本发明涉及生物医药基因治疗技术领域，更具体的说是涉及一种编码胞浆羧肽酶类蛋白5的agbl5核苷酸序列及其应用。
背景技术：
agbl5编码胞浆羧肽酶类蛋白5(cytosoliccarboxypeptidase-likeprotein5)，又称为ccp5。其属于金属羧肽酶，介导蛋白质的脱谷氨酸化修饰。agbl5属于ccp类蛋白家族，能够特异性地催化诸如微管蛋白的翻译后谷氨酸化所产生的分支点谷氨酸侧链的去谷氨酸化。它不能作为一种长链去谷氨酸酶来缩短长聚谷氨酸链，这是一个由agtpbp1、agbl1、agbl2、agbl3和agbl4催化的过程。由于agbl5是ccp类蛋白家族中唯一能够识别分支谷氨酸化位点的酶，所以它在体内的缺失可能无法由同工酶来弥补功能。agbl5同时还介导cgas的脱糖化，调节cgas的抗病毒活性。
agbl5突变会引起视网膜色素变性75(rp75)，rp75是一种视网膜营养不良，属于色素性视网膜病。视网膜色素变性的特征是在眼底检查时可见视网膜色素沉积，视杆细胞原发性丢失，视锥细胞继发性丢失。患者通常有夜盲症和中周边视野丧失。随着病情的发展，患者失去远周边视野，最终也失去中心视力。同时，rp75遗传为常染色体隐性遗传。
agbl5催化微管蛋白的去谷氨酸化修饰，微管蛋白在视网膜各组织细胞中广泛分布。例如视细胞中的运输纤毛含有大量微管蛋白，对视细胞外节段的物质更新起重要作用，因此agbl5缺陷对视网膜中含有微管蛋白结构的维持具有重要意义。由agbl5突变引起的rp75症状主要表现为视细胞退化，除了外节段的代谢更新受影响外，视网膜各细胞层各类型的细胞中微管蛋白功能的异常也会影响整体微环境的变化，最终造成视细胞受损。
天然存在的aav血清型通常无法在玻璃体腔一侧转导视网膜组织细胞，因为存在内限膜、神经胶质细胞等阻止aav病毒粒子扩散的屏障。通过构建aav2衣壳蛋白编码序列文库，在loop4的位置插入随机7氨基酸序列，将突变的血清型注入小鼠玻璃体腔进行筛选，富集到一种主要的突变亚型，称为aav2/2-7m8，即aav2～588lalgettrp。aav2/2-7m8血清型具有很强的视网膜组织趋性，该血清型包装的荧光报告蛋白通过玻璃体腔注射小鼠眼部，能够在整个视网膜中检测到荧光。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种编码胞浆羧肽酶类蛋白5的agbl5核苷酸序列，使得所述核苷酸序列经过密码子使用偏好、dna重复序列、mrna二级结构、gc含量等多个参数的优化，可以使agbl5表达效率更高；
本发明的另外一个目的在于提供承载上述核苷酸序列的病毒载体，并具备预防或治疗agbl5突变导致视网膜色素变性的作用；
本发明的另外一个目的在于提供包含上述病毒载体或核苷酸序列的药物制剂，并具备预防或治疗agbl5突变导致视网膜色素变性的作用；；
本发明的另外一个目的在于提供上述核苷酸序列、病毒载体以及药物制剂在预防或治疗agbl5突变导致视网膜色素变性领域的中相关应用，包括但不限于相关药品、试剂的制备以及预防或治疗方法中的应用；
本发明的另外一个目的在于提供上述药物制剂的递送方法，将所述药物制剂注射至眼部如视网膜下或玻璃体腔注射。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种编码胞浆羧肽酶类蛋白5的agbl5核苷酸序列，其与seqidno:3所示核苷酸序列有≥95％相同性。
作为优选，其与seqidno:3所示核苷酸序列有≥98％相同性；进一步优选地，其与seqidno:3所示核苷酸序列有≥99％相同性；在本发明具体实施方式中，其序列如seqidno:3所示。
作为优选，所述核苷酸序列为cdna序列。
同时，本发明还提供了一种病毒载体，其包含有本发明所述核苷酸序列。
作为优选，所述病毒载体为腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体；在本发明具体实施方式中，本发明采用腺相关病毒载体，所述腺相关病毒载体的血清型为aav2野生型或aav2/2.7m8。
更具体地，所述病毒载体由启动子cmv(序列如seqidno:4所示)调控agbl5蛋白的表达。
