本发明涉及基因工程
技术领域：
：，更具体地说，它涉及一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用。
背景技术：
：：柿(diospyroskaki)，属于双子叶植物纲，柿树科木本植物，高大落叶乔木，全世界柿属植物约有250种，有3000年以上的栽培历史，热带和亚热带为主要分布区域，其中作为主产区栽培最多的尤以中国、日本和韩国。柿起源于中国，为我国特色传统果种，种质资源十分丰富，其中作为果树被广泛栽培利用的分别有柿、浙江柿、油柿、君迁子等。根据联合国世界粮食及农业组织2018年发布的数据，我国柿树的采收面积占世界采收总面积的90.16％，柿的产量占世界总产量的67.26％。中华人民共和国农业部统计2016年不同地区的柿产量，以中国长江为界，排名前十的省份南北各占50％。柿作为浆果，维生素和糖的含量约为普通水果的1-2倍，它不仅可以直接食用，还可以间接加工成柿，柿醋，柿酒等。作为中国独特的果树，它富含胡萝卜素，维生素，钙，铁和其他矿物质(郗慧2015)，它对高血压有很好的缓解作用，并具有丰富的营养价值。根据akagi(2011)等人的报道，依照柿果能否在树上自然脱涩，将柿分为两大类：一类完全甜柿，另一类非完全甜柿，其中完全甜柿(pcna)中包含中国完全甜柿(c-pcna)和日本完全甜柿(j-pcna)(罗正荣2011，薛凡凡2019)，不论果实有无种子，完全甜柿均能自然脱涩。而非完全甜柿中包括不完全甜柿(pvna)、不完全涩柿(pva)和完全涩柿(pca)三类。近年来，甜柿逐渐开始推广，种植面积也逐年扩大，为革命老区等带来显著的经济效益。但病虫害的发生严重制约柿产业的经济发展，其中炭疽病的危害尤为严重。炭疽菌是侵染多种作物的一类重要的植物病原真菌，且侵染范围广，可侵染草莓、葡萄、西瓜、辣椒、茶树等重要经济作物，从而造成严重的经济损失。柿树适应性强，抗干旱和贫瘠，是西部一种重要的经济林树种。柿炭疽病严重威胁柿产业的发展，造成枝叶枯死，果实腐烂，严重时导致整株死亡。因此，要解决病害带来的问题，首先必须明确炭疽病的发生率，研究其抗病机理，进行功能验证，然后选择抗病品种。植物通过激活相关基因，从而进化出多种抵抗病原菌侵袭的防御机制，引起植物超敏反应、植物抗毒素的产生、细胞壁的木质化和强化，以及抗病相关蛋白的生物合成(jonesetal.2006)。一些特殊的转录因子家族，例如wrky转录因子家族，bzip转录因子家族等，在参与植物反应时，利用dna与蛋白的相互作用并通过结合防御基因的顺式作用元件，以此来触发植物的表达，相关反应基因通过信号传导途径和下游因子激活的表达，使植物体受到的生物胁迫或非生物胁迫最小化(eulgemetal.2007)。其次，一些nbs-lrr类抗病相关蛋白(r基因)在植物体抗病机制中也起到关键作用。柿炭疽病发病规律以及炭疽菌病原菌分离鉴定在一定程度上有了相关研究，然而对柿炭疽病的抗性机制及分子上的相关研究有所缺乏。因此，研究wrky转录因子在柿炭疽病抗性中的作用具有重大意义。技术实现要素：为解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用。本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：第一方面，提供了一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，所述wrky转录因子基因为dkwrky3，其核苷酸序列如seqidno：1所示。第二方面，提供了一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，所述wrky转录因子基因为dkwrky5，其核苷酸序列如seqidno：2所示。第三方面，提供了一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，所述wrky转录因子基因为dkwrky7，其核苷酸序列如seqidno：3所示。第四方面，提供了一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，所述wrky转录因子基因为dkwrky8，其核苷酸序列如seqidno：4所示。第五方面，提供了一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，所述wrky转录因子基因为dkwrky10，其核苷酸序列如seqidno：5所示。本发明通过侵染实验，对常见柿品种的炭疽病抗性进行了评价；5个与dkcad1互作的转录因子dkwrky3、dkwrky5、dkwrky7、dkwrky8、dkwrky10在高抗品种‘抗病尖柿’接种炭疽病原菌后具有明显的表达变化，参与柿炭疽病抗性。研究结果为柿炭疽病抗性分子研究提供科学依据。