本发明属于生物医学和免疫诊断检测技术领域，具体涉及一种表达sef14功能性菌毛的重组菌及其应用。
背景技术：
肠炎沙门氏菌没有宿主特异性，是导致人类食物中毒的主要的病原菌之一，能引起人和畜禽的非伤寒型胃肠炎。全世界每年大约有9380万人感染沙门氏菌，15.5万人死亡；而在我国，每年由沙门氏菌导致的沙门氏菌胃肠炎约占细菌性食物中毒的40％，居细菌性食物中毒之首，而肠炎沙门氏菌是沙门氏菌食物中毒暴发的主要病原。
畜禽产品是肠炎沙门氏菌感染的主要来源，其中以鸡蛋携带最为常见，这是由于肠炎沙门氏菌可以导致雏鸡的全身感染并终生带菌，细菌可以通过卵巢垂直传播至鸡蛋。若鸡蛋被查出肠炎沙门氏菌污染，同批次鸡蛋面临的后果是全部召回和销毁，例如2010年8月美国10个州爆发了沙门氏菌感染事件，5亿枚“问题蛋”被召回。因此，肠炎沙门氏菌引起人类食物中毒的同时也会导致畜禽养殖的重大损失，解决这个问题的关键是尽早检出，尽早淘汰。然而，目前没有系统特异性性的鸡群肠炎沙门氏菌的检测监测技术。
沙门氏菌检测方法众多，但对于沙门氏菌感染现场检测来说，凝集试验的便捷性具有无可比拟的优势。临床上通常会采用全血平板凝集试验检测鸡白痢沙门氏菌感染，但在实际应用中也被报道出现交叉反应明显、各批次检测结果不一致、弱阳性漏检等情况，且该法对雏鸡存在较大检测误差。值得注意的是，限于直接凝集试验敏感性局限，通常在种鸡产蛋前(16周龄)进行检查并考虑阳性种鸡群的净化根除。综上所述，究其根源是因为上述凝集抗原是全菌抗原(非纯净抗原)，非单因子成分，与多种属细菌和其它成分的非特异性交叉复杂。因此开发一种结果可靠、操作简便且反应快速的肠炎沙门氏菌现场检测方法，即简易、经济、即时、特异、敏感的凝集试验的监测检测，仅肉眼2分钟内在现场完成结果判定，并使之标准化，对于种鸡场肠炎沙门氏菌净化工作顺利开展、养禽业的长足发展和禽蛋产品的安全保障十分必要。
目前肠炎沙门氏菌在鸡群的感染情况严峻，对人类食品安全带来了严峻的考验，但是目前缺乏特异靶向性的鸡群肠炎沙门氏菌感染检测监测技术将其净化。sef14菌毛是一种伴侣-推进(chaperone-usher)菌毛，由sefabcd操纵子编码，是肠炎沙门氏菌感染过程中重要的毒力因子。本发明调研发现在鸡群分离到的沙门氏菌血清型中，仅肠炎沙门氏菌中存在完整的sef14操纵子，而在鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌中均存在假基因(未发表试验数据和分析)，理论上说，它们都不会在细菌体内表达sef14菌毛，在感染鸡体内也不会产生sef14菌毛抗体。因此，sef14抗体具有作为肠炎沙门氏菌感染特异性检测靶标，意义重大。
技术实现要素：
发明目的：本发明将功能性菌毛sef14单一表达在惰性载体菌s9(该菌株的保藏编号为cgmccno.17340)上可以避免出现背景反应的同时特异性检测肠炎沙门氏菌感染，具有快速、特异、敏感、简单和价廉等优点，同时满足鸡群肠炎沙门氏菌感染现场和大规模、大批量、快速检测的要求。因此，基于sef14菌毛靶标的肠炎沙门氏菌检测监测技术具有巨大的应用前景。
本发明所要解决的技术问题是提供了一种重组质粒。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种重组菌株及其制备方法和应用。
技术方案：本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒为将sef14操纵子基因插入表达载体pbr322中即得。
本发明内容还包括一种重组菌株，所述重组菌株为将所述重组质粒导入惰性载体菌s9即得。
本发明内容还包括所述的重组菌株的构建方法，包括以下步骤：
1)pcr扩增sef14操纵子基因并将其连接t载体，dna测序鉴定正确后插入表达载体pbr322，构建重组质粒pbr-sef14；
2)将pbr-sef14导入大肠杆菌se5000，热提取菌毛并利用sds-page、westernblot和透射电镜鉴定sef14菌毛的正确表达；
