本发明涉及一种促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法，属于基因工程技术领域。
背景技术：
nadph又叫还原型辅酶ⅱ，是一种重要的辅因子，在细胞内广泛分布，通过参与800对个氧化还原反应来调节胞内氧化还原水平并影响众多基因表达、细胞功能、代谢途径、物质跨膜运输和胞内微环境。胞内nadph水平与目标代谢产物的合成之间的关系可分为以下几种类型：(1)影响目标代谢产物产量：提高胞内nadph水平，能促进胞内nadph-依赖型产物的合成而阻断非nadph-依赖型产物的合成；(2)影响底物转化率：调控胞内nadph水平，能有效降低副产物积累，提高原料的转化率；(3)影响目标代谢产物生产强度：增加胞内nadph供给，满足中心碳代谢途径中关键酶对nadph的需求，可实现目标产物高强度生产；(4)拓宽底物利用范围：促进胞内nadph再生，可提高菌体对糖蜜、羧基化合物等的利用；(5)影响胞内微环境：改变nadph水平会影响胞内nad(h/ )状态和atp含量，可调节胞内ph(phi)和活性氧簇(ros)的形成，提高细胞对酸胁迫和氧胁迫的适应力。因此，对胞内nadph水平的调控是菌种改造和发酵过程优化需考虑的一个重要指标。
胞内nadph水平的调控策略可分为外源调控和内源调控。外源调控是指采用生化工程的方法，通过添加外源电子受体、不同还原态碳源和nadp 前体物，改变溶氧等实现对nadph代谢的调控；而内源调控是基于细胞内nadph合成与代谢的途径，通过代谢工程策略调节与nadp(h/ )代谢相关途径或酶活性。目前，内源调控是调节胞内nadph水平的常用策略，具体思路可分为以下几个方面：(1)调控磷酸戊糖(pp)途径：pp途径是多数微生物中主要的nadph供给途径，由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf,编码基因zwf)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(gnd,编码基因gnd)催化合成；(2)调控糖酵解(emp)途径：将菌体内源的nad -依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶(nad -gadph)换成nadp -gapdh，可显著增加胞内nadph水平，促进目标产物的合成；(3)调控三羧酸循环(tca)途径：敲除琥珀酰-coa合成酶，扰乱正常的tca，强化流经苹果酸酶的碳通量，可增加胞内nadph水平；(4)调控转氢酶循环途径：调节escherichiacoli中由膜结合转氢酶pntab(或mth,编码基因pntab)或可溶性转氢酶udha(或sth)组成的转氢酶循环途径，调控nad(h/ )与nadp(h/ )的相互转化水平，从而实现调节胞内nadph水平。谷氨酸棒杆菌没有转氢酶循环途径，只有由丙酮酸/磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸酶和苹果酸脱氢酶(male,编码基因male)组成的类似转氢酶循环(transhydrogenase-likecycle)途径，苹果酸酶可将nadh转化为nadph，提高胞内nadph供给水平，促进目的产物合成。虽然上述代谢改造取得了比较显著的成果，但还存在以下不足：辅因子nadph调控微生物细胞生理代谢功能的机制还不清晰，进而难于通过控制胞内nadph水平实现目标产物合成途径的精细化调控。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明通过失活葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(zwf)和苹果酸酶(male)，并将nadp 依赖型异柠檬酸脱氢酶(icdcg)替换成变形链球菌(streptococcusmutans)中nad 依赖型异柠檬酸脱氢酶(icdsm)，从而阻断谷氨酸棒杆菌胞内所有参与nadph合成途径，先构建了一株nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌。接着通过在上述菌株中使用不同强度的启动子表达大肠杆菌中pntab，获得不同nadph再生水平的重组菌株，可筛选能够高产目标产物的重组菌，可实现目标产物合成途径的精细化调控。
本发明的第一个目的是提供一种促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法，包括如下步骤：
s1、构建nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌：以生产目标产物的谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因male，同时将其nadp 依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的nad 依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm；
s2、构建重组质粒：设计不同强度的启动子序列，将烟酰胺核苷酸转氢酶基因连接到质粒上获得目的重组质粒，将目的重组质粒的启动子分别替换为不同强度的启动子，获得重组表达质粒；
s3、将重组表达质粒导入s1步骤构建的nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，筛选得到目标产物产量提高的重组菌。
进一步地，所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的核苷酸序列如seqidno.1所示。
进一步地，所述的苹果酸酶基因male的核苷酸序列如seqidno.2所示。
进一步地，所述的柠檬酸脱氢酶基因icdcg的核苷酸序列如seqidno.3所示。
