且结构相似的β-葡萄糖苷酶或α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶的功能也有明显的差异，其底物糖苷键类型、底物的空间结构均会影响其对底物的转化能力(biotechnollett(2016)38:1775–1780.microbiology(2009),155,2739–2749.processbiochemistry(2010),45,1226–1235)。同时，酶促反应条件的不同也会对酶的活性和底物的转化能力产生很大影响。因而，很难根据一些已有的糖苷酶的活性去推测其它糖苷酶的功能，即使部分糖苷酶在原有的细胞中可能具有部分转化能力，但是当其在其它微生物中进行异源表达时，其生物活性具有明显的差异。一方面是受异源细胞的表达水平的影响，另一方面异源表达的酶活性不一定会达到最佳的状态，经常会难以发挥其特定的功能。在利用糖苷酶转化生产特定人参皂苷的研究中，发现具有转化人参皂苷的糖苷酶甚少，能够选择性转化人参皂苷rc为ck的更为稀少。即使少数具有人参皂苷转化活性的糖苷酶也因活性低等原因难以被应用。在本发明之前，尚未发现外源bsabfa基因和bbbgl2转化人参皂苷rc的研究。我们通过筛选和基因结构优化，证实经过密码子优化后的bsabfa基因和bbbgl2基因编码蛋白具有较高的转化人参皂苷rc活性，而且发现bsabfa-op和bbbgl2-op基因在大肠杆菌细胞中共表达生产两种酶，可以高效将人参皂苷rc转化为rd，最终将人参皂苷rd转化为稀有人参皂苷ck，本发明所采用的经过iptg诱导的含有bsabfa-op和bbbgl2-op基因的重组菌，与人参皂苷rc反应12小时，rc生成稀有人参皂苷ck的转化效率达到76％以上；与人参皂苷rc反应24小时，rc生成稀有人参皂苷ck的转化效率达到85％以上。由于细胞对转化的产物人参皂苷ck具有易吸收等优势，具有独特的药理作用，在临床上具有重要药用价值，本发明方法可以提升含人参皂苷rc的药物成分在医药市场的应用价值。总之，本发明利用双歧杆菌(bifidobacteriumbreve689b)和枯草芽孢杆菌所产生的糖苷酶在体外能够高效率转化人参皂苷rc为稀有人参皂苷ck。本发明具有特异性高、成本低、反应条件温和、转化周期短、催化效率高、选择性好、稳定性好、安全性好、副产物少和容易工业化生产等优点，是一种切实可行的生产稀有人参皂苷的方法。附图说明图1是人参皂苷rc与bsabfa蛋白分子对接结果；图2是人参皂苷rc与bsabfa蛋白分子结合的主要位点；图3是实施例1条件下从重组菌中提取得到的粗酶液及纯化后的酶采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果；图中，1表示提取的粗酶液，2和3表示镍柱亲和法分离纯化后的bsabfa和bbbgl2酶；m为蛋白质分子量标准；图4是实施例10和实施例14条件下重组菌转化人参皂苷rc的薄层色谱结果；图中，0h表示重组菌与人参皂苷rc反应0小时，12h表示重组菌与人参皂苷rc反应12小时，24h表示重组菌与人参皂苷rc反应24小时，s表示人参皂苷rc、rd、f2和ck对照品；图5是实施例10和实施例14条件下重组菌转化人参皂苷rc的高效液相色谱(hplc)结果；图中，12h表示重组菌与人参皂苷rc反应12小时，24h表示重组菌与人参皂苷rc反应24小时，s表示人参皂苷rc、rd、f2和ck对照品。具体实施方式实施例11、以luria-bertani(lb)液体培养基培养重组菌；其中lb培养基配制方法如下：取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl10g，加入适量的水溶解，待溶质溶解后，用5mol/l的氢氧化钠(naoh)调ph至7.0，再用去离子水定容至1l，121℃高压下蒸汽灭菌20min。2、所述重组菌发酵培养的具体方法为：将重组菌接种到含有50μg/ml卡那霉素的固体lb培养基上，在37℃条件下培养过夜(8-10小时)，然后挑取单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃条件下培养至吸光度od600为0.4-0.6，加入0.1-1mmol/l的iptg诱导2-10小时，得到重组菌发酵液。3、将重组菌发酵液4℃、8000rpm离心10min，弃上清液、收集菌体细胞，收集细胞分成两份，其中一份中加入新鲜液体lb培养基至细胞浓度为20g/l备用。另一部分细胞用ph6.5的pbs缓冲液洗涤菌体2次；用超声波细胞破碎仪冰上破碎30min，破碎条件：功率200w，超声时间2s，间隔时间3s，工作次数30次，超声破碎结束后，12000rpm，4℃离心20min，取上清得到粗酶液。粗酶液镍柱纯化，洗脱液为ph6.8的磷酸盐缓冲液，重复多次，分离得到纯化的重组酶，以聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析其分子量，bsabfa-op和bbbgl2-op分子量大小分别约为57kda和81kda(见图3)。图3是是实施例1条件下从重组菌中提取得到的粗酶液及纯化后的酶采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果；图中，1表示提取的粗酶液，2和3表示镍柱亲和法分离纯化后的bsabfa和bbbgl2酶；m为蛋白质分子量标准；与bsabfa(genbank数据库中序列号为al009126.3，2938330-2939832)和bbbgl2(genbank数据库中序列号为cp006715.1，1716905-1719178)预测蛋白的分子量比较，结果显示纯化的bsabfa和bbbgl2分子量大小分别与理论值(57kda和81kda)一致。