本发明涉及利用非离体的葡萄果实构建遗传转化体系的方法，属于基因工程领域。
背景技术：
我国是世界葡萄生产大国，葡萄栽培面积已达1198.5万亩，鲜食葡萄产量已稳居世界首位，葡萄栽培面积已跃居世界第二位。由于具有巨大的产业及经济价值，葡萄(主要是指果实)品质的提升问题一直以来受到广泛关注。葡萄果实品质，包括以糖含量为核心的食用品质和以色泽大小为核心的外观品质等，与葡萄的遗传基因和栽培条件密切相关，因此功能基因组学成为将基因与性状联系起来的必不可少的方法。随着葡萄基因组的测序完成，在过去的十几年中，研究人员已经进行了大量葡萄基因功能及其相互作用机制的研究。然而，由于葡萄缺乏高通量遗传转化技术(例如诱导的突变体收集)、遗传作图相对困难(等位基因多样性，嵌合体，较长的世代间隔等)、以及基因功能鉴定需要不断地进行重复验证工作，因此，需要一种稳定的、可重复性强的葡萄转基因技术。
人们已知的葡萄转基因技术主要涉及利用葡萄的离体叶片、叶柄、茎段，通过诱导愈伤，再借助农杆菌介导法侵染、筛选抗性愈伤，进行组织培养，最后获得转基因植株。实际上，比起葡萄的叶、茎或根等组织或器官，人们更关心转基因对葡萄果实产生的影响或者葡萄果实内部基因表达模式的研究。然而，一方面，对葡萄叶、茎或根进行转化后很难与葡萄果实生理生化的变化建立起直接的必然的关联，毕竟葡萄果实与葡萄叶、茎或根分属于完全不同的器官，它们的细胞、组织都具有完全不同的结构和功能，无法获得直接的证据；另一方面，葡萄的童期为1-3年，从获得转基因材料到获得果实相关指标周期较长，转基因工作繁重，成本较高，不利于大批量基因功能验证工作的展开。由于直接以果实进行转化既不需要进行组织培养，也不需要诱导愈伤组织。因此，亟需一种简便的、高效的能直接利用葡萄果实进行基因转化的方法。
另外，由于离体器官或组织(例如果实)脱离了树体本身，切断了与树体的整体关联(例如干扰了正常的生长发育、信号传递、物质运输与交换等)，一方面导致离体果实丧失了树体整体的系统协调性，即其对外部刺激(比如机械损伤、引入外源基因)的反应与实际生长中的果实的反应不同；另一方面“离体”也造成了组织内原有的细胞排列的紧密度、细胞间的微环境等发生改变，因此，将离体果实的转基因方法转用于非离体果实时，可能存在无法预料的、甚至完全相反的结果。由于人们更希望研究葡萄果实在自然的生长状态、在非离体的情形下对外部刺激的反应，因此，需要一种非离体的葡萄果实作为遗传转化体系。
目前，生物转化技术如农杆菌转化或病毒载体介导的植物转化，以及基于物理递送的方法如粒子轰击或微注射，在过去几年中已成为引入遗传材料到感兴趣植物细胞或组织中的主要技术。对于生物转化技术而言，病毒载体自身不稳定，且存在诱发植物病害的可能性，因此，农杆菌转化是更为安全的转基因技术。如今，科研人员已在许多园艺作物中利用农杆菌转化建立了成熟的果实瞬时转化体系。其中，大部分是通过将愈伤组织或离体组织与携带外源基因的农杆菌进行体外共培养完成转化，而这种方法很难用于非离体的、生长中的植物器官的转化。因此，科研人员希望通过更简便的操作(如直接涂抹或注射)将农杆菌菌液引入非离体的果实内部来完成对果实的充分侵染。
