本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种目的基因片段的合成方法。
背景技术：
目前传统的基因合成方法均依赖于pcr技术，利用引物彼此之间的退火延伸逐步生成较大的dna片段。但依赖于引物的pcr合成技术存在以下缺点：①目前寡核苷酸的化学合成多采用固相亚磷酰胺三酯合成法(phosphoramiditechemistry)，该方法用可控多孔玻璃(controlledporeglass,cpg)或聚苯乙烯(polystyrene,ps)作为固相支持载体，通过活化(deprotection)、偶联(coupling)、带帽(capping)以及氧化(oxidation)四步连续的化学反应的循环反应将脱氧核苷酸依次连接并逐渐延伸，在合成反应中引物本身容易积累错误，即突变。在pcr的过程总引物的突变会被指数级放大，导致合成的目的片段错误率高，这是目前依赖pcr基因合成方法突变率的主要原因，且无法完全避免；同时合成目的片段错误率高一方面增大了合成工作量，另一方面也增加了测序的成本。②由于合成方法依赖pcr技术，当待合成的基因序列中存在高gc、高at、发卡、高度重复等特殊结构时，会导致设计的引物无法彼此退火、延伸，或者引物存在多个退火延伸的位点，这样会知道导致合成的失败。③依赖pcr技术的合成方法存在pcr体系的配制、pcr产物的检测、回收、酶切、目的基因片段与载体的连接等繁琐的操作步骤，一定程度上降低了合成的通量、提高了合成的成本。
因此，如何开发一种合成效率高且正确率高，适合高度重复、高gc、发卡等特殊结构序列的目的基因片段的合成方法，成为亟待解决的技术问题。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种目的基因片段的合成方法，合成效率高且正确率高，适合高度重复、高gc、发卡等特殊结构序列。
为了实现上述目的，本发明提供了一种目的基因片段的合成方法，所述方法包括：
获得目的基因片段的多条上游引物和多条下游引物；其中，所述多条上游引物和所述多条下游引物之间存在多个重叠的碱基；
将所述多条上游引物、所述多条下游引物和双蒸水混匀，获得引物对溶液；
将所述引物对溶液、pcrbuffer和ddh2o混匀，获得退火反应液；将所述退火反应液放置于温度为95～105℃的热水中，后自然冷却至室温，获得退火产物；
将载体双酶切获得第一粘性末端线性载体，后将所述粘性末端线性载体用t4dna聚合酶处理，获得第二粘性末端的线性载体；
将所述退火产物和所述第二粘性末端的线性载体孵育，后转化进感受态细胞，获得带有目的基因片段的转化子。
进一步地，所述引物对溶液的浓度为45～55pmol/μl。
进一步地，所述上游引物和所述下游引物的总条数为n，所述pcrbuffer的体积为(n/4)μl。
进一步地，所述将载体双酶切获得粘性末端线性载体，包括：
将载体1～2μg，10×cutsmartbuffer5μl，第一限制性内切酶1μl，第二限制性内切酶1μl混匀，并加ddh2o至50μl，获得双酶切体系，将所述双酶切体系于36.5～37.5℃孵育1～2h，后电泳回收，获得粘性末端线性载体。
进一步地，所述第一限制性内切酶和所述第二限制性内切酶均为选自所述载体内的酶切位点所对应的限制性内切酶。
进一步地，所述将所述粘性末端线性载体用t4dna聚合酶处理，获得第二粘性末端的线性载体，包括：
将粘性末端线性载体1～2μg，t4dna聚合酶buffer5μl，dttp2.5m，bsa牛血清蛋白5μl混匀，并加ddh2o至50μl，获得混合液，将所述混合液于10～14℃孵育10～30min，获得第二粘性末端的线性载体。
进一步地，所述退火产物和所述第二粘性末端线性载体的质量比为3：1。
进一步地，所述退火产物和所述第二粘性末端线性载体孵育的温度为36～38℃，孵育时间为20～40min。
进一步地，所述目的基因片段的小于等于600bp。