4、重组酶活性测定folin-酚法测定分离纯化的蛋白质的含量，再测定两种重组酶的活性，测定bsabfa-op重组酶活性的具体方法为：以对-硝基苯-α-l阿拉伯呋喃糖苷(pnpa)为底物，对硝基苯酚(pnp)为产物测定酶的活性。取200μl重组酶，加入200μlpnpa(10mm)，ph6.5，55℃，孵育2小时后，加入等体积200mmna2co3，405nm测定pnp。1个酶活力单位(u)定义为1min释放1μmolpnp。结果显示α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶km值为3.45×10-3mol/l，α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶具有很强的催化活性。测定bbbgl2-op重组酶活性的具体方法为：以对-硝基苯基-β-d-葡糖苷(pnpg)为底物，对硝基苯酚(pnp)为产物测定酶的活性。取200μl重组酶，加入200μlpnpg(10mm)，ph6.5，55℃，孵育2小时后，加入等体积200mmna2co3，405nm测定pnp。1个酶活力单位(u)定义为1min释放1μmolpnp。结果显示β-葡萄糖苷酶km值为1.48×10-3mol/l，β-葡萄糖苷酶具有很强的催化活性。实施例2以实施例1中的培养方法制备含有bsabfa(seqidn0.1)和bbbgl2(seqidn0.3)基因(密码子均未优化)及在两个基因之间加入internalribosomal-bindingsite(irbs)序列(seqidn0.5)的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:2的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例3以实施例1中的培养方法制备仅含有bsabfa(seqidn0.1)基因(密码子未优化)的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:2的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例4以实施例1中的培养方法制备仅含有bbbgl2(seqidn0.3)基因(密码子未优化)的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:2的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例5以实施例1中的培养方法制备仅含有bsabfa-op(seqidn0.2)基因(密码子优化)的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:2的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例6以实施例1中的培养方法制备仅含有bbbgl2-op(seqidn0.4)基因(密码子优化)的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:2的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例7以实施例3和实施例4中的培养方法制备含有bsabfa和bbbgl2蛋白的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液(两种菌液质量比为1:1)；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:2的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例8以实施例5和实施例6中的培养方法制备含有bsabfa-op和bbbgl2-op蛋白的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液(两种菌液质量比为1:1)；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:2的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例9以实施例1中的培养方法制备含有pet-bsabfa-bbbgl2-op载体的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:1的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应12小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例10以实施例1中的培养方法制备含有pet-bsabfa-bbbgl2-op载体的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:2的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应12小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例11以实施例1中的培养方法制备含有pet-bsabfa-bbbgl2-op载体的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:3的