此外，本发明还提供一种药物制剂，包含本发明所述的核苷酸序列或本发明所述的病毒载体。
作为优选，所述药物制剂为液体制剂；所述药物制剂还可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明对agbl5cdna序列进行密码子优化(codonoptimization)得到coagbl5，对优化前后的序列wtagbl5/coagbl5进行细胞水平表达效率检测，发现优化后的序列表达效率显著提高。然后使用aav-agbl5质粒转染hek293细胞，验证agbl5蛋白表达在体外的有效性。同时对agbl5敲除的小鼠进行玻璃体腔注射aav-agbl5，可在小鼠的视网膜中检测到agbl5表达。6个月后检测小鼠视网膜微管蛋白谷氨酸化程度，发现和对照aav处理相比，aav2-agbl5处理的小鼠视网膜微管蛋白谷氨酸化程度显著降低。证明aav2-agbl5药物具有预防或治疗视网膜色素变性的作用。
基于上述各项优异的技术效果，本发明提出了如下相关应用：
本发明所述核苷酸序列在制备预防或治疗agbl5突变导致的眼部疾病的病毒载体或药物制剂中的应用，或在预防或治疗agbl5突变导致的眼部疾病中的应用；
本发明所述病毒载体在制备预防或治疗agbl5突变导致的眼部疾病的药物制剂中的应用，或在预防或治疗agbl5突变导致的眼部疾病中的应用；
本发明所述的药物制剂在预防或治疗agbl5突变导致的眼部疾病中的应用。
其中，所述agbl5突变导致的眼部疾病为agbl5突变导致视网膜色素变性。
本发明还对应提供了一种本发明所述药物制剂的递送方法，将所述药物制剂注射至眼部，比如注射到视网膜下位置或玻璃体腔位置。
由以上技术方案可知，本发明证实密码子优化后的agbl5编码序列表达蛋白的效率要高于野生型序列，使用aav-agbl5药物处理可以显著改善agbl5突变导致agbl5敲除小鼠的视网膜病理症状的改善。玻璃体腔注射aav-agbl5药物，agbl5可以在视网膜各组织层高效表达，并且改善视网膜微管蛋白高度谷氨酸化，恢复微管蛋白在视网膜各类别细胞中的正常功能。因此aav-agbl5药物具有预防或治疗视网膜色素变性的作用。
附图说明
图1-图3所示为wtagbl5和coagbl5序列比对；优化后差异性的密码子序列加粗并用下划线标注；
图4所示为aav-coagbl5载体图谱(a)和aav-wtagbl5载体图谱(b)；载体包含aav25’itr，cmv启动子，密码子优化后的agbl5cdna或野生型agbl5cdna，bghpolya序列和aav23’itr；
图5所示为aav-coagbl5和aav-wtagbl5质粒在hek293细胞中的表达效率；
a：在hek293细胞中分别转染aav-coagbl5和aav-wtagbl5质粒，48小时后裂解细胞，westernblot检测agbl5蛋白表达水平；
b：aav-coagbl5和aav-wtagbl5质粒转染hek293细胞表达agbl5蛋白相对丰度；
图6所示为aav-coagbl5表达蛋白的功能验证；将aav-coagbl5质粒与aav-gfp质粒分别转染hek293细胞，48小时后裂解细胞，将裂解产物与猪脑组织微管蛋白37℃共同孵育5h，终止反应后利用westernblot检测药物组和对照组中猪脑组织微管蛋白中谷氨酸化蛋白的含量；
图7所示为aav2/2.7m8-coagbl5(图中aav-coagbl5)病毒玻璃体腔注射后，视网膜agbl5基因表达检测；将aav2/2.7m8-coagbl5病毒对agbl5敲除小鼠进行玻璃体腔注射，注射16周后取小鼠视网膜利用westernblot进行agbl5蛋白表达检测；
图8所示为aav2/2.7m8-coagbl5(图中ko-aav-coagbl5)病毒处理后，小鼠视网膜谷氨酸化微管蛋白平均长度检测；注射后16周取agbl5敲除小鼠的药物注射眼和对照眼视网膜，进行免疫荧光染色，对谷氨酸化微管蛋白平均长度进行定量分析。
具体实施方式