3)将pbr-sef14导入惰性载体s9即得。
其中，所述步骤1)中的pcr扩增、下游引物序列分别为
sef-up：5’-ggcatgcaaaatggcgtgagtatattagcatccgca-3’；
sef-lo：5’-cgtcgacttattataattcaatttctgtcgcatat-3’；
其中下划线标注分别代表sphi和sai酶切位点。
其中，对表达sef14菌毛的se5000重组菌热提取菌毛后经sds-page和westernblot鉴定的sef14菌毛亚单位大小为14.3kd。
其中，表达sef14菌毛的se5000重组菌可在透射电镜下观察到明显的菌毛结构；而仅含pbr322载体的se5000重组菌观察不到菌毛结构。
其中，在步骤3)中，通过电转化将pbr-sef14导入惰性载体菌s9电转化感受态细胞并通过氨苄青霉素lb平板筛选阳性克隆。
其中，表达sef14菌毛的惰性载体菌液仅与肠炎沙门氏菌感染阳性鸡血清混合后可以形成肉眼可见凝集颗粒状沉淀；表达sef14菌毛的惰性载体菌液与鸡白痢/鸡伤寒沙门氏菌感染血清或spf鸡血清混合后均不会形成肉眼可见颗粒状沉淀。
本发明构建的pbr-sef14质粒具有氨苄青霉素抗性，质粒全长8212bp。pcr扩增的sef14操纵子片段和pbr322载体经sphi和sali酶切后利用t4dna连接酶在体外环化并转化大肠杆菌se5000后通过氨苄亲霉素抗性lb平板筛选阳性克隆。pbr-sef14质粒的鉴定方法为分别利用存在于载体pbr322上的sali和存在于sef14操纵子的sphi进行酶切，然后经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，酶切后目的条带均为8212bp。
本发明内容还包括所述的重组质粒或重组菌株在制备凝集试验试剂或试剂盒中的应用。
本发明内容还包括所述的重组质粒或重组菌株在制备肠炎沙门氏菌感染鉴定或检测试剂或试剂盒中的应用。
其中，所述的应用为，将重组菌株与多种沙门氏感染鸡血清和spf鸡血清进行凝集试验，当出现凝集颗粒状沉淀时，即感染肠炎沙门氏菌，反之，则没有感染肠炎沙门氏菌。
本发明的表达sef14菌毛的惰性载体菌液仅与肠炎沙门氏菌感染阳性鸡血清混合后可以形成肉眼可见凝集颗粒状沉淀；本发明的表达sef14菌毛的惰性载体菌液与同群d群鸡白痢、鸡伤寒沙门氏菌感染血清，多种沙门氏菌感染鸡血清或spf鸡血清混合后均不会形成肉眼可见凝集颗粒状沉淀。
有益效果：本发明首次将sef14菌毛单一成分在惰性载体菌s9进行了表面展呈表达。本发明的重组菌与各种品种的鸡血清或任何非肠炎沙门氏菌病原感染的鸡血清均不发生反应，所以可避免出现背景反应的同时特异性检测肠炎沙门氏菌，该惰性载体沙门氏菌s9也是申请人的早期发明，本发明是基于该早期申请专利基础上的创新、新颖性发现和进一步应用，本发明将该惰性载体沙门氏菌s9进行具体试验验证并表达该sef14菌毛在惰性载体菌s9表面进行表达，并创造性的发现其能够表达sef14功能性菌毛单一成分的重组菌并且仅特异性与肠炎沙门氏菌感染抗体具备凝集作用，具有快速、特异、敏感、简单和价廉等优点，同时满足现场和大规模检测的要求。因此，基于sef14菌毛单一成分靶标的肠炎沙门氏菌感染检测监测技术具有巨大的应用前景。本发明的sef14功能性菌毛单一成分在惰性载体上表达后可用于检测监测肠炎沙门氏菌感染鸡群血清、血浆或全血样本，仅需5-10μl上述检测样品和等体积的检测试剂，其表达sef14功能性菌毛的重组菌检测用量仅需1×1010cfu/ml(培养14-16小时的生长对数期)，灵敏度高。利用简单的玻板凝集反应，通过现场肉眼观察反应结果和准确判断动物是否被肠炎沙门氏菌感染。此方法无需借助精密或大型仪器，可满足在养鸡场进行现场检测，为鸡群肠炎沙门氏菌感染的检测、监测和感染畜禽的净化提供了新颖的手段。
附图说明
图1sef14操纵子基因pcr扩增结果。m泳道代表trans2kplusiidnamarker；泳道1代表sef14操纵子的pcr扩增产物。