进一步地，所述多条上引物和所述多条下引物选自核苷酸序列如seqidno：1-seqidno：12所示的引物；所述载体的核苷酸序列如seqidno：13所示。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明提供的一种目的基因片段的合成方法，利用一种全新的引物设计方法，将合成的引物体外退火处理，直接与酶切的载体混合转化大肠杆菌感受态细胞，利用大肠杆菌自身的重组修复系统合成目的基因片段。该合成方法具有如下优点：①合成方法操作简单，合成效率和通量极高，正确率也非常高。合成过程没有用到任何高温聚合酶，也未用到任何检测、回收等试剂，不仅大幅度降低了合成的成本，更节省了合成的周期和人力投入，确保合成周期。②虽然该技术也是以引物为原料的合成，引物在合成的过程中突变在所难免，但该技术没有pcr扩增，一方面不会放大这些合成的错误，另外如果引物中存在突变，在彼此退火形成双链时，dna分子结构中会形成一个突起，这种“带有突起的环状分子”相较“带有缺刻的环状分子”而言是极难转化进入大肠杆菌的，通过这样一种天然的筛选机制，带有错误的引物绝大部分被阻挡在细胞外。这二者的结合使我们的合成方法合成正确率非常高。③该技术引物的退火由高到低是一个连续的过程，理论上各种退火温度的引物都能够很好的退火形成双链，因此该技术非常能胜任合成高度重复、高gc、发卡等特殊结构序列。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为本发明实施例提供的一种目的基因片段的合成方法的流程图；
图2为本发明实施例1中阳性克隆测序后的比对结果；
图3为本发明实施例2中阳性克隆测序后的比对结果；
图4为本发明实施例3中阳性克隆测序后的比对结果；
图5为本发明对比例1中局部gc含量图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。本发明的“第一”、“第二”等词不代表顺序，可以理解为名词。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种目的基因片段的合成方法，如图1所示，所述方法包括：
s1、获得目的基因片段的多条上游引物和多条下游引物；其中，所述多条上游引物和所述多条下游引物之间存在多个重叠的碱基；
s2、将所述多条上游引物、所述多条下游引物和双蒸水混匀，获得引物对溶液；
s3、将所述引物对溶液、pcrbuffer和ddh2o混匀，获得退火反应液；将所述退火反应液放置于温度为95～105℃的热水中，后自然冷却至室温，获得退火产物；
s4、将载体双酶切获得第一粘性末端线性载体，后将所述粘性末端线性载体用t4dna聚合酶处理，获得第二粘性末端的线性载体；
s5、将所述退火产物和所述第二粘性末端的线性载体孵育，后转化进感受态细胞，获得带有目的基因片段的转化子。
本发明实施例将合成的多条引物体外退火处理，通过碱基互补配对，在退火温度逐渐降低的情况下，退火形成dna双链；dna双链与酶切的载体混合转化大肠杆菌感受态细胞，利用大肠杆菌自身的重组修复系统合成目的基因片段。该合成方法具有如下优点：①合成方法操作简单，合成效率和通量极高，正确率也非常高。合成过程没有用到任何高温聚合酶，也未用到任何检测、回收等试剂，不仅大幅度降低了合成的成本，更节省了合成的周期和人力投入，确保合成周期。②虽然该技术也是以引物为原料的合成，引物在合成的过程中突变在所难免，但该技术没有pcr扩增，一方面不会放大这些合成的错误，另外如果引物中存在突变，在彼此退火形成双链时，dna分子结构中会形成一个突起，这种“带有突起的环状分子”相较“带有缺刻的环状分子”而言是极难转化进入大肠杆菌的，通过这样一种天然的筛选机制，带有错误的引物绝大部分被阻挡在细胞外。这二者的结合使我们的合成方法合成正确率非常高。③该技术引物的退火由高到低是一个连续的过程，理论上各种退火温度的引物都能够很好的退火形成双链，因此该技术非常能胜任合成高度重复、搞gc、发卡等特殊结构序列。