进一步地，所述的nadp 依赖型异柠檬酸脱氢酶来源于变形链球菌，为以下任一：
(1)氨基酸序列如seqidno.4所示的异柠檬酸脱氢酶；
(2)具有异柠檬酸脱氢酶活性的同工酶。
进一步地，所述的烟酰胺核苷酸转氢酶基因的核苷酸序列如seqidno.5所示。
进一步地，所述的启动子的核苷酸序列如seqidno.17-31所示。
本发明的第二个目的是提供一种谷氨酸棒杆菌重组菌，所述的重组菌是在nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，以核苷酸序列如seqidno.16-30中的一种启动子表达烟酰胺核苷酸转氢酶；所述的nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌是以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因male，同时将其nadp 依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的nad 依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm。
进一步地，所述的烟酰胺核苷酸转氢酶以pecm为表达载体。
本发明的第三个目的是提供所述的谷氨酸棒杆菌重组菌的构建方法，包括如下步骤：
s01、将编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因连接到质粒上，并将启动子替换为核苷酸序列如seqidno.16-30中的一种启动子，获得重组表达载体；
s02、将重组表达载体导入nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，得到所述的谷氨酸棒杆菌重组菌。
本发明的有益效果：
本发明以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因male，同时将其nadp 依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的nad 依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm，获得了一株nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌。接着，在上述菌株中使用不同强度的启动子过表达大肠杆菌中烟酰胺核苷酸转氢酶pntab编码基因pntab，得到不同nadph再生强度的重组菌株，筛选得到高产目标产物的重组菌，可实现目标产物合成途径的精细化调控。
附图说明
图1为nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建策略；
图形说明：叉代表失活该基因，箭头代表替换icd基因，虚线框代表外源导入的nadph再生途径
图2为不同重组菌株在不同碳源下菌体生长和l-赖氨酸发酵情况；
图3为不同强度启动子控制nadph水平对l-赖氨酸生产强度的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
以下实施例中以谷氨酸棒杆菌c.glutamicumlys-χ为例，谷氨酸棒杆菌c.glutamicumlys-χ是在谷氨酸棒杆菌atcc13032基础上构建得到的生产l-赖氨酸的菌株。本发明方法不限定生产l-赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，对其他需要nadph的谷氨酸棒杆菌生产菌株同样适用。
胞内nadp(h)与nad(h)浓度的测定：取适量菌体，离心后弃上清加入0.50ml酸性(碱性)提取液重悬菌体，超声破碎1min，超声破碎参数为强度20％或200w，超声2s，停1s，盖紧后沸水浴5min后冰浴中冷却，10000×g4℃离心10min，取上清液200μl转移至另一新的离心管中，加入等体积的碱性(酸性)提取液使之中和，10000×g4℃离心10min，取上清。随后，以试剂盒nad/nadhquantificationcolorimeterickit和试剂盒nadp/nadphquantificationcolorimeterickit分别特异性检测并计算nad /nadh和nadp /nadph。
表1：实施例中所用到的引物(下划线为酶切位点)
实施例1：重组质粒pk18mobsacb-δzwf、pk18mobsacb-δmalepk18mobsacb-δicdcg::icdsm的构建
根据c.glutamicumlys-χ中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶zwf基因序列。在其基因上下游分别选择一段同源臂，在分别添加限制性内切酶bamhⅰ、xbaⅰ和hindⅲ酶切位点序列，设计出两组引物zwf-l-f，zwf-l-r和zwf-r-f，zwf-r-r，用这两组引物以谷氨酸棒杆菌lys-χ基因组为模板进行pcr，对pcr产物进行胶回收获得两个同源臂片段。将左同源臂zwf-l与质粒pk18mobsacb同时用限制性内切酶bamhⅰ和xbaⅰ进行酶切，使用产物纯化试剂盒纯化后用t4dna连接酶进行酶连，转化至大肠杆菌jm109中，筛选后得到转化子，提取质粒，得到pk18mobsacb/zwf-l。将该质粒再与右同源臂zwf-r同样通过酶切酶连结合，得到质粒pk18mobsacb/zwf-l/-r，即pk18mobsacb/δzwf。
同样地，根据c.glutamicumlys-χ中苹果酸酶male和异柠檬酸脱氢酶icd基因序列，设计相应的左右同源臂，使用上述同样方法，构建出质粒pk18mobsacb/δmale与pk18mobsacb/δicd。