本发明公开了一种编码胞浆羧肽酶类蛋白5的agbl5核苷酸序列及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述核苷酸序列及其应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的核苷酸序列及其应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
aav2/2.7m8-coagbl5药物可以有效的在视网膜细胞表达agbl5，修复患者因为agbl5突变造成的视网膜疾病，agbl5的cdna编码的蛋白序列参见seqidno:1所示，野生型的agbl5cdna序列参见seqidno:2所示。
本发明通过优化密码子使用偏好，dna重复序列，mrna二级结构，gc含量等多个参数，得到了和wtagbl5序列显著不同的优化序列coagbl5(图1-3)。把wt/coagbl5序列构建到aav载体(图4)，然后在hek293细胞中转染相同量的质粒，并检测agbl5基因的表达，发现序列优化后的agbl5蛋白表达水平更高(图5)，证明密码子优化使agbl5在翻译水平提高了效率，为细胞提供更多的正常功能的蛋白，从而更好地弥补基因突变造成的缺陷。
本发明不仅证实了密码子优化的agbl5在体外表达效率优于野生型序列，同时还通过体外的酶活实验确认了agbl5蛋白的功能，为了进一步验证aav2/2.7m8-coagbl5药物在体内的有效性，本发明包装了aav2/2.7m8血清型的agbl5病毒药物，对agbl5敲除小鼠进行了玻璃体腔注射药物，观察体内实验结果。实验结果说明药物注射后治疗眼视网膜中微管蛋白去谷氨酸化程度较高，改善了因agbl5缺陷引起的蛋白修饰病变。
综合以上结果，本发明证明了aav2/2.7m8-coagbl5基因治疗药物对agbl5突变引起的视网膜色素变性的治疗作用，为进一步的临床应用开发奠定了基础。
下面结合实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：密码子优化的agbl5载体构建和表达验证
(1)质粒载体构建
1.将aav-cmv质粒骨架，coagbl5片段和wtagbl5片段分别同时用hindiii与xhoi双酶切，然后将酶切后的片段分别于骨架进行连接。
2.连接产物转化大肠杆菌，挑取单菌落进行酶切验证与测序验证。
(2)细胞转染
1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90％。
2.对于每孔细胞，使用50μl无血清dmem培养基稀释0.8μg-1.0μgdna。
3.对于每孔细胞，使用50μldmem培养基稀释1μl-3μllipofectamine2000试剂。lipofectamine2000稀释后，在5分钟内同稀释的dna混合。
4.混合稀释的dna和稀释的lipofectamine2000在室温保温20分钟。
5.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
6.在37℃，5％的co2中培养48小时。
7.弃掉培养基后用pbs冲洗，胰酶消化后离心收集细胞待用。
(3)westernblot
1.蛋白样品制备，按1:100的比例在裂解液中加入pmsf(按用量现配现用)。
2.使用强裂解液裂解细胞。
3.使用bca法测定蛋白浓度。
4.电泳
a、根据所检测蛋白大小配制相应的分离胶(5ml/块)，待分离胶凝固。
b、配制5％的浓缩胶(2ml/块)，加满玻璃板，插入梳子。
c、将5μl预染蛋白质分子markersds-page加入加样孔内，使用1x的sds-page蛋白上样缓冲液10μl上样到样品孔边上的空白加样孔内。
5.转膜
将转膜白夹子上面放上湿的垫层，垫层上面铺三张叠在一起的湿滤纸，滤纸上面依次放置湿pvdf膜、胶、滤纸、垫层、黑夹板，将装好的夹板放入装有转膜缓冲液的电泳槽，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
6.封闭
转膜完毕后，漂洗1-2分钟，用滴管吸尽缓冲液，加入5％的脱脂奶粉，在侧摆摇床上缓慢摇动，室温封闭15-60min。加入tbs洗涤液洗涤5分钟。共洗涤3次。
7.一抗孵育