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1a是本发明田间接种柿炭疽病原菌后dkcad1的表达分析示意图，图1b是本发明田间接种柿炭疽病原菌后木质素含量测定结果示意图；图2是本发明‘富平尖柿’柿叶片瞬时过表达dkcad1后抗性评价及木质素含量测定结果示意图；图3是本发明炭疽病孢子液侵染嫩枝后各基因表达量变化结果示意图；图4是本发明wrky蛋白同源性对比示意图；图5是本发明亚细胞定位载体结构示意图；图6是本发明wrky在烟草叶片的亚细胞定位示意图，a为明场，b为荧光，c为细胞核染色，d为合并图；图7是本发明wrky蛋白自激活活性分析示意图；图8是本发明wrky蛋白与启动子dkcad1酵母验证结果示意图；图9是本发明wrky3蛋白酵母验证结果示意图。具体实施方式为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。试验材料及设备：感病品种‘富平尖柿’和抗病品种‘抗病尖柿’于侵染炭疽菌孢子后0d、1d、3d、5d、7d和10d的枝叶，rna提取试剂盒购买于天根，反转录试剂盒、定量试剂盒等购买于宝生物(takara)公司。试验仪器主要有超净工作台、高速冷冻离心机、紫外分光光度计、石英比色杯、显微镜、恒温培养箱、制冰机、磁力搅拌器、恒温水浴锅、pcr扩增仪、电泳仪、切胶仪等。实施例1：总rna的提取柿总rna提取采用rnapreppure多糖多酚植物总rna提取试剂盒(天根dp441)，研磨后操作都在超净工作台中进行。具体步骤如下：1、提前在sl裂解液中加入β-巯基乙醇至终浓度为5％：如475μl裂解液中加入25μlβ-巯基乙醇(裂解液现用现配)。将研钵及研棒浸于液氮，使其充满液氮，以充分冷却；2、将100mg左右植物组织叶片用液氮在预冷的研体中迅速研磨成粉末状，立即放入提前预冷并加好500μl裂解液的1.5ml离心管中，立即涡旋振荡使其充分裂解；3、离心机12,000×g离心10min，转移上清液至过滤柱cs上，12,000×g再离心2min，吸取收集管中的上清液至新的无菌离心管中，吸头尽量避免接触底部的细胞碎片沉淀；4、缓慢向离心管中加入0.4倍上清体积的无水乙醇，转移得到的所有溶液和沉淀到吸附柱cr3中，12,000×g离心15sec后，弃掉废液；5、继续向离心管中加入350μlrw1去蛋白液，离心机12,000×g15sec，弃废液；6、再向离心管中加入500μlrw漂洗液，12,000×g离心15sec，弃废液；7、重复步骤6，将吸附柱cr3放回收集管中；8、12,000×g空转离心2min，将吸附柱cr3转入一个新的rnase-free离心管中，室温放置晾干管内残余的乙醇；9、向吸附膜的中间部位滴加40μl预热无菌水，提高纯度，8000×g离心2min，-80℃贮存备用。实施例2：反转录合成cdna以侵染的柿枝条材料提取的rna为模板，利用试剂盒primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser(takara宝生物北京)，以下操作均在冰上进行，具体操作如下：1、基因组dna去除，去除gdna反应体系如表1-1所示。表1-1去除gdna反应体系table1-1reactionconditionofgenomicdnaelimination2、单链cdna的合成，反转录反应体系如表1-2所示。表1-2反转录反应体系table1-2reversetranscriptionreactioncondition20μl反应体系，37℃，15min；85℃，5sec；降温至4℃。反应结束后检测cdna浓度，用ddh2o进行一定浓度的稀释，保存-20℃备用。实施例3：dkcad1参与柿炭疽病抗性(一)dkcad1全长获取及启动子克隆木质素对于植物抵抗外界病原菌具有重要的作用，其中cad是木质素代谢的关键酶。基于已知的dkcad1序列信息，设计引物，pcr扩增、克隆测序后进行序列比对，获得dkcad1，cdna全长为975bp，启动子序列长度为828bp。(二)dkcad1在‘抗病尖柿’上接种炭疽病原菌后上调表达qrt-pcr分析显示，接种病原菌后dkcad1在极抗品种‘抗病尖柿’中明显上调表达，1d后其表达量即诱导上调9.5倍，之后表达量略有下降，但远高于‘富平尖柿’；dkcad1在高感品种‘富平尖柿’中则基本保持不变，受到炭疽病原菌的诱导不明显，如图1a所示。klason法木质素含量测定显示，‘抗病尖柿’中木质素含量高于‘富平尖柿’，如图1b所示。因此，可推测dkwrky的诱导表达与柿炭疽病抗性有关；木质素含量高低与炭疽病抗性存在密切关系。(三)瞬时过表达dkcad1显著增加柿叶片木质素含量及柿炭疽病抗性1、瞬时过表达如图2a所示，构建dkcad1过表达载体并通过真空渗透转化‘富平尖柿’叶片共6组平行处理，每组进行3次生物学重复，每次重复至少10个叶片，具体步骤如下：1)将含有重组目的片段的过表达载体通过热激法转入农杆菌gv3101感受态细胞，具体方法：农杆菌gv3101感受态放置冰上融化；每100μl感受态加入约2μl目的基因质粒，轻柔拨打管底混匀，立即于冰上先静置5min、接着放入液氮中速冻5min、水浴37℃5min、最后5min冰浴；向离心管中加入700μl无抗性lb液体培养基，28℃，220rpm下震荡培养2-3h；待培养完成，6000×g，离心1min收菌，留取100μl上清，吸打混匀；2)在lb固体培养基上(含kan100μg/ml，spec100μg/ml)划线，28℃暗培养2-3d；3)准备1mllb液体培养基(含kan100μg/ml，spec100μg/ml)挑取单克隆，28℃，230r/min过夜震荡培养，第二天转移至灭菌的50ml离心管中大摇，至菌液od值为0.6-0.8；4)3,000×g离心5min，收集菌体；5)重悬菌体于10ml清洗液(含10mmmes，10mmmgcl2，5mmas)，3,000×g离心5min收集菌体。