然而，与其它果树(如苹果、桃、柑橘)的果实、甚至与其他浆果(如西红柿、草莓)的果实均显著不同，葡萄的果实极为特殊。葡萄在果实发育的el31-el35时期，各种生理生化活动逐渐旺盛，是研究转基因果实的最佳时期，但与此同时，该时期内处于自然生长状态下的果实的果皮韧性很强，果肉致密而紧实，细胞间隙极小，细胞液微环境十分复杂，直接将注射器插入果实表皮进行注射将难以注入菌液，因为果实内部的致密结构和液体微环境会产生巨大阻抗力，导致科研人员无法正常地通过注射推入菌液，强行加大推注的力度反而会使菌液从果实扎针部位向外喷出，导致最终的转化率极低。例如，发明人曾不借助任何辅助手段，通过直接将农杆菌菌液注射入el31-el35时期的非离体葡萄果实进行瞬时转化，但这样的实验结果随机性较强，难以多次重复，且转化的失败率较高，无法形成一套稳定的、可重复的遗传转化方法以适用于未来产业化的葡萄果实转基因研究。
技术实现要素：
本发明要解决至少三个技术问题。第一、如何稳定地将侵染液注入el31-el35时期的非离体葡萄果实；第二、如何通过给el31-el35时期的非离体葡萄果实注入侵染液来获得高效瞬时转化的遗传转化体系；第三、如何获得用于转基因亚细胞定位研究的非离体葡萄果实。
为此，本发明提供了多个解决方案，并实现了多种优于现有技术的好效果，建立起了一套稳定的、针对自然生长状态下的非离体葡萄果实构建遗传转化体系的方法。
本发明涉及一种稳定的、可重复性强的果实遗传转化体系的构建方法；或者一种简便、高效的葡萄果实转基因技术；或者一种非离体的葡萄果实瞬时转化基因的方法；或者一种在非离体的葡萄果实中进行亚细胞定位的研究方法。
为了解决上述第一个技术问题，本发明采用在引入农杆菌菌液之前，在葡萄果实上先进行打孔的策略。发明人通过先在果实表面处打孔，再于非打孔处注射的方法稳定地将侵染液引入了葡萄果实内部。此时，对打孔的深度、密度、孔径等并无特别的要求，在本领域技术人员认为的合理范围即可。
然而，即使稳定地注入了侵染液，也并不意味着能够稳定地获得高效瞬时表达的效果；或者能够稳定地观测到清晰、完整的目标蛋白亚细胞定位图像。这可能与细胞受到机械损伤、外源侵染液刺激等而萎缩褐化有关。
因此，在先打孔再输注的思路上，发明人进一步研究了打孔的方式。在一种实施方式中，本发明的打孔部位和范围为果实表面约1/3面积处，用针头轻微刺破果实表皮即可，打孔的孔径范围在0.4-0.5mm之间(避免产生更加粗广的孔洞)。在一种实施方式中，该面积中打约9-35个孔，优选的，为20-30个孔或25-30个孔，以使扩大农杆菌侵染区域的同时，也能尽量避免细胞受损，能够同时实现瞬时表达和亚细胞定位的研究目的。
在一种具体的实施方式中，打孔后联合注射的方式如下：先用1ml注射器针头在葡萄表皮约三分之一表面积区域扎孔，待渗出部分汁液再注射，将注射器针头斜插入皮下(尽量减少针扎入的长度，更勿接触种子)，针尖斜口朝向已扎针的皮下，在距离表皮3-5mm的位置停留，轻轻注入农杆菌至附近针孔渗出新液体，再换另一处果皮下，以相同的方式注射农杆菌，约3-4次后可大致覆盖已扎针的表皮及皮下果肉。
发明人发现，上述打孔方式既能获得高效地瞬时转化效果，又能完成正常的亚细胞定位的观测，具有良好的稳定性和可重复性，完美地解决了上述第二、第三个技术问题。
此外，发明人还发现，若在注射后对果实进行适度喷水并遮光处理1天，农杆菌侵染效率会更高。
本发明建立的非离体葡萄果实遗传转化体系非常灵活、用于转基因功能验证的周期很短。若只做亚细胞定位或基因表达检测研究，则采用el31-35时期的果实均可，可选择性强；若要研究果实着色，可优选el34时期的果实，能在短时间如7天内看到着色表型。若要普适各种葡萄生物学研究，优选el33-35时期的果实。
定义
el31发育期的果实：果实硬且绿，豌豆大小，直径约为7-11mm。
el32发育期的果实：果实硬且绿，直径约12-16mm。
el33发育期的葡萄果实：果实硬且绿，直径17-22mm。
el34发育期的葡萄果实：果实刚开始变软。