按照比例使用5％的脱脂奶粉/pbs 2％bsa稀释适量的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜或室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。孵育后洗涤。
8.二抗孵育
加入稀释好的二抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育40min-1h。孵育后洗涤。
9.蛋白检测
使用ecl类试剂来检测蛋白，各取1ml混匀后，滴加在蛋白膜表面，避光孵育1-2min。用镊子将蛋白膜整齐的摆放在塑料纸上，放入凝胶成像仪上曝光。结果如图5a、图5b所示，序列优化后的agbl5蛋白表达水平更高，证明密码子优化使agbl5在翻译水平提高了效率，为细胞提供更多的正常功能的蛋白，从而更好地弥补基因突变造成的缺陷。
实施例2：aav介导的agbl5在体外细胞表达与功能验证
(1)细胞转染
1.转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90％。
2.对于每孔细胞，使用50μl无血清dmem培养基稀释0.8μg-1.0μgdna。
3.对于每孔细胞，使用50μldmem培养基稀释1μl-3μllipofectamine2000试剂。lipofectamine2000稀释后，在5分钟内同稀释的dna混合。
4.混合稀释的dna和稀释的lipofectamine2000在室温保温20分钟。
5.直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。
6.在37℃，5％的co2中保温24-48小时。
7.在细胞中加入复合物24-72小时后裂解细胞。
(2)微管蛋白谷氨酸化检测
1.细胞裂解产物4℃，40000g离心20分钟。
2.取上清液20ul与1ug猪组织微管蛋白37℃孵育5小时。
3.利用金属羧肽酶抑制剂终止反应。
(3)westernblot
1.以上反应产物与上样buffer95℃变性5分钟。
2.电泳
a、根据所检测蛋白大小配制相应的分离胶(5ml/块)，待分离胶凝固。
b、配制5％的浓缩胶(2ml/块)，加满玻璃板，插入梳子。
c、将5μl预染蛋白质分子markersds-page加入加样孔内，使用1x的sds-page蛋白上样缓冲液10μl上样到样品孔边上的空白加样孔内。
3.转膜
将转膜白夹子上面放上湿的垫层，垫层上面铺三张叠在一起的湿滤纸，滤纸上面依次放置湿pvdf膜、胶、滤纸、垫层、黑夹板，将装好的夹板放入装有转膜缓冲液的电泳槽，把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
4.封闭
转膜完毕后，漂洗1-2分钟，用滴管吸尽缓冲液，加入5％的脱脂奶粉，在侧摆摇床上缓慢摇动，室温封闭15-60min。加入tbs洗涤液洗涤5分钟。共洗涤3次。
5.一抗孵育
按照比例使用5％的脱脂奶粉/pbs 2％bsa稀释适量的一抗，4℃缓慢摇动孵育过夜或室温在侧摆摇床上缓慢摇动孵育2h。孵育后洗涤。
6.二抗孵育
加入稀释好的二抗，室温侧摆摇床上缓慢摇动孵育40min-1h。孵育后洗涤。
7.蛋白检测
使用ecl类试剂来检测蛋白，各取1ml混匀后，滴加在蛋白膜表面，避光孵育1-2min。用镊子将蛋白膜整齐的摆放在塑料纸上，放入凝胶成像仪上曝光。
结果见图6，将aav-coagbl5质粒与aav-gfp质粒分别转染hek293细胞，48小时后裂解细胞，将裂解产物与猪脑组织微管蛋白37℃共同孵育5h，终止反应后利用westernblot检测实验组和对照组中猪脑组织微管蛋白中谷氨酸化蛋白的含量，结果发现实验组中gt335抗体特异性结合的蛋白含量显著降低，polye抗体特异性结合的蛋白与对照组无差异(图6)。gt335抗体能够特异性结合微管蛋白谷氨酸化的分支位点，实验组和对照组gt335免疫反应的差异说明实验组中微管蛋白谷氨酸化分支位点被部分降解；polye抗体特异性识别长链谷氨酸，实验组和对照组polye免疫反应无差异，说明长链谷氨酸未被降解。而agbl5的功能正是特异性催化微观蛋白的分支点去谷氨酸化修饰，以上结果证明了aav-coagbl5在体外细胞表达的蛋白能够行使正确的功能。