作为优选的实施方式，所述引物对溶液的浓度为45～55pmol/μl。最优浓度为50pmol/μl，该浓度范围有利于退火产物的浓度达到转化要求。
作为优选的实施方式，所述上游引物和所述下游引物的总条数为n，所述pcrbuffer的体积为(n/4)μl。
作为优选的实施方式，所述将载体双酶切获得粘性末端线性载体，包括：
将载体1～2μg，10×cutsmartbuffer5μl，第一限制性内切酶1μl，第二限制性内切酶1μl混匀，并加ddh2o至50μl，获得双酶切体系，将所述双酶切体系于36.5～37.5℃孵育1～2h，后电泳回收，获得粘性末端线性载体。
作为优选的实施方式，所述第一限制性内切酶和所述第二限制性内切酶均为选自所述载体内的酶切位点所对应的限制性内切酶。
作为优选的实施方式，所述将所述粘性末端线性载体用t4dna聚合酶处理，获得第二粘性末端的线性载体，包括：
将粘性末端线性载体1～2μg，t4dna聚合酶buffer5μl，dttp2.5m，bsa牛血清蛋白5μl混匀，并加ddh2o至50μl，获得混合液，将所述混合液于10～14℃孵育10～30min，获得第二粘性末端线性载体。
作为优选的实施方式，所述退火产物和所述第二粘性末端线性载体的质量比为3：1。
作为优选的实施方式，所述退火产物和所述第二粘性末端线性载体孵育的温度为36～38℃，孵育时间为20～40min。
作为优选的实施方式，所述上引物和所述下引物选自核苷酸序列如seqidno：1-seqidno：12所示的引物中的两条。
作为优选的实施方式，所述载体的核苷酸序列如seqidno：13所示。
通过合成的多条引物体外退火处理，酶切的载体混合转化大肠杆菌感受态细胞，利用大肠杆菌自身的重组修复系统可以合成目的基因片段，目前所有实验结果显示600bp以内的多条引物混合物可以很好的通过这一方法进行合成。阳性率90％以上，且引物质量良好的情况下合成正确率也在99％以上。
本发明实施例选择所述多条上游引物和所述多条下游引物之间存在多个重叠的碱基即overlap，从而可以保证退火的时候通过碱基互补配对形成一个片段。其中，所述多条上游引物和所述多条下游引物之间存在多个重叠的碱基可以理解为：多条引物之间依次具有重叠的碱基，只要保证退火的时候通过碱基互补配对形成一个片段即可；具体可以为：现有8条引物，其中，引物1、3、5、7和为上游引物，引物2、4、6、8为下游引物，可以为1引物和2引物有重叠的碱基，3引物和4引物有重叠的碱基；5引物和6引物有重叠的碱基；7引物和8引物有重叠的碱基；也可以是其他重叠碱基的情况。
不选择1条上游引物和1条下游引物的原因为：①pcr扩增可能会放大引物合成中的错误，导致合成出来的序列有突变。但退火的方法，如果引物中存在突变，在彼此退火形成双链时，dna分子结构中会形成一个突起，这种“带有突起的环状分子”相较“带有缺刻的环状分子”而言是极难转化进入大肠杆菌的，通过这样一种天然的筛选机制，带有错误的引物绝大部分被阻挡在细胞外。②pcr扩增可能对不同序列有局限性，遇到高gc，低gc，发卡等序列，可能会扩增不出条带。但理论上引物退火方案各种退火温度的引物都能够很好的退火形成双链。③pcr扩增需要pcr仪、dna聚合酶、扩增之后需要琼脂糖凝胶电泳切胶，回收试剂盒回收目的条带，引物退火方法不需要这些仪器试剂及实验流程，降低了合成的成本，节省了合成的周期和人力投入。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的目的基因片段的合成方法的制备方法进行详细说明。
实施例1
一、实验材料
1、主要实验仪器
表1
2、主要实验试剂
表2
二、实验步骤
1、设计退火引物：
表3
所述190186b-1-m、190186b-3-m、190186b-5-m、190186b-7-m、190186b-9-m和190186b-11-m为上游引物；所述190186b-2-m、190186b-4-m、190186b-6-m、190186b-8-m、190186b-10-m和190186b-12-m为上游引物；其中，上游引物之间、下游引物之间的overlap已在表3中用黑色字体标注出来；
将所述上引物和下引物混匀，加100ul双蒸水溶解，获得引物对溶液；所述上引物、下引物选自所述表3中的两条，引物终浓度为50pmol/μl。
2、在pcr管中按如下反应体系进行配制，最终为20ul反应体系(如表4所示)，将pcr管放入刚烧开的水中，自然冷却到室温。
表4
3、将载体(所述载体的核苷酸序列如seqidno：13所示)1～2μg，10×cutsmartbuffer5μl，ecori限制性内切酶1μl，hindiii限制性内切酶1μl混匀，并加ddh2o至50μl，获得双酶切体系(如表5所示)，将所述双酶切体系于36.5～37.5℃孵育1～2h，电泳回收，获得粘性末端线性载体。所述酶切产物电泳检测以及回收，步骤参照试剂盒说明书。
表5
4、将所述粘性末端线性载体用t4dna聚合酶处理，反应体系如表6所示，12℃，20min直接溶液回收，步骤参照试剂盒说明书，获得第二粘性末端线性载体。
表6
5、取1支1.5ml离心管，加入3ul退火产物和1ul酶切好的载体，37℃孵育30min后加入50uldh5α感受态细胞转化：送测阳性克隆，测序验证序列正确性。由图2可知，表明成功获得序列正确的阳性克隆。
实施例2
1、设计退火引物：
表7
所述190779a-1-m、190779a-3-m、190779a-5-m、190779a-7-m和190779a-9-m为上游引物；所述190779a-2-m、190779a-4-m、190779a-6-m、190779a-8-m和190779a-10-m为下游引物。其中，上游引物之间、下游引物之间的overlap已在表7中用黑色字体标注出来；
将所述上引物和下引物混匀，加100ul双蒸水溶解，获得引物对溶液；所述上引物、下引物选自所述表7中的两条，引物终浓度为50pmol/μl。
2、在pcr管中按如下反应体系进行配制，最终为20ul反应体系(如表8所示)，将pcr管放入刚烧开的水中，自然冷却到室温。
表8
3、将载体(所述载体的核苷酸序列如seqidno：13所示)1～2μg，10×cutsmartbuffer5μl，ecori限制性内切酶1μl，hindiii限制性内切酶1μl混匀，并加ddh2o至50μl，获得双酶切体系(如表9所示)，将所述双酶切体系于36.5～37.5℃孵育1～2h，电泳回收，获得粘性末端线性载体。所述酶切产物电泳检测以及回收，步骤参照试剂盒说明书。
表9
4、将所述粘性末端线性载体用t4dna聚合酶处理，反应体系如表10所示，12℃，20min直接溶液回收，步骤参照试剂盒说明书，获得第二粘性末端线性载体。
表10
5、取1支1.5ml离心管，加入3ul退火产物和1ul酶切好的载体，37℃孵育30min后加入50uldh5α感受态细胞转化：送测阳性克隆，测序验证序列正确性。由图3可知，表明成功获得序列正确的阳性克隆。
实施例3
1、设计退火引物：
表11
所述190813-1-m、190813-3-m、190813-5-m、190813-7-m、190813-9-m和190813-11-m为上游引物；所述190813-2-m、190813-4-m、190813-6-m、190813-8-m、190813-10-m和190813-12-m为下游引物；其中，上游引物之间、下游引物之间的overlap已在表11中用黑色字体标注出来；
将所述上引物和下引物混匀，加100ul双蒸水溶解，获得引物对溶液；所述上引物、下引物选自所述表11中的两条，引物终浓度为50pmol/μl。
2、在pcr管中按如下反应体系进行配制，最终为20ul反应体系(如表12所示)，将pcr管放入刚烧开的水中，自然冷却到室温。
表12