图2pbr-sef14质粒的酶切鉴定结果。m泳道代表trans15kdnamarker；泳道1代表pbr-sef14环状质粒；泳道2代表pbr-sef14经sali酶切的线性片段；泳道3代表pbr-sef14经sphi酶切的线性片段。
图3sef14菌毛的sds-page和westernblot鉴定结果。m泳道代表molecularweightproteinmarker；泳道1代表热提取的sef14菌毛亚单位；泳道2代表重组sefa亚单位对照。
图4透射电镜图。4a代表表达sef14菌毛的重组大肠杆菌se5000；4b代表仅含pbr322载体的大肠杆菌se5000阴性对照。黑色箭头所示为sef14菌毛结构。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
本发明涉及的sef14菌毛鼠源单抗由本实验室制备；辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠igg购自武汉博士德公司；蛋白质maker购自fermentas公司；p505超保真酶、10×loadingbuffer购于南京诺唯赞生物科技有限公司；trans2kplusiidnamarker、trans15kdnamarker购于北京全式金生物技术有限公司；t4dna连接酶、限制性内切酶sphi购自于takarabio公司；dna琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。
本发明涉及的肠炎沙门氏菌标准株c7920购自购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，大肠杆菌se5000由本实验室保存。
本发明所述的菌毛热提取方法步骤包括培养细菌并在次日1∶100接种于含有氨苄青霉素的液体lb培养基中200r/min震荡培养12h；4℃4500rpm离心10min后弃上清并用无菌pbs洗涤两次；随后加入1mnacl-0.05mtris-hcl(ph＝7.4)溶液重悬菌体并置于62℃水浴30min；8000rpm离心20min后转移上清液至新的离心管测定体积，缓慢滴加饱和硫酸铵至终浓度为25％，过夜沉淀；次日14000rpm离心30min，弃上清，用无菌pbs重悬沉淀，至-70℃保存。
本发明所使用的sef14菌毛单克隆抗体是由本实验室制备的鼠源单抗，来源于一株能稳定的分泌单抗的杂交瘤细胞株3e4(段小丽，董立伟，张江英，杨奕，朱国强.肠炎沙门氏菌sef14菌毛单克隆抗体的制备及初步应用[j].上海畜牧兽医通讯，2013(01)：2-6.)其腹水抗体效价达1：128000。westernbolt鉴定sef14菌毛表达的方法步骤包括：热提取的sef14菌毛和重组sefa蛋白经sds-page后，以bio-rad转印系统将凝胶中蛋白条带转印到nc膜上，经10％bsa4℃封闭过夜。次日用pbst洗涤3次，加入抗sef14菌毛单克隆抗体(1∶1000稀释)，37℃孵育1h，pbst洗涤3次，加入羊抗小鼠-hrp标记的igg(1∶1500稀释)，37℃孵育2h，pbst洗涤3次后使用dab显色。
本发明所检测样品中spf鸡感染肠炎沙门氏菌血清、spf鸡感染鸡白痢沙门氏菌血清、spf鸡感染鸡伤寒沙门氏菌血清、spf鸡感染鼠伤寒沙门氏菌血清、spf鸡感染o1型大肠杆菌血清、spf鸡感染o2型大肠杆菌血清和spf鸡感染o78型大肠杆菌血清均由本实验室人工感染动物获得。临床肠炎沙门氏菌阳性鸡血清、临床鸡白痢沙门氏菌阳性鸡血清、临床鸡伤寒沙门氏菌阳性鸡血清和临床大肠杆菌阳性鸡血清为来自全国四个大型养鸡场的诊断血清样品。
本发明的惰性载体菌s9已经保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，保藏地址为中国北京，保藏编号为cgmccno.17340，保藏日期为2019年3月18日，分类命名为沙门氏菌(salmonellasp.)，菌株代号s9。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1肠炎沙门氏菌sef14操纵子的扩增和克隆