el35发育期的葡萄果实：果实刚开始着色。
非离体，指植物处于自然生长状态下，正常生长发育中，而不是从植物整体(如果树)上采摘下来的部分器官、组织或细胞的分离状态。
favpt1：草莓液泡磷转运体，具有促进草莓成熟的作用。
打孔：也可以称为扎孔、扎洞、开孔等，例如：用针头轻微刺破果实表皮即可，而不必深入皮下、更勿接触果肉深层的果核或种子。
先打孔再注射：是指在果实上完成打孔操作后，再在未经打孔的果皮处进行注射，而不是在打孔后形成的原孔中进行注射。
本发明的优势在于：
第一、相对于在果实表面直接注射农杆菌(不先打孔)，本发明的方法不仅能稳定地向非离体葡萄果实内部注入侵染液，而且高效、可重复地实现了el31-35时期的非离体葡萄果实的遗传转化。
第二、本发明的打孔方式对细胞损伤较小，果实不仅能够正常发育着色，而且完全不影响转基因后的亚细胞定位的观测。
第三、本发明采用非离体果实，无需组织培养，可在一周内观测转基因果实的直观表型和分子的亚细胞定位情况，极大地缩短了实验周期。
本发明提供一种非离体的葡萄果实遗传转化的方法，其特征在于，先在葡萄果实表面打孔，然后再将农杆菌侵染液从果实的未打孔处注入果实内部。所述葡萄果实的发育时期为el31-35；所述打孔的部位和范围为果实三分之一表面；所述打孔的数量为：10-35个，优选为20-30个。
本发明提供一种非离体的葡萄果实瞬时转化的方法，包括以下步骤：先在葡萄果实表面打孔，然后再将农杆菌侵染液从果实的未打孔处注入果实内部。所述葡萄果实的发育时期为el31-35；所述打孔的部位和范围为果实三分之一表面；所述打孔的数量为：10-35个，优选为20-30个。
一种在非离体的葡萄果实中观测亚细胞定位的方法，其特征在于，先在葡萄果实表面打孔，然后再将含有目的基因的溶液从果实的未打孔处注入果实内部。所述葡萄果实的发育时期为el31-35；优选的，所述打孔的部位和范围为果实三分之一表面；优选的，所述打孔的数量为：5-35个，优选为10-20个，更优选为20-30个。
本发明的方法可以适用于其他果树或浆果的果实，尤其适用于葡萄的果实，特别适用于el31-35时期的葡萄果实；但反过来，其他果树或浆果的果实遗传转化方法不一定能够适用于非离体的el31-35时期的葡萄果实。
综上，本发明建立了一套完善的稳定的葡萄果实瞬时转化体系，不仅能稳定地向生长发育中的el31-35时期的葡萄果实注入外部液体(如侵染液)，而且能高效地进行瞬时转化、完整地观测亚细胞定位、在短时间(如7天)内验证出目标基因在葡萄果实中的功能。
附图说明
图1葡萄果实不同注射时期及注射部位注射后发育情况。
图2本发明的注射过程图。
图3转基因果实的表型图。
图4果实瞬时转化后基因的表达情况。
图5葡萄果实瞬时转化带荧光标签基因后第三天的荧光情况。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明以葡萄‘巨峰’(v.vinifera×v.labrusca，cv.kyoho)为例，阐述本发明的核心思想和主要内容，包括但不限于一些关键步骤以及最佳的实验方案。
实施例1葡萄非离体果实注射效果对比
侵染液准备：挑取favpt1oe农杆菌及空农杆菌(作为对照)单克隆菌斑，分别于5ml含相应抗性和利福平的lb液体培养基中，28℃小摇活化菌液。将活化好的菌液转接于50mllb液体培养基(加入卡那霉素和利福平)中大量扩繁，28℃220rpm转速下摇菌过夜。第2天5000g离心5min富集菌体，用侵染缓冲液(mes-koh(ph5.7)10mm,mgcl210mm)重悬菌液，清洗两次后调od，使菌悬液od600值为0.8-1.0，加入as至终浓度200μm，于28℃活化菌体2-3h。