实施例3：aav2/2.7m8-coagbl5基因治疗药物改善小鼠视网膜微管蛋白谷氨酸化异常
(1)病毒包装，病毒药物注射小鼠
1.聚合度90％以上的hek293t细胞按1：3比例传盘。
2.转质粒前1-2h左右，换成无血清培养基，用转染试剂将目的基因质粒和辅助质粒(包含aav2.7m8血清型元件)转入hek293t中。
3.质粒转化24h后，换新的无血清培养基
4.转染72h收毒。带着培养基，吹下细胞，离心；然后分别收获培养基上清与细胞沉淀。用peg8000沉淀培养基上清中的病毒，沉淀过夜后收集病毒沉淀。
5.将病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度离心进行纯化，然后用超滤管进行浓缩。
6.构建agbl5敲除小鼠。
7.准备好5*1012vg/ml的aav2/2.7m8-coagbl5药物和aav2/2.7m8-gfp。
8.将1ul/眼的aav2/2.7m8-coagbl5药物和aav2/2.7m8-gfp病毒通过玻璃体腔注射进入6-8周龄小鼠眼内。
9.在小鼠16周龄时，处死小鼠，将小鼠视网膜组织分离。
(2)视网膜组织免疫荧光染色
1.取视网膜组织制片，用0.01mpbs冲洗5min×3次。
2.滴加10％正常山羊血清37℃封闭45min。
3.吸去多余液体，加入一抗(1：100)，放入湿盒中，37℃1h后置于4℃冰箱中过夜(保持在湿盒中)。
4.0.01mpbs冲洗5min×3次。
5.在黑暗条件下加入二抗(1：200)，37℃温育45min。
6.在黑暗条件下吸弃二抗(注：不再冲洗)，加入dapi染液，室温作用20min。
7.在黑暗条件下0.01mpbs冲洗5min×6次。
8.在黑暗条件下用防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜下观察。
前述实施例已经证实了密码子优化的agbl5在体外表达效率优于野生型序列，同时通过体外的酶活实验确认了agbl5蛋白的功能，为了进一步验证aav2/2.7m8-coagbl5药物在体内的有效性，本实施例包装了aav2.7m8血清型的agbl5病毒药物，对agbl5敲除小鼠进行了玻璃体腔注射药物，观察体内实验结果。首先，取小鼠视网膜组织提取蛋白对agbl5在小鼠眼部表达进行检测，发现药物注射眼中(aav-coagbl5)能够检测到agbl5蛋白而对照眼中(aav-gfp)检测不到agbl5的表达(图7)，说明aav2.7m8血清型适用于玻璃体腔注射，并能够正确传递药物到小鼠视网膜组织。随后小鼠的眼部组织被用来进行视网膜免疫染色分析，对谷氨酸化微管蛋白的定量分析表明，治疗眼的谷氨酸化微管蛋白长度明显小于对照眼(图8)，说明药物注射后治疗眼视网膜中微管蛋白去谷氨酸化程度较高，改善了因agbl5缺陷引起的蛋白修饰病变。
综合以上各实施例结果，本发明证明了序列优化后的agbl5蛋白表达水平更高，证明密码子优化使agbl5在翻译水平提高了效率，为细胞提供更多的正常功能的蛋白，从而更好地弥补基因突变造成的缺陷；aav2/2.7m8-coagbl5基因治疗药物对agbl5突变引起的视网膜色素变性有明显的治疗作用，为进一步的临床应用开发奠定了基础。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>武汉纽福斯生物科技有限公司
<120>一种编码胞浆羧肽酶类蛋白5的agbl5核苷酸序列及其应用
<130>mp2032069
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>886
<212>prt
<213>agbl5蛋白质序列(agbl5protein)
<400>1
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<210>2
<211>2661
<212>dna
<213>野生型的agbl5cdna序列(wildtypeagbl5cdna)
<400>2
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gccctgaccagtggcattgcctcttcccctgactatgaattcaacgtgtggacccgacca180