以肠炎沙门氏菌标准株c7920基因组为模板，使用p505超保真酶(购于南京诺唯赞生物科技有限公司)扩增sef14操纵子基因片段，其不含信号肽的编码序列为：
扩增该序列的上下游引物分别为：
sef-up：5’-ggcatgcaaaatggcgtgagtatattagcatccgca-3’；
set-lo：5’-cgtcgacttattataattcaatttctgtcgcatat-3’。
其中下划线标注分别代表sphi和sali酶切位点，扩增产物为4268bp(图1)。
pcr扩增的sef14操纵子基因片段和pbr322载体经sphi和sali酶切后利用dna连接酶在体外环化，产物命名为pbr-sef14，随后转化大肠杆菌se5000并通过氨苄青霉素抗性平板筛选阳性克隆。由于sef14片段和pbr322载体片段长度非常接近，故分别利用仅存在于载体pbr322上的sali和仅存在于sef14操纵子的sphi进行酶切，然后经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，pbr-sef14经上述两种酶切后目的条带均为8212bp(图2)。
实施例2sef14菌毛和sefa重组蛋白的表达和鉴定
sef14菌毛的表达：将pbr-sef14转化大肠杆菌se5000，在37℃分别培养12h后采用热提取方法抽提菌毛，以只含有pbr322空载体的se5000作为阴性对照。热提取方法的步骤为：将上述菌液置于4℃4500rpm离心10min后弃上清并用无菌pbs洗涤两次；随后加入1mnacl-0.05mtris-hcl(ph＝7.4)溶液重悬菌体并置于62℃水浴30min；8000rpm离心20min后转移上清液至新的离心管测定体积，缓慢滴加饱和硫酸铵至终浓度为25％，过夜沉淀；次日14000rpm离心30min，弃上清，用无菌pbs重悬沉淀，至-70℃保存。
sefa重组蛋白的获得：根据genbank中已发表的sefa基因序列(genbank登录号：ef553334.1)设计一对引物，预计扩增片段大小为498bp，并在其上、下游引物分别添加ecori和sali酶切位点(下划线为酶切位点)。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。引物序列如下：
sefaup：ccggaattcgctggctttgttggtaac；
sefado：cgcgtcgacttagttttgatactgctgaa。
使用p505超保真酶(购于南京诺唯赞生物科技有限公司)扩增sefa基因片段，pcr扩增的dna片段和pet28a载体经ecori和sali酶切酶切后利用dna连接酶在体外环化，产物命名为pet-sefa，随后转化大肠杆菌se5000并通过卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆，通过测序鉴定重组质粒的成功构建。将鉴定正确的重组质粒电转化入大肠杆菌bl21(de3)(一种大肠杆菌工程菌，由申请人实验室使用和保存)，随后进行诱导表达，其条件为用终浓度为1mm的iptg在37℃诱导3小时，最后用macherey-nagel公司的protinoni-ted2000蛋白纯化试剂盒纯化sefa重组蛋白，上述操作按照说明书进行。
采用sds-page和westernblot鉴定上述sef14菌毛和重组sefa蛋白作为对照(图3)。westernbolt鉴定sef14菌毛表达的方法为将热提取的sef14菌毛和重组sefa蛋白经sds-page后，以bio-rad转印系统将凝胶中蛋白条带转移到nc膜上，在4℃下经10％bsa封闭过夜。次日用pbst洗涤3次后加入抗sef14菌毛单克隆抗体(1∶1000稀释)，37℃孵育1h后用pbst洗涤3次，加入羊抗小鼠-hrp标记的igg(1∶1500稀释)在37℃孵育2h，完成后pbst洗涤3次并使用dab显色。热抽提获得的sef14菌毛蛋白大小为14.3kd，与预期结果一致；同时以携带6×his标签的作为对照的重组sefa蛋白，其大小约为15.2kd。