继续用10ml清洗液重复以上步骤。最后重悬菌体于清洗液中至最终od值达到0.6；6)采用真空渗透法转化到‘富平尖柿’叶片中，过表达2d后接种炭疽病原菌，并于高温高湿条件培养，接种后5d进行抗性评价及木质素含量测定。通过实时荧光定量筛选出在柿抗性表达中较为突出的wrky基因：wrky1、wrky3、wrky4、wrky5、wrky6、wrky8和wrky10。2、结果分析如图2所示，其中2a：瞬时过表达dkcad1的柿叶片及其5d时的发病特征；2b：瞬时过表达2d后柿叶片中dkcad1的表达量；2c：瞬时过表达柿叶片接种炭疽病原菌5d时的木质素含量；2d：瞬时过表达柿叶片接种炭疽病原菌5d时的病情指数分析。‘富平尖柿’柿叶片瞬时过表达dkcad12d后其表达量有明显升高，其中过表达处理第2、5、6组(oe2、oe5、oe6)表达量上调均超过9倍，如图2b所示。选用oe2、oe5、oe6进一步接种炭疽病原菌，5d时木质素含量较对照均有显著升高，如图2c所示；同时oe2、oe6在5d时的病情指数也显著下降，说明过表达dkcad1后，高感品种‘富平尖柿’柿叶片的炭疽病抗性显著提高如图2d所示。实施例4：炭疽病抗性因子的筛选(一)荧光定量pcr以合成的cdna为模板，采用premixextaqii(takara宝生物北京)进行定量pcr，荧光定量的仪器是qutain@5，内参actin引物及定量引物见表1-3，具体反应体系及步骤如表1-4所示。表1-3实时荧光定量引物table3-3theprimersofreal-timefluorescentquantitative表1-4定量反应体系table1-4quantitativereactionconditionpcr反应程序：20μl反应体系，95℃5min；42个循环中包括95℃10s，60℃15s，72℃30s，每个样品三次重复。(二)wrky转录因子的筛选如图3所示，根据从已有转录组数据中筛选获得的16个wrky基因，通过数据库获得基因的核苷酸序列，设计定量引物，并通过实时荧光定量pcr进行扩增。采用2-△△ct相对定量的方法进行数据分析，观察各基因表达量的变化，并用origin进行作图。结果发现dkwrky3基因在‘抗病尖柿’中表达量逐渐降低，在高感品种‘富平尖柿’中表达量逐渐升高；dkwrky4和dkwrky6在‘抗病尖柿’中表达量变化不明显，在‘富平尖柿’当中表达量逐渐升高；‘抗病尖柿’中基因dkwrky5在侵染后表达量先降低后升高，并在第5d达到最低，在‘富平尖柿’中变化正好相反，在第5d时表达量达到最高；同dkwrky5相似，于侵染后第7d，可见‘抗病尖柿’中dkwrky7基因表达量最低，在‘富平尖柿’中最高；基因dkwrky8和dkwrky10随侵染时间的延伸，在‘抗病尖柿’中表达量逐渐升高，在‘富平尖柿’中逐渐降低。由此筛选得到候选基因：dkwrky3、dkwrky4、dkwrky5、dkwrky6和dkwrky7负向调控炭疽病抗性，而dkwrky8和dkwrky10正向调控炭疽病抗性。实施例5：dkwrky基因特征分析(一)目的基因的全长克隆1、pcr扩增选取侵染炭疽菌7d的‘富平尖柿’嫩枝作为材料，按照实施例1中方法提取植物组织rna，并反转录合成cdna。基于基因全长使用primerpremier5软件设计引物，如表1-5所示，以合成的cdna为模板，采用primestarmax试剂盒(takara宝生物北京)，进行cdna全长的扩增，具体操作如表1-6所示。表1-5wrky目的基因克隆引物table1-5primersforgenecloningofwrkytranscriptionfactors表1-6wrky基因克隆体系table3-6conditionforgenecloningofwrkytranscriptionfactorspcr程序为：50μl反应体系，94℃预变性4min；94℃变性40sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min。2、目的条带切胶回收扩增产物经凝胶电泳检测后进行切胶回收，利用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(生工上海)进行回收，具体步骤如下：1)将水浴锅调节至50℃，提前检查washsolution中是否加入无水乙醇，并检查bufferb2是否出现沉淀；2)在紫外灯下，用干净的手术刀将目的条带切下，放入离心管称重；3)加入300-500μl的bufferb2，50℃至胶块完全溶解(5-10min)；4)将溶好的胶液全部移入吸附柱中，于8,000×g离心30sec。弃废液；5)继续向吸附柱中加入500μl的washsolution，于9,000×g离心30sec。弃废液；6)重复步骤5)；7)空转离心管，9,000×g离心2min；8)准备一个新的1.5ml离心管，将空吸附柱转入，向吸附膜中央加入25μl预热的ddh2o；9)室温静置2min后于9,000×g离心1min，于-20℃保存dna溶液或直接用于载体连接。