gactgtgctgaaacggaatttgagaatgggaacaggtcatggttctacttcagcgtccgg240
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<210>3
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<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
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tatagtcggggtcctctggggcaaccagaagtatgtttcgtccctaaatctccaccactg2640
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<210>4
<211>203
<212>dna
<213>cmv启动子序列(cmvpromoter)
<400>4
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gggaggtctatataagcagagct203
1.一种编码胞浆羧肽酶类蛋白5的agbl5核苷酸序列，其特征在于，其与seqidno:3所示核苷酸序列有≥95％相同性，优选地与seqidno:3所示核苷酸序列有≥98％相同性，更优选地与seqidno:3所示核苷酸序列有≥99％相同性。
2.根据权利要求1所述核苷酸序列，其特征在于，其序列如seqidno:3所示。
3.根据权利要求1或2所述核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列为cdna序列。
4.权利要求1-3任意一项所述核苷酸序列在制备预防或治疗agbl5突变导致的眼部疾病的病毒载体或药物制剂中的应用，或在预防或治疗agbl5突变导致的眼部疾病中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述agbl5突变导致的眼部疾病为agbl5突变导致视网膜色素变性。
6.一种病毒载体，其特征在于，其包含有权利要求1-3任意一项所述核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述病毒载体，其特征在于，所述病毒载体为腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体。
8.根据权利要求7所述病毒载体，其特征在于，所述腺相关病毒载体的血清型为aav2野生型或aav2/2.7m8。
9.根据权利要求6-8任意一项所述病毒载体，其特征在于，所述病毒载体由启动子cmv调控agbl5蛋白的表达。
10.权利要求6-9任意一项所述病毒载体在制备预防或治疗agbl5突变导致的眼部疾病的药物制剂中的应用，或在预防或治疗agbl5突变导致的眼部疾病中的应用。
11.根据权利要求10所述应用，其特征在于，所述agbl5突变导致的眼部疾病为agbl5突变导致视网膜色素变性。
12.一种药物制剂，其特征在于，包含如权利要求1-3任一项所述的核苷酸序列或权利要求6-9任一项所述的病毒载体。
13.根据权利要求12所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为液体制剂。
14.根据权利要求12或13所述药物制剂，其特征在于，还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
15.权利要求12-14任意一项所述的药物制剂在预防或治疗agbl5突变导致的眼部疾病中的应用。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述agbl5突变导致的眼部疾病为agbl5突变导致视网膜色素变性。
17.一种药物制剂的递送方法，其特征在于，将权利要求12-14任意一项所述药物制剂通过视网膜下注射或者玻璃体腔注射至眼部。
技术总结