取1ml培养12h的表达sef14菌毛的se5000和阴性对照菌液(仅含pbr322载体的大肠杆菌se5000)，4000rpm离心10min，弃上清，用等量pbs洗涤两次后重悬。取50μl菌液滴于蜡纸上，将含支持膜的铜网漂浮于液滴的表面，室温静置15min；用滤纸吸尽铜网上多余的菌液，将铜网漂浮于2％磷钨酸染液液滴的表面，室温静置3min；用滤纸吸尽铜网上多余的染液，倒扣于滤纸上，待干后进行透射电镜观察。透射电镜观察结果表明表达sef14菌毛的se5000菌体表面有明显的菌毛结构，而阴性对照表面没有任何菌毛结构(图4)。
实施例3基于sef14菌毛的重组菌间接凝集试验检测鸡群肠炎沙门氏菌感染
培养实施例1-3中获得的表达sef14菌毛的重组菌12h后调整菌量为5×109cfu/ml，然后4000rpm离心5min，弃上清并用无菌pbs洗涤两次。使用含有0.25％甲醛的pbs重悬菌体，置于4℃过夜后即可作为凝集抗原。将上述凝集抗原分别与10份spf鸡感染肠炎沙门氏菌血清(编号为1-10)、30份临床肠炎沙门氏菌阳性血清(编号为11-40)、10份临床鸡白痢沙门氏菌血清(编号为41-50)、10份临床鸡伤寒沙门氏菌阳性鸡血清(编号为51-60)、10份临床大肠杆菌阳性鸡血清(编号为61-70)、10份spf鸡感染鸡白痢沙门氏菌血清(编号为71-80)、10份spf鸡感染鸡伤寒沙门氏菌血清(编号为81-90)、10份spf鸡感染鼠伤寒沙门氏菌血清(编号91-100)、10份spf鸡感染o1型大肠杆菌血清(编号为101-110)、10份spf鸡感染o2型大肠杆菌血清(编号为111-120)、10份spf鸡感染o78型大肠杆菌血清(编号为121-130)和10份spf鸡血清(编号为131-140)进行凝集反应测试。仅含有pbr322的惰性载体作为阴性对照与多个品种的鸡血清和多种病原感染的鸡血清均不发生凝集反应(表1)。
表1惰性载体s9菌株与多个品种和多种病原感染的鸡血清的凝集检测
注：“ ”代表凝集反应阳性；“-”代表凝集反应阴性。
结果表明，表达sef14菌毛的重组菌(惰性载体菌)可与10份spf鸡感染肠炎沙门氏菌血清均可出现阳性凝集反应，与29份肠炎沙门氏菌临床阳性血清出现阳性凝集反应，检出率达100％(表2)。同时，该凝集抗原与所有spf鸡感染鸡白痢沙门氏菌血清、spf鸡感染鸡伤寒沙门氏菌血清、spf鸡感染鼠伤寒沙门氏菌血清、spf鸡感染o1型大肠杆菌血清、spf鸡感染o2型大肠杆菌血清、spf鸡感染o78型大肠杆菌血清、临床鸡白痢沙门氏菌阳性鸡血清、临床鸡伤寒沙门氏菌阳性鸡血清、临床大肠杆菌阳性鸡血清和spf鸡血清混合后均不会形成肉眼可见颗粒状沉淀，即阴性反应。这表示本发明所述的肠炎沙门氏菌检测监测准确，且不会出现任何假阳性反应。
表2表达sef14菌毛的惰性载体检测肠炎沙门氏菌的能力
注：“ ”代表凝集反应阳性；“-”代表凝集反应阴性。
为进一步确定检测试剂的敏感度，本发明用不同浓度的表达sef14菌毛的惰性载体菌与spf鸡感染肠炎沙门氏菌阳性血清进行凝集检测。使用的菌液浓度包括5×108cfu/ml、1×109cfu/ml、2×109cfu/ml、3×109cfu/ml、4×109cfu/ml、5×109cfu/ml、1×1010cfu/ml，取5μl菌液与等体积不同稀释倍数的血清检测结果如表3所示。
表3表达sef14菌毛的惰性载体检测肠炎沙门氏菌的敏感性
注：“ ”代表凝集反应阳性；“-”代表凝集反应阴性。
从该表3可以得出，常规培养条件生长为对数期细菌(16小时左右)数量为1×1010cfu/ml就能达到较佳的检测要求。