3、目的条带与载体连接将回收的目的条带与载体t-vectorpmd19连接，具体反应体系(10μl)如表1-7所示。表1-7连接反应体系table1-7reactionconditionforligation轻轻混匀并瞬时离心，在pcr扩增仪中恒温37℃30min。4、转化感受态细胞1)取感受态细胞dh5α(天根北京)置于冰上融化5-10min；2)将10μl连接产物与50μl感受态细胞进行吸打混匀，冰上静置30min；3)水浴锅42℃热激60sec，迅速置于冰上2-3min；4)继续向离心管中加入800μl无抗性的lb液体培养基，37℃230r/min复苏1h；5)复苏期间进行lb固体平板的制备：向冷却至50℃左右的固体lb培养基中加入对应的抗生素，摇匀后分别倒入无菌培养皿中；6)取复苏后的细胞溶液离心收菌，9,000×g离心1min，留取100μl吸打混匀，后均匀涂于带抗生素的培养皿上；7)培养箱中37℃倒置暗培养12-14h。5、阳性克隆检测与测序用无菌枪头挑取8个单菌落于10μl无菌水中，利用2×taqpcrmastermixⅱ试剂盒用于菌落pcr检测，检测引物为：m13f：catggagaaaatctggcatcatac；m13r：gaagcactgggtgctcttctg。反应体系(10μl)如表1-8所示。表1-8菌落检测体系table1-8conditionforcolonydetectionpcr程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，32个循环；最后72℃延伸5min，降温至4℃。反应结束后取5μl反应产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测，向有条带的菌液中加入800μl带抗性lb液体培养基，于37℃250r/min震荡培养10-12h左右。送测序。6、目的基因全长获取结合已有的转录组数据，结合染炭疽菌侵染试验，并依据候选基因的定量表达结果，获得基因序列，设计特异性克隆引物，以合成的质粒cdna为模板，借助rt-pcr技术扩增得到相应目的基因，对目的条带切角回收、克隆测序后，获得完整的开放阅读框。序列大小分别为wrky3：951bp，wrky4：912bp，wrky5：576bp，wrky6：771bp，wrky7：936bp，wrky8：1035bp，wrky10：1038bp。(二)wrky蛋白结构分析生物信息学分析，如图4所示，用ncbi中blastn和blastx对基因和蛋白的序列进行分析，根据wrky结构域分别划分候选的7个wrky蛋白。同源性比对利用生物信息学对wrky蛋白的组成及理化性质进行预测分析，序列比对利用dnaman软件完成；结果发现这七种wrky蛋白都具有典型的wrky结构域。(三)亚细胞定位1、质粒提取利用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取目的基因的质粒，具体操作步骤如下：1)首先检查bufferp1中是否已经加入rnasea，washsolution是否已经加入无水乙醇，bufferp2和bufferp3是否出现沉淀；2)取5-6ml过夜培养的菌液，8,000×g离心2min，收集菌体，弃尽培养基；3)向菌体沉淀中加入250μlbufferp1，彻底悬浮菌体；4)继续向离心管中加入250μlbufferp2，立即温和颠倒离心管7-10次混匀。室温静置2-4min；5)向离心管中继续加入350μlbufferp3，立即温和颠倒离心管7-10次混匀，12,000×g离心10min；6)小心将上清液移入吸附柱中，离心8,000×g，30sec，弃废液；7)继续加入500μl的washsolution，9,000×g离心30sec。倒掉收集管中液体；8)重复步骤8一次；9)空吸附柱于9,000×g离心2min，室温静置晾干离心管中的乙醇残留；10)将空吸附柱转入一个干净的1.5ml新离心管中，向吸附膜中央加入50μl预热的ddh2o。室温静置1min后，9,000×g离心1min，得到目的dna溶液。2、载体构建选用fastpfuflydnapolymerase高保真酶进行pcr扩增，以含有目的基因的质粒为模板，采用同源重组的方法进行载体构建，使用primerpremier5软件设计同源引物如表1-9所示，划线处为酶切位点。反应体系如表1-10所示。表1-9载体构建引物table3-9primersforvectorconstruction表1-10载体构建扩增体系table3-10conditionforamplificationonvectorconstructionpcr扩增程序：50μl反应体系，95℃预变性5min；95℃变性10s，58℃退火20s，72℃延伸1min，35个循环；最后72℃延伸5min。然后对pcr扩增产物进行克隆测序，切胶回收与上述相同。3、酶切及重组连接选用-basicseamlesscloningandassemblykit试剂盒进行目的片段的同源连接，如表1-11所示，通过同源重组法用限制性内切酶kpni、bamhi构建绿色荧光蛋白基因gfp2300表达载体pcambia35s::dkwrky::gfp，酶切体系(20μl)如下：表1-11双酶切反应体系table3-11restrictionenzymedigestioncondition轻柔混均后瞬时离心，针对不同酶的反应温度进行孵育，反应30min。