根据ncbi中streptococcusmutansjh1005全基因组核酸序列中nad -依赖型异柠檬酸脱氢酶基因icdsm序列，在其基因序列上下游分别加入ecori和xhoi酶切位点序列并在其上游加入c.glutamicumsd识别序列gaaaggagatatacc，并提交给相应公司合成该序列得到含有序列，并通过ecori和xhoi酶切得到片段gaaaggagatatacc-icdsm，并于同样酶切的穿梭表达质粒pdxw-8酶连，得到重组质粒pdxw-8-icdsm。以该质粒为模板，以ptac-f/ptac-r为引物进行pcr，获得包含了启动子ptac和终止子rrnbt1t2的ptac-icdsm-rrnbt1t2表达框。随后将纯化后的pcr产物ptac-icdsm-rrnbt1t2与pk18mobsacb/δicdcg分别用sali单酶切，将目的基因片段ptac-icdsm-rrnbt1t2和载体pk18mobsacb/δicdcg酶切后的产物纯化并酶连。将酶连产物导入大肠杆菌中，筛选后得到含有重组质粒的重组菌株，提取质粒得到基因置换质粒pk18mobsacb/δicdcg::icdsm。
实施例2：nadph营养缺陷型重组菌c.glutamicumlys-χδzmicg::ism的构建
采用电转化法将构建成功的重组自杀型质粒pk18mobsacb-δzwf电转化至c.glutamicumlys-χ感受态中，经过含有50μg·ml-1卡那霉素的lbg固体培养基于30℃培养并筛选获得完成第一次同源重组转化子。再将完成第一次重组的转化子接入含100g·l-1蔗糖的lbgs液体培养基并于30℃培养，培养基中含蔗糖会导致含sacb基因的线性化整合质粒片段与基因组dna中目的基因进行第二次同源重组，lbgs培养的菌液在lbg平板上划线分离，经过pcr验证得到c.glutamicumlys-χδzwf。再通过相同的方法先后电转化质粒pk18mobsacb/δmale和pk18mobsacb/δicdcg::icdsm得到重组菌株c.glutamicumlys-χδzwfδmaleδicdcg::icdsm，即c.glutamicumlys-χδzmicg::ism(c.glutamicumlys-χ1)。考察重组菌株的l-赖氨酸发酵性能(图2)及胞内吡啶核苷酸含量(nad 、nadh、nadp 和nadph)(表2)。结果显示以葡萄糖为碳源时，重组菌株lys-χδzmicg和lys-χ1发酵液中检测不到l-赖氨酸的积累(图2c)。以葡萄糖酸为碳源时，重组菌株lys-χδzmicg(5.9±1.0g/l)和lys-χ1(7.2±0.4g/l)中l-赖氨酸产量有明显提高，但仍低于出发菌株lys-χ(15.4±1.4g/l)(图2c)。此外，以其他有机酸(如丙酮酸、α-酮戊二酸和草酰乙酸)为碳源时，重组菌株lys-χδzmicg和lys-χ1发酵液中检测不到l-赖氨酸的积累(图2c)。从表2可以看出，重组菌株lys-χδzmicg和lys-χ1胞内进行吡啶核苷酸含量时发现，在重组菌株lys-χδzmicg和lys-χ1胞内检测不到nadph(表2)。值得指出的是，当失活nadp -icd时胞内nadh水平和nadh/nad 比例显著下降，而将nadp -icd替换成nad -icd可显著提高胞内nadh水平和nadh/nad 比例(表2)。
表2：重组菌和出发菌胞内吡啶核苷酸(nad 、nadh、nadp 和nadph)含量
a：单位为10-4nmol/(104cell)
实施例3：含有不同强度启动子重组表达质粒px-pntab-gfp的构建
根据ncbi中e.colimg1655全基因组核酸序列中烟酰胺核苷酸转氢酶pntab基因pntab序列，添加限制性内切酶ecori和saci酶切位点设计出引物pntab-f和pntab-r。以e.colimg1655基因组为模板，pcr得到pntab基因片段。随后，采用限制性内切酶ecori和saci酶切质粒pecm和pntab基因片段，纯化后酶连，转化进大肠杆菌后筛选得到重组菌株，提取质粒后得到重组表达质粒pecm-pntab。随后，根据来源于aequoreavictoria的绿色荧光蛋白gfp氨基酸序列经密码子优化后，在其编码基因上游加入c.glutamicumsd识别序列并通过基因合成的方法连接到重组表达质粒ptrc-pntab中，从而获得目的重组质粒ptrc-pntab-gfp。为了获得不同pntab基因表达强度的重组质粒，将质粒pecm中的trc启动子通过融合pcr的方式替换成不同强度的启动子，从而获得重组表达质粒px-pntab-gfp。
表3：本实例中所用到的启动子序列
实施例4：不同nadph再生强度的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建
将上述不同强度启动子重组表达质粒px-pntab-gfp通过电转化法导入构建的nadph营养缺陷型菌株，筛选后得到不同nadph再生强度的谷氨酸棒杆菌重组菌株lys-χ1/px-pntab-gfp。对重组菌进行发酵水平与胞内辅因子水平的考察(表3)。
表3：重组菌胞内nadp( /h)和nad( /h)含量、菌体量和l-赖氨酸产量
a:单位为10-4nmol/(104cell)；b:单位为g/l；nd:未检测到.