综上所述，本发明公开的表达sef14功能性菌毛的重组菌株及其潜在应用。该发明内容为一种基于惰性载体(不与鸡源血清/全血产生任何可见的肉眼反应)，携带并能在表面展呈表达sef14菌毛并靶向肠炎沙门氏菌感染的检测方法，可以实现圈栏旁鸡舍内鸡群采集一滴血，现场通过肉眼观察判定，快速特异监测鸡群中肠炎沙门氏菌感染。本发明检测准确率高，不会出现假阳性反应。除与肠炎沙门氏菌阳性血清发生凝集反应外，与其他d群的鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌感染血清、鼠伤寒沙门氏菌感染血清、各种型大肠杆菌感染血清和无感染血清均不发生肉眼可见的反应。本发明方法不需要依赖任何昂贵的仪器，操作便捷，灵敏度高，且在1-2分钟内可肉眼观察判定结果，可在养禽业生产中进行肠炎沙门氏菌大规模的现场检测应用。
序列表
<110>扬州大学
<120>一种表达sef14功能性菌毛的重组菌及其应用
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>4264
<212>dna
<213>sef14操纵子基因片段(salmonellasp.)
<400>1
atgcgtaaatcagcatctgcagtagcagttcttgctttaattgcatgtggcagtgcccac60
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atcgtgatattgggatgaatgtttctggtggggtgattgctcattcatcaggaattacgt3300
ttggtcagagtatatcggatactgctgcactggtagaggctaaaggtgtaagtggggcaa3360
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1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为将sef14操纵子基因插入表达载体pbr322中即得。
2.一种重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为将权利要求1的重组质粒导入惰性载体菌s9即得。
3.权利要求2所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）pcr扩增sef14操纵子基因并将其连接t载体，dna测序鉴定正确后插入表达载体pbr322，构建重组质粒pbr-sef14；
2）将pbr-sef14导入大肠杆菌se5000，热提取菌毛并利用sds-page、westernblot和透射电镜鉴定sef14菌毛的正确表达；
3）将pbr-sef14导入惰性载体s9即得。
4.根据权利要求3所述的重组菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤1）中的pcr扩增、下游引物序列分别为
sef-up：5’-ggcatgcaaaatggcgtgagtatattagcatccgca-3’；
sef-lo：5’-cgtcgacttattataattcaatttctgtcgcatat-3’。
5.权利要求1所述的重组质粒或权利要求2所述的重组菌株在制备凝集试验试剂或试剂盒中的应用。
6.权利要求1所述的重组质粒或权利要求2所述的重组菌株在制备肠炎沙门氏菌感染的鉴定或检测试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将重组菌株与多种沙门氏感染鸡血清和spf鸡血清进行凝集试验，当出现凝集颗粒状沉淀时，即感染肠炎沙门氏菌，反之，则没有感染肠炎沙门氏菌。
8.一种检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括权利要求1所述的重组质粒或权利要求2所述的重组菌株。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照和阴性对照。
技术总结