葡萄果实发育时期的选取：el31-35时期。
葡萄果实瞬时转化方法对比：直接注射侵染液；先打孔再注射侵染液(本发明方法)。
葡萄果实表面打孔的部位对比：果柄与果实连接处；果实表面(本发明方法)。
葡萄果实表面打孔范围对比：全果打孔；果实超过1/3的大面积打孔；1/3果实面积打孔(本发明方法)。
葡萄果实表面打孔密度对比：在1/3果实面积上，扎9个孔、16个孔(本发明方法)、25-35个孔(本发明方法)、以及40个孔。
实验结果：
1、取el31-35时期的果实，直接注射侵染液几乎无法引入果实内部。以el31-32时期的葡萄为例，从果柄与果实连接处的茎部直接注射或先打孔再注射侵染液均可注入少量菌液，但是一些果实在后续发育过程中，会逐渐萎蔫(图1a)、脱落；当切开萎蔫果实时，发现扎针处及菌液侵染部位均出现褐化现象(图1b)。相反，先打孔再注射el31-32时期的葡萄果实，则可以稳定地注入侵染液。可见，从果柄与果实连接处的茎部注入侵染液不能稳定、高效地实现遗传转化的全过程。
2、取el31-35时期的果实，直接注射侵染液几乎无法引入果实内部，先打孔再注射侵染液可注入菌液，但大面积打孔后注射的果实，其扎孔处恢复较慢，易失水萎蔫；若果实整个表面(全果)均被扎孔后注射，则这些果实在操作后不久即完全萎蔫、褐化、脱落，无法正常发育(图1c)，从而无法实现后续的瞬时转化基因表达的研究或亚细胞定位的研究，只有在在1/3果实面积上，先打孔再注射侵染液可注入菌液可以完成所述研究。
3、取el31-35时期的果实，直接注射侵染液几乎无法引入果实内部，在1/3果实面积上，先打孔再注射侵染液可注入菌液。除了扎40个孔对果实损伤较大、易褐化难以痊愈外，扎35及以下的孔的果实通常均可正常发育，其中，扎30个孔时的遗传表型最为明显(如图1d为不同时期不同扎针数注射后第3天时的状态)。
实施例2对果实发育的影响
依照实施例1中本发明的方法，采用1ml注射器(江苏治宇医疗器材有限公司一次性使用无菌注射器带针，注射针规格:0.45×16rwlb，即直径0.45mm，长度16mm)在el34时期的葡萄果实表面扎30个孔(注射方式如图2)。注射前的果实如图3a，注射后第三天观察时扎孔处已愈合，果实可以正常发育(图3b)，第7天可看到约65％的favpt1oe果实已经明显着色，而ck果实只有个别开始转色，着色不明显(图3c)，说明本方法对果实造成的机械损伤不会抑制果实发育，可达到表型功能鉴定的效果。该实验重复3次，相比ck果实，明显促进着色的果实分别为66.7％(4/6)、63.6％(7/11)及70％(7/10)，表明本发明的实验重复性好，结果稳定。
实施例3基因表达分析
依照实施例1中本发明的方法，采用1ml注射器(江苏治宇医疗器材有限公司一次性使用无菌注射器带针，注射针规格:0.45×16rwlb，即直径0.45mm，长度16mm)在el34时期的葡萄果实表面扎30个孔(注射方式如图2)。分别取注射favpt1oe及ck后第7天的果实，去皮后将注射部位的果肉切下，液氮保存备用。使用华越洋gk型的rna提取试剂盒(货号0416-50)，分别提取样品的rna(按说明书步骤操作)，反转录成cdna，使用荧光定量pcr技术检测favpt1(能促进果实成熟、着色)的表达情况。实验共重复3次。
结果表明，favpt1oe中favpt1的表达量为ck的8.55倍(图4)，说明本发明在葡萄果实中进行的遗传转化操作获得了高效率的瞬时转化效果，实现了操纵基因的正常高效表达；同时表明本发明的实验重复性好，结果稳定。