酶切产物经1.0％琼脂糖凝胶检测后，切胶回收目的条带与上述相同。连接具体反应体系(10μl)如表1-12所示：表1-12载体构建连接体系table3-12conditionforvectorconstructionligation轻柔混合后，50℃反应15min。反应结束后，将离心管置于冰上冷却，将重组产物于-20℃保存或直接用于转化。4、瞬时表达重组载体35s-dkwrky1::gfp阳性克隆测序验证后，将含有重组质粒的大肠杆菌进行扩繁培养，按照上述步骤抽提质粒。35s-2300gfp设为对照。通过热激法将目的质粒转入农杆菌株gv3101，对烟草表皮细胞进行浸染。具体步骤如下：划线于lb固体培养基上(含kan100μg/ml，rif50μg/ml)，2-3d后挑取单克隆并活化菌体，先在1ml液体lb中小摇，再转入50mllb中大摇，最后用清洗液(含10mmmes，10mmmgcl2，5mmas)调节od值到0.6，选择生长6周左右的本氏烟草，用注射器将配好的菌液均匀注入整片叶片中。分别注射融合载体和对照载体。每个组合注射5-6张叶片，叶片随机分布在不同植株上；接着放置于恒温培养箱中，2d后，于激光扫描显微镜下观察gfp荧光信号。5、结果分析如图5与图6所示，依据生物信息对wrky蛋白亚细胞位置的预测结果，构建35s::dkwrky::gfp融合质粒，利用农杆菌gv3101瞬时侵染对该蛋白进行亚细胞定位验证，发现细胞核特异性染料dapi与gfp绿色荧光二者呈现影像能够完全重合，对照载体2300gfp在细胞核和细胞质区域都有明显的荧光信号，而dkwrky-gfp荧光信号主要分布于细胞核区域，且细胞质和细胞膜上无明显的信号。基于以上结果，表明dkwrky蛋白位于细胞核中。实施例6：dkwrky蛋白与dkcad1互作分析(一)wrky转录因子自激活活性分析1、载体构建转录活性分析选用pgbkt7载体，设计带有smai和bamhi酶切位点的引物构建bd-dkwrky载体，引物见表1-13，划线处为酶切位点。构建具体步骤与上述相同。表1-13bd载体构建引物table3-13primersforbdvectorconstruction2、自激活活性分析参照clontech酵母转化试剂盒(yeasttransformationsystem2usermanual)将插入目的片段的pgbkt7重组质粒转入y2hgold菌株中，涂布于sd/-trp(一缺)固体平板，30℃培养3-5d。挑取单克隆稀释，取5μl菌液在sd/-trp-leu-his x-α-gal(三缺)固体培养基平板上点斑，30℃培养3d后观察菌斑生长情况。结果发现dkwrky4和dkwrky6具有自激活。而dkwrky3、dkwrky5、dkwrky7、dkwrky8、dkwrky10没有出现自激活现象，如图7所示，说明这5个dkwrky蛋白可以作为诱饵蛋白在酵母中使用，来筛选其互作蛋白。(二)柿wrky蛋白与cad1基因启动子的互作验证1、载体构建根据pgadt7载体图谱，选用smai和bamhi进行双酶切，具体步骤参照上述方法。同源重组法构建ad-wrky载体，引物见表1-14：表1-14ad载体构建引物table3-14primersforadvectorconstruction2、酵母感受态制备及共转化酵母感受态制备具体步骤如下：1)取y2hgold细胞，在ypda固体酵母培养基上划线活化，放置30℃恒温箱培养3-5d；2)准备10ml离心管挑取单克隆，离心管内含有3mlypda液体培养基，30℃，250rpm振荡培养12-15h；3)准备250ml容量的三角瓶，加入50mlypda，将上述培养物转入，30℃，250rpm震荡培养16-20h，至菌液od600达到0.4-0.5；4)室温下离心1500×g，5min收集菌体，弃上清，向离心管中加入30ml无菌去离子水悬浮菌体；5)继续1500×g离心5min，用1.0ml1.1×te/liac溶解菌体，分装到1.5ml离心管中，每管500μl。6)酵母感受态制备好后，为保证转化效率，立刻转化效果最佳，也可在冰上保存几个小时，酵母共转化步骤如下：7)将下列各个成分加入到已预冷的1.5ml无菌离心管中，混合均匀：其中质粒dna100ng，变性的yeastmakercarrierdna5μl(沸水中煮沸5min，立即置于冰上迅速冷却)，500μl感受态细胞，500μl配好的peg/liac溶液，轻轻混匀；8)水浴锅30℃水浴45min(15min间隔颠倒混匀)；9)继续向离心管中加入20μl二甲亚砜(dmso)，轻柔颠倒混匀；10)42℃继续水浴15min(5min间隔颠倒混匀)；11)6000×g离心2min收集菌体；12)弃掉上清液，向离心管中加入1mlypdplus，于30℃摇床震荡培养1h；6000×g离心1min收集菌体；13)弃上清，向离心管中加入1ml0.9％(w/v)浓度的nacl溶液重悬菌体，在sd/-trp/-leu双缺陷培养基上涂板，30℃培养箱倒置培养3-5d。