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应12小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例12以实施例1中的培养方法制备含有pet-bsabfa-bbbgl2-op载体的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:4的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应12小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例13以实施例1中的培养方法制备含有pet-bsabfa-bbbgl2-op载体的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:1的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例14以实施例1中的培养方法制备含有pet-bsabfa-bbbgl2-op载体的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:2的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例15以实施例1中的培养方法制备含有pet-bsabfa-bbbgl2-op载体的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:3的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例16以实施例1中的培养方法制备含有pet-bsabfa-bbbgl2-op载体的重组bl21菌液，配制成细胞浓度为40g/l的菌液；将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为40g/l人参皂苷rc底物溶液再将人参皂苷rc溶液与重组菌液按照体积比1:4的比例混合，ph为5.0，40℃条件下反应24小时，然后置于80℃水浴中灭活20min，25℃条件下10000rpm离心10min，取上清液在60℃下烘干，得到稀有人参皂苷ck。实施例17hplc测定方法将实施例2-17中的诱导的菌与底物反应液与未加入菌液的底物反应液在25℃下8000rpm离心5min，取上清液在60℃下烘干，然后分别用适量的甲醇超声波溶解，以0.45μm滤膜过滤后，定容，hplc测定含量。根据反应底物和产物摩尔比例关系计算人参皂苷rc的转化率，计算结果如表1所示。hplc测定条件为：色谱柱为diamonsilc18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈-50mmol/l磷酸氢二钾/磷酸二氢钾10∶90(v/v)(磷酸调ph至4.0)；流速为1.0ml/min；柱温为30℃，检测波长为203nm。实施例10和14中，人参皂苷rc转化为ck的tlc结果见图4，图4中0h表示重组菌与人参皂苷rc反应0小时，12h表示重组菌与人参皂苷rc反应12小时，24h表示重组菌与人参皂苷rc反应24小时，s表示人参皂苷rc、rd、f2和ck对照品；结果显示在反应12小时后，人参皂苷rc多数转化为f2和ck，反应24小时后，人参皂苷rc转化为ck的进一步提升。实施例10和14中，人参皂苷rc转化为ck的hplc结果见图5，图5中12h表示重组菌与人参皂苷rc反应12小时，24h表示重组菌与人参皂苷rc反应24小时，s表示人参皂苷rc、rd、f2和ck对照品；结果显示在反应12小时后，人参皂苷主要转化为人参皂苷rd、f2和ck，反应24小时后，人参皂苷绝大部分转化为ck，表明该发明中的重组菌可以将人参皂苷rc经过rd，以及f2转化途径，最终转化为ck。综合上述实施例的结果表明，本发明所用的两个基因未优化的重组菌对人参皂苷rc转化为ck的转化率仅为32.4％(实施例2)；含有未优化或优化的单一基因重组菌均不能转化人参皂苷rc至ck(实施例3-6)；分别含有bsabfa和bbbgl2蛋白的重组菌液组合菌液对人参皂苷rc的转化率很低(39.6％，实施例7)；分别含有bsabfa-op和bbbgl2-op蛋白的重组菌液组合菌液对人参皂苷rc的转化率有明显的提升(54.1％，实施例8)；该发明中共表达密码子优化后的bsabfa-op和bbbgl2-op基因的重组菌可以转化人参皂苷rc为稀有人参皂苷ck，且转化率可以达到70-85％。所采用的方法操作简单、成本低、收率高，且绿色环保。本方法能实现稀有人参皂苷ck的产业化制备，能够满足医药和食品行业的市场需要，具有很高的市场应用价值。表1重组菌转化人参皂苷rc生成ck的转化率分析ck转化率(％)实施例232.4实施例30实施例40实施例50实施例60实施例739.6实施例854.1实施例973.2实施例1076.5实施例1171.4实施例1270.3实施例1382.4实施例1485.3实施例1584.4实施例1680.2序列表<110>湖南工程学院<120>一种利用基因组合转化制备稀有人参皂苷ck的方法及应用<141>2020-12-10<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1488<212>dna<213>null<400>1atgtctgaacatcaagcagtgattcaaacagatatcgcaaaaggaaccattaacaaaaat60atatacggtcattttgctgagcatttaggaagagggatttatgaggggatctgggtcgga120acggactcagacatccccaatatcaacgggatacgaaaggacgtgctggaggcgctcaaa180cagctgcacattcctgtccttaggtggccgggcgggtgttttgcggacgaataccattgg240gcaaacggtgtcggtgaccgtaagacaatgctgaacactcactggggcggtacaattgaa300tcaaatgaattcggaacgcatgaatttatgatgctttgcgagctgcttgaatgcgagcca360tatatttgcggcaatgtcggaagcggaaccgttcaggaaatgtcggagtggattgagtat420atgacatttgaagaaggcacgccgatgtcagactggagaaagcaaaatggaagagaagag480ccttggaagctgaaatatttcggcgtgggcaatgaaaactggggctgcggcggcaacatg540catcccgaatactacgcagatctgtaccggcgttttcagacttatgtccgcaattacagc600gggaatgacatttataaaattgcaggcggcgcaaatgtggatgattttaattggacggac660gtgcttatgaaaaaagccgctggcctgatggacgggttgagtcttcattattacacgatt720ccgggggatttctggaagggcaaaggatcagccacagaattcacggaagatgaatggttt780attacgatgaaaaaagccaaatacatcgatgaattgattcaaaaacacggcacgattatg840gaccggtacgatccggagcagcgggtcgggctgattattgatgaatggggcacgtggttt900gatcccgagccaggcacgaatcccggtttcttatatcagcaaaacaccattcgtgatgca960ctggtggcggcttctcatttccacattttccatcagcattgccgccgggtgcaaatggcc1020aacatcgcccaaacagtaaatgttcttcaagcgatgattttgactgagggagagcggatg1080cttttgacaccgacgtaccatgtattcaatatgtttaaggtgcaccaggacgcttctctt1140ttagccacagagacaatgtctgccgactatgaatggaacggtgaaacgcttccgcaaatc1200agcatttcagcgtcgaaacaagctgaaggcgatatcaatatcacaatttgcaacatcgat1260caccaaaacaaagcagaggcggaaatcgagctgaggggcctacacaaggcagcggaccat1320tccggagtcattcttacggcagaaaaaatgaatgcgcataacacgtttgacgatcctcat1380catgtcaaaccggaatccttcagacaatacacgctcagcaaaaacaaactgaaagtaaaa1440ctcccgccaatgtcagtcgtcttacttacgctgcgtgctgattcttaa1488<210>2<211>1503<212>dna<213>null<400>2atgaaaaaagcgcgaatgattgtagacaaagaatataaaatcggtgaagtagataaacgg60atttatggctcgtttatcgaacatatgggtcgtgcggtatatgaaggcatatacgagcct120gatcaccctgaagcggatgaagatggatttagaaaagatgtccagtcgctgatcaaagaa180ttacaggttcccatcatccgctatccgggcggaaactttttatccggatacaactgggag240gacggtgtcggaccagtcgaaaaccgcccgagacggcttgacttggcatggcaaacgaca300gaaaccaatgaagtgggaacaaatgaatttttatcttgggcaaaaaaggtgaacactgag360gtcaatatggccgtcaaccttggcacaagaggcatagatgccgcccgtaatctcgttgaa420tattgcaaccatccgaaaggctcttactggagtgatttaagaagatcgcatggctatgaa480cagccgtatggcatcaaaacatggtgcttaggaaacgaaatggatggaccatggcagatc540ggccacaaaacagctgatgaatacggacggcttgccgcagagacagcaaaggtcatgaag600tgggttgacccatcaattgaactcgttgcctgcggcagctcaaacagcggtatgccgacc660tttatcgattgggaagcgaaggtgcttgagcatacgtatgagcatgtcgactatatctct720cttcacacttactacggaaaccgggataacaatctgccaaactacttggcacgttctatg780gatttggatcattttatcaaatcagtcgctgcgacctgtgactatgtaaaagcaaaaaca840cgcagcaagaaaactatcaatctctctctggatgaatggaacgtctggtaccactcaaat900gaggctgataaaaaagtcgagccgtggatcactgcgcgtccgattttagaggatatttac960aattttgaagatgccttattagtcggctctctgctcattacgatgctgcagcacgcagac1020cgtgtgaaaattgcgtgtcttgcacagcttgttaatgtcatcgcgccgatcatgacggaa1080aaaggcggagaagcatggagacagccgattttctatccatacatgcatgcttctgtttac1140ggaaggggcgagtcactgaaaccgcttatttcttctcctaagtacgattgttctgatttc1200actgatgtgccatatgttgatgctgctgttgtgtactctgaagaggaagaaacactcact1260atttttgcggtaaacaaggctgaggatcagatggagacggagatttcgctcagaggcttt1320gaatcctaccaaatcgcagagcacatcgtacttgagc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技术特征：1.一种利用基因组合转化制备稀有人参皂苷ck的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将来自于枯草杆菌(bacillussubtilisstr.168)的α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶基因bsabfa进行密码子优化，得bsabfa-op基因；将来自于双歧杆菌(bifidobacteriumbreve689b)的β-葡萄糖苷酶基因bbbgl2进行密码子优化，得bbbgl2-op基因；并在bsabfa-op基因和bbbgl2-op基因之间插入irbs序列；其中，所述bsabfa基因序列如seqidno.1所示，所述bsabfa-op基因序列如seqidno.2所示，所述bbbgl2基因序列如seqidno.3所示，所述bbbgl2-op基因序列如seqidno.4所示，所述irbs序列如seqidno.5所示；
(2)将在bsabfa-op基因和bbbgl2-op基因之间插入irbs序列后的基因序列连接至pet28a载体的bamhi和ecori酶切位点之间，获得含有bsabfa-op和bbbgl2-op基因的重组表达载体，命名为pet-bsabfa-bbbgl2-op，所述重组表达载体pet-bsabfa-bbbgl2-op的基因序列如seqidno.6所示；
(3)将重组表达载体pet-bsabfa-bbbgl2-op转化至大肠杆菌bl21，然后通过卡那霉素筛选、pcr和测序检测，制备成含bsabfa-op和bbbgl2-op基因的重组菌；
(4)将步骤(3)所得的重组菌37℃培养至od600为0.4-0.6时，以0.1-1.0mmol/l的iptg诱导2-10小时，离心后再加入新鲜的lb培养基配制成重组菌液；
(5)将人参皂苷rc溶解于甲醇中，与ph4.0-6.0的醋酸-醋酸钠缓冲液混合，配制成浓度为1-50g/l的人参皂苷rc底物溶液，然后将人参皂苷rc底物溶液与iptg诱导后的重组菌液按照体积比1:(1-10)混合，于ph4-6，30-50℃条件下反应12-24小时，置于70-80℃水浴中灭活10-20min后，于室温条件下离心10-15min，取上清液，得到稀有人参皂苷ck。
2.如权利要求1所述的利用基因组合转化制备稀有人参皂苷ck的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，bsabfa-op和bbbgl2-op基因依次位于pet28a载体的t7启动子下游。
3.如权利要求1所述的利用基因组合转化制备稀有人参皂苷ck的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，重组菌液中的新鲜细胞浓度为10-40g/l。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的基因序列如seqidno.6所示，命名为pet-bsabfa-bbbgl2-op。
5.如权利要求4所述的重组表达载体在制备稀有人参皂苷ck中的应用。
6.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4所述的重组表达载体pet-bsabfa-bbbgl2-op转化至大肠杆菌bl21，然后通过卡那霉素筛选、pcr和测序检测后，制备而成的含bsabfa-op和bbbgl2-op基因的重组菌。
7.如权利要求6所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌表达的酶在ph5-7、30～50℃条件下，酶活维持在85％以上。
8.如权利要求6所述的重组菌在制备稀有人参皂苷ck中的应用。
技术总结本发明公开了一种利用基因组合转化制备稀有人参皂苷CK的方法及应用。本发明利用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis str.168）和双歧杆菌（Bifidobacterium breve 689b）的基因所产生的糖苷酶在体外能够高效率转化人参皂苷Rc为稀有人参皂苷CK。
技术研发人员：张儒;谭时泉;张变玲
受保护的技术使用者：湖南工程学院
技术研发日：2020.12.10
技术公布日：2021.03.12