3、将载体(所述载体的核苷酸序列如seqidno：13所示)1～2μg，10×cutsmartbuffer5μl，ecori限制性内切酶1μl，hindiii限制性内切酶1μl混匀，并加ddh2o至50μl，获得双酶切体系(如表13所示)，将所述双酶切体系于36.5～37.5℃孵育1～2h，电泳回收，获得粘性末端线性载体。所述酶切产物电泳检测以及回收，步骤参照试剂盒说明书。
表13
4、将所述粘性末端线性载体用t4dna聚合酶处理，反应体系如表14所示，12℃，20min直接溶液回收，步骤参照试剂盒说明书，获得第二粘性末端线性载体。
表14
5、取1支1.5ml离心管，加入3ul退火产物和1ul酶切好的载体，37℃孵育30min后加入50uldh5α感受态细胞转化：送测阳性克隆，测序验证序列正确性。由图4可知，表明成功获得序列正确的阳性克隆。
对比例1
该对比例中采用现有技术中传统的基因合成方法，其余均同实施例1。
由图5可知，该对比例1中局部gc含量超过80％，传统的pcr扩增可能扩不出，或扩出后高gc部分有缺失。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110>武汉金开瑞生物工程有限公司
<120>一种目的基因片段的合成方法
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1.一种目的基因片段的合成方法，其特征在于，所述方法包括：
获得目的基因片段的多条上游引物和多条下游引物；其中，所述多条上游引物和所述多条下游引物之间存在多个重叠的碱基；
将所述多条上游引物、所述多条下游引物和双蒸水混匀，获得引物对溶液；
将所述引物对溶液、pcrbuffer和ddh2o混匀，获得退火反应液；将所述退火反应液放置于温度为95～105℃的热水中，后自然冷却至室温，获得退火产物；
将载体双酶切获得第一粘性末端线性载体，后将所述粘性末端线性载体用t4dna聚合酶处理，获得第二粘性末端的线性载体；
将所述退火产物和所述第二粘性末端的线性载体孵育，后转化进感受态细胞，获得带有目的基因片段的转化子。
2.根据权利要求1所述的一种目的基因片段的合成方法，其特征在于，所述引物对溶液的浓度为45～55pmol/μl。
3.根据权利要求1所述的一种目的基因片段的合成方法，其特征在于，所述上游引物和所述下游引物的总条数为n，所述pcrbuffer的体积为(n/4)μl。
4.根据权利要求1所述的一种目的基因片段的合成方法，其特征在于，所述将载体双酶切获得粘性末端线性载体，包括：
将载体1～2μg，10×cutsmartbuffer5μl，第一限制性内切酶1μl，第二限制性内切酶1μl混匀，并加ddh2o至50μl，获得双酶切体系，将所述双酶切体系于36.5～37.5℃孵育1～2h，后电泳回收，获得粘性末端线性载体。
5.根据权利要求4所述的一种目的基因片段的合成方法，其特征在于，所述第一限制性内切酶和所述第二限制性内切酶均为选自所述载体内的酶切位点所对应的限制性内切酶。
6.根据权利要求1所述的一种目的基因片段的合成方法，其特征在于，所述将所述粘性末端线性载体用t4dna聚合酶处理，获得第二粘性末端的线性载体，包括：
将粘性末端线性载体1～2μg，t4dna聚合酶buffer5μl，dttp2.5m，bsa牛血清蛋白5μl混匀，并加ddh2o至50μl，获得混合液，将所述混合液于10～14℃孵育10～30min，获得第二粘性末端的线性载体。
7.根据权利要求1所述的一种目的基因片段的合成方法，其特征在于，所述退火产物和所述第二粘性末端的线性载体的质量比为3：1。
8.根据权利要求1所述的一种目的基因片段的合成方法，其特征在于，所述退火产物和所述第二粘性末端的线性载体孵育的温度为36～38℃，孵育时间为20～40min。
9.根据权利要求1所述的一种目的基因片段的合成方法，其特征在于，所述目的基因片段的小于等于600bp。
10.根据权利要求1所述的一种目的基因片段的合成方法，其特征在于，所述多条上引物和所述多条下引物选自核苷酸序列如seqidno：1-seqidno：12所示的引物；所述载体的核苷酸序列如seqidno：13所示。
技术总结