3、结果分析对实验室已克隆出的dkcad1启动子，利用酵母单杂的方法与dkwrky蛋白进行互作验证，如图8所示。结果显示共转化组合可以在sd/-leu和sd/-leu aba100培养基上生长良好，说明候选的dkwrky蛋白与启动子dkcad1在酵母中存在互作。(三)柿wrky蛋白与候选互作蛋白的酵母双杂验证以柿cdna为模板，利用特异性引物分别扩增目的基因：r-1、r-4、r-5、r-6和bzip-12、bzip-15、bzip-16、bzip-17。分别构建ad-wrky载体，引物见表3-15，具体步骤方法同3.4.2.1-3.4.2.3稍有改动，酵母感受态制备及转化参照上述方法。1、载体构建以质粒dna为模板，利用特异性引物，与酵母双杂交载体连接，使用同源重组法分别构建融合载体ad-r-1、ad-r-4、ad-r-5、ad-r-6和ad-bzip-12、ad-bzip-15、ad-bzip-16、ad-bzip-17，具体步骤参照上述方法。2、酵母感受态制备及共转化，具体步骤参照上述方法。3、酵母双杂验证筛选互作蛋白将在sd/-trp-leu(二缺)培养基上生长出来的单克隆溶于无菌水中，稀释后在sd/–ade/–his/–leu/–trp x-α-gal四缺培养基平板点斑，30℃培养3～4d。观察结果并拍照，结果如图9所示。结果发现只有dkwrky3蛋白有所变化：此蛋白可能与蛋白r-4、bzip12、bzip16和bzip17存在互作。综上，通过侵染实验，对常见柿品种的炭疽病抗性进行了评价；5个与dkcad1互作的转录因子dkwrky3、dkwrky5、dkwrky7、dkwrky8、dkwrky10在高抗品种‘抗病尖柿’接种炭疽病原菌后具有明显的表达变化，参与柿炭疽病抗性。研究结果为柿炭疽病抗性分子研究提供科学依据。本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。sequencelisting<110>烟台市农业科学研究院<120>一种柿wrky转录因子基因及应用<130>5<160>5<170>patentinversion3.5<210>1<211>951<212>dna<213>人工序列<400>1atggaatatatcagtttgttggacacttcactggatcttaatgccaatcccatgagattt60ctggatgaagctccgatcaataaaggggcagaaaacaatttctttgagttggagaagaag120acttcagtgaaagaagagacaagtgctctagtggaggaactgagccgggtgagtgcagaa180aacaagaagctgacagaaatgttgacagtcttgtgcgagaactacaacaatctgcgaagc240catttgatgaattacgcgagcaagaaccctgacagggagcatgccatgtcgaggaagagg300aaggccgaaggcggtgccgccacaaacaagaacagtgtttccaacaatggaggaaactca360gagagcagctcaagtgatgaggattcatgcaagaagcctagggaagaacatgtcaaggcc420aagatctcaagggtctgtgtaagaactgaagcatccgatacaagccttgtggtgaaagat480ggatatcagtggaggaaatatgggcaaaaggtcactagagacaacccttgtccaagagct540tacttcaaatgctcttttgcccctgcttgcccagtcaagaagaaggtgcaaagaagcgta600gaggaccaatcaatagtggtggcgacatacgaaggggaacacaaccacccacacccctcg660aggcacgagtcgtcgacctcgagcgccagccggtgtgtggcggcgcaggggtcggtgcct720tgctcggcctcattggcaccaaccatcactcttgatctcacaaagcctatgcccaacggt780gccaaagattcaagcaggacgggggcgttgggggcgccggatgttcaagagtttttggtt840gagcagatggcttcttccttgaccaaagatcccagcttcaaagccgccttggcggctgcc900atttccagaagaattatccaagatgatcgccatcagacagaaaaatggtga951<210>2<211>576<212>dna<213>人工序列<400>2atggagaattacggtggagtttttccatgttcgtcttcagcatcatcggcgcctcagttg60tcgctcaacgtgctggattccaatgcttactccgaatttcaagcggccgacaaatcgcat120ggattcttggggttgacggccaacgacatgggacttccgaactcggaggttaatttgatg180aacgatgcttgtcgcggccaaagctttgcttccactgtcaccactgatcaaactgatcgc240gagatgaaatcgtcatcatcggggaagaagaagggcgagaagaagatcaggaagcctaga300ttcgctttcgaaacgaggagccaagttgatattctcgacgatggctatagatggaggaaa360tatggccagaaagccgtcaagaacaacaggtttccaagaagctattatcgatgtactcat420caaggctgtggtgtaaagaaacaagtccagcgcctatcgaaggatgaagcagtagtggta480acaacttacgaaggaatgcactcgcatccaatcgagaagtcaaccgataactttgagcac540atactgaaccagatgcagatctacactgccttttaa576<210>3<211>936<212>dna<213>人工序列<400>3atggggactctcttgccgggaaaatcctgcggtacccggcgaagggcggtggagaagctg60gtccagggccgggatttggcgggccagcttcagattctgcttgagaagcccgccggaggt120tgcggatctgtctcggccgaggagcttgtggtgaaaatcttggcgaccttcaccgagact180ctctctgtgctggaattttgtgattccggcgaggattcccagtttccggcggctactcca240gtggggtctcccagcttcggtgaccaggcgtcggttgactccggggagagtagcaagcgg300ccggcggcggcgaaggaccggcggggctgttacaagagaagaaagactgcagattcatgg360acaaaaatctcgaactcggctcaagatggctacgcatggaggaagtatggacaaaaggaa420atcctgaacgccgacttccccaggtgctactataggtgcacacacaagcctgatctaggt480tgcaaagcaacaaaacaagttcagaagattcaagaagatcccatcatctaccaaagcaca540tacttcggccaccatacttgcggaaacacagctcagagatcagcttcccaagacatctca600gatgatcattctgatcctgcgagatcttttattctagaattcgaaccaaagggccaaatt660agtgaagatccgccccacggccacggcctctctaatttcccagtgcctgtaaaagtagag720gagcctaaaattaaggtatcatcatctctgggctctatccaattgcaggatctattttta780atgccatctttggagggtaccgtgaagttctctgaacatgaagatgtaatctctagcaat840gtgtattcatctgcatctactggttctgaaggccttgttgatgacatgaactatctgatt900gatgttgatggtgatgatttttgggaattaccttag936<210>4<211>1035<212>dna<213>人工序列<400>4atggaggaggttgaaaaagccaataaagcggcggtagagagctgccagagagtcgttaat60ctcctgtgccactcgcaggatcaggttcagtttaaacacttaatggtggaagcaggggaa120gctgtgaccaggttcaagagggtgatttctcttctcggcaatggcgtcggccacggcagg180gtcagaagccttcgcaagatgaagaaaccatctttatcccaccacctgctcgtggaaagt240cccagctgccaccaaaccaatccgactccaaatgacaagcccctccagcttctgccctct300agattcccggaaaacccaacttctttgcagctttcgcagaaaatgtttctagagaatcct360gctctggatggtgccggttcgtccatgaagattcctctgcaagctgttcagcctaggcca420ttgcagccccatcatcttcttcagatgcagaggctgcagcttcagcaacagatgaagtat480cacgctgagatggtttattctaggagtactaacagtggtgtaaatctcaaatttgatggc540tctagttgcacacagaccctttcatccaacagatcgttcatctcatctctgagcgtggat600ggtagtgtggtaaatttggacgggaattcgttccatttgatcggcgtgccgcagccttct660gatcagacttcccagcaatccaggaggcggtgcagtggtcggggagacgatgggagcgtg720aaatgtggtagcagtagtaaatgtcattgctccaagaggaggaaactgagggtgaagaga780tcaattaaggtgcctgccatcagtaacaaagttgcagatattccgcctgatgagtattcc840tggaggaaatatggacagaaacctatcaaaggatccccacatcccagggggtactacaaa900tgcagcagcgtgagaggctgcccggcaagaaaacatgtcgagagatgcttggaagattct960gcgatgctaatagtgacctacgaaggcgagcacaaccattctaggttactactgccacag1020tctgccaatacataa1035<210>5<211>1038<212>dna<213>人工序列<400>5atggaatccccatccatttgtcacgatgatcatccgataagggccgcccttcaagaattg60aatcgaggccgggaattagcaaagcagctgatgagagttgttcctggcaggaagcagccc120cttgactttgatgatgagggtggattgaggaccgtcaagaatctcgccacgagcatctcg180gcttcctttacggaggctatttcaatactcaatcaaagtggcagtgccgccgccgacgac240gaaaccagccgaagttgggcgtccccagacggcagagcccgtcacaacaacaagagaaga300aagaatttgcatacatgggcaaagctcgcccctgctttagccgacgatggccatgcctgg360aggaaatatggacagaaagacatcctcaatgcgcagtacccaaggaactactacaggtgt420agccacaagtatgatcaggggtgccaagccaccaagcaggttcagagaaccgcaaccgat480ccacccatgtaccgcatcatttactacggcgaccacacctgccgaagtctatctaatcta540aaacctccccgccatcagtctcagatcatcttgaattccactgatggtccctcttcgcgt600ctacttagcttctgctccaatcccatccctaacccggttggcgccaaaccacaatctcat660gaagatgacgatggtgatctgctgcttttcccgatggcggtggcgaaacatcagagccag720agccagagtcagaaacagaggccgcttggcgctcgaccagcacctccattaacaacgtct780tcctccttctccggagattatttcctgtcgccggatgtgatgacgctggactcgtctgcc840ccccccatgactgtgttgtcttcggcgtccgatcagggggagccggacgtcatatctcct900ggggtgtactcgtgtacgaccagcactgatcgcactcacaatacttgcactgatgattac960gatcatcatcatgccttggacctggacatggacatcatggtgggagatgattttggggat1020gtctttcttgcaatatga1038当前第1页1 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技术特征：1.一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，其特征是，所述wrky转录因子基因为dkwrky3，其核苷酸序列如seqidno：1所示。
2.一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，其特征是，所述wrky转录因子基因为dkwrky5，其核苷酸序列如seqidno：2所示。
3.一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，其特征是，所述wrky转录因子基因为dkwrky7，其核苷酸序列如seqidno：3所示。
4.一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，其特征是，所述wrky转录因子基因为dkwrky8，其核苷酸序列如seqidno：4所示。
5.一种柿wrky转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，其特征是，所述wrky转录因子基因为dkwrky10，其核苷酸序列如seqidno：5所示。
技术总结本发明公开了一种柿WRKY转录因子基因在提高柿炭疽病抗性中的应用，涉及基因工程技术领域，其技术方案要点是：所述WRKY转录因子基因为DkWRKY3、DkWRKY5、DkWRKY7、DkWRKY8、DkWRKY10中的任意一种，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1所示、SEQ ID NO：2所示、SEQ ID NO：3所示、SEQ ID NO：4所示、SEQ ID NO：5所示。本发明通过侵染实验，对常见柿品种的炭疽病抗性进行了评价；5个与DkCAD1互作的转录因子DkWRKY3、DkWRKY5、DkWRKY7、DkWRKY8、DkWRKY10在高抗品种