随着胞内nadph水平的回补，菌体生长和l-赖氨酸积累也得到了一定的恢复。但是尽管重组菌lys-χ1/ptacm-pntab-gfp的细胞内nadph水平最高，但最终菌体量和l-赖氨酸产量并不是最高(表3)。通过分析不同胞内nadph浓度下重组菌株l-赖氨酸生产强度发现，菌体量和l-赖氨酸产量在胞内nadph水平一定范围内会随着nadph浓度的增加而增加，但是当超过nadph阈值时，会随着胞内nadph浓度的增加而降低(图3)。从图2中可以得知，当胞内nadph浓度在(3～7)×10-4nmol/(104cell)时，细胞处于最大l-赖氨酸生产强度。结合表3和图3的结果可以发现，当以强启动子控制pntab在nadph营养缺陷型c.glutamicum重组菌lys-χ1中的表达时，重组菌lys-χ1胞内nadph水平处在(3～7)×10-4nmol/(104cell)范围内，此时l-赖氨酸生产强度最大，其中以启动子pdapa-a16控制pntab表达时l-赖氨酸生产强度最高(即重组菌lys-χ1/pdapa-a16-pntab-gfp)，达到0.044g/(h·gcell)。然而，当以弱启动子或超强启动子控制pntab在重组菌lys-χ1中的表达时，l-赖氨酸生产强度为最大值的1％～70％。例如，以弱启动子ppck控制pntab表达的重组菌lys-χ1/ppck-pntab-gfp的l-赖氨酸生产强度为最大值的～10％，而超强启动子ptacm控制pntab表达的重组菌lys-χ1/ptacm-pntab-gfp的l-赖氨酸生产强度为最大值的～20％。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110>江南大学
<120>促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法
<160>37
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<210>5
<211>2932
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>5
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<211>60
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<213>（人工序列）
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<213>（人工序列）
<400>7
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<211>60
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<213>（人工序列）
<400>8
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<211>60
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>9
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<213>（人工序列）
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>11
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<211>60
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>12
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>13
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>14
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>15
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>16
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<212>dna
<213>（人工序列）
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>18
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>19
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>20
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<212>dna
<213>（人工序列）
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>22
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>23
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<210>24
<211>60
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>24
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<212>dna
<213>（人工序列）
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>26
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>27
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<211>28
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>28
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>29
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<210>30
<211>64
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>30
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aatt64
<210>31
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>31
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<210>32
<211>46
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>32
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<210>33
<211>62
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>33
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tt62
<210>34
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>34
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<212>dna
<213>（人工序列）
<400>35
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<211>93
<212>dna
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<400>36
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ccggttggttgggcaggagtatattgggatcca93
<210>37
<211>96
<212>dna
<213>（人工序列）
<400>37
caaaagctgggtacctctatctggtgccctaaacgggggaatattaacgggcccagggtg60
gtcgcaccttggttggtaggagtagcatgggatcca96
1.一种促进谷氨酸棒杆菌发酵生产目标产物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
s1、构建nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌：以生产目标产物的谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因male，同时将其nadp 依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的nad 依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm；
s2、构建重组质粒：设计不同强度的启动子序列，将烟酰胺核苷酸转氢酶基因连接到质粒上获得目的重组质粒，将目的重组质粒的启动子分别替换为不同强度的启动子，获得重组表达质粒；
s3、将重组表达质粒导入s1步骤构建的nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，筛选得到目标产物产量提高的重组菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf的核苷酸序列如seqidno.1所示。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的苹果酸酶基因male的核苷酸序列如seqidno.2所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的柠檬酸脱氢酶基因icdcg的核苷酸序列如seqidno.3所示。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的nadp 依赖型异柠檬酸脱氢酶来源于变形链球菌，为以下任一：
(1)氨基酸序列如seqidno.4所示的异柠檬酸脱氢酶；
(2)具有异柠檬酸脱氢酶活性的同工酶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的烟酰胺核苷酸转氢酶基因的核苷酸序列如seqidno.5所示。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的启动子的核苷酸序列如seqidno.17-31所示。
8.一种谷氨酸棒杆菌重组菌，其特征在于，所述的重组菌是在nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，以核苷酸序列如seqidno.16-30中的一种启动子表达烟酰胺核苷酸转氢酶；所述的nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌是以谷氨酸棒杆菌为宿主，敲除了其葡萄糖-6-磷酸脱氢酶编码基因zwf和苹果酸酶基因male，同时将其nadp 依赖型异柠檬酸脱氢酶编码基因icdcg替换为变形链球菌的nad 依赖性异柠檬酸脱氢酶编码基因icdsm。
9.根据权利要求8所述的谷氨酸棒杆菌重组菌，其特征在于，所述的烟酰胺核苷酸转氢酶以pecm为表达载体。
10.权利要求8所述的谷氨酸棒杆菌重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
s01、将编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因连接到质粒上，并将启动子替换为核苷酸序列如seqidno.16-30中的一种启动子，获得重组表达载体；
s02、将重组表达载体导入nadph营养缺陷型谷氨酸棒杆菌中，得到所述的谷氨酸棒杆菌重组菌。
技术总结