实施例4亚细胞定位观测
由于favpt1定位在液泡膜上，故将液泡膜定位的marker基因连mcherry标签转化农杆菌gv3101。依照实施例1中本发明的方法，采用1ml注射器(江苏治宇医疗器材有限公司一次性使用无菌注射器带针，注射针规格:0.45×16rwlb，即直径0.45mm，长度16mm)在el34时期的葡萄果实表面扎30个孔(注射方式如图2)。将两种农杆菌1：1混合后，注射到el34阶段的葡萄果实中，注射后第三天取果肉，提取果肉的原生质体，利用共聚焦荧光显微镜(zeisslsm710meta,germany)观察yfp荧光发光情况。实验共重复3次。
观察发现favpt1-gfp与液泡marker蛋白γ-tip-mcherry的荧光能够完全重合(图5)，验证了favpt1定位于液泡膜。说明本发明的方法对细胞损伤较小，果实不仅能够正常发育着色，而且果实的亚细胞结构完整、能正常发挥功能，完全不影响对目标基因表达产物的亚细胞定位的观测，即将本方法用于蛋白或基因等分子的亚细胞定位研究也是可行的；同时表明本发明的实验重复性好，结果稳定。
以上对本申请具体实施方式的描述详细地公开了本发明的技术细节，并举例说明了本发明的技术思路，旨在满足专利法的授权规定，但不应反而被认为是对本申请保护范围的限制。该领域的科研人员可以根据本申请，结合彼时的植物生理生化知识与技术作出各种改变或变形，只要未脱离本申请的核心思路与精神，均应属于本申请所附的权利要求的保护范围。
1.一种稳定地向非离体的葡萄果实中输注液体的方法，其特征在于，先在葡萄果实表面打孔，然后再将液体从果实的未打孔处注射入果实内部。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄果实的发育时期为el31-35时期。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述打孔的部位和范围为果实三分之一表面。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述打孔的数量为：10-35个，优选为20-30个。
5.一种非离体的葡萄果实瞬时转化的方法，包括以下步骤：先在葡萄果实表面打孔，然后再将农杆菌侵染液从果实的未打孔处注射入果实内部；所述葡萄果实的发育时期为el31-35期，优选的，所述打孔的部位和范围为果实三分之一表面。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述打孔的数量为：10-35个，优选为20-30个。
7.一种在非离体的葡萄果实中观测亚细胞定位的方法，其特征在于，先在葡萄果实表面打孔，然后再将含有目的基因的溶液从果实的未打孔处注入果实内部；所述葡萄果实的发育时期为el31-35；优选的，所述打孔的部位和范围为果实三分之一表面。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述打孔的数量为：10-35个，优选为20-30个。
9.由权利要求1-8之一所述的方法获得的遗传转化体。
10.一种构建非离体的葡萄果实遗传转化体系的方法，其特征在于，先在葡萄果实表面打孔，然后再将含有目的基因的溶液从果实的未打孔处注入果实内部；所述葡萄果实的发育时期为el31-35；优选的，所述打孔的部位和范围为果实三分之一表面；更优选的，所述打孔的数量为：10-35个，优选为20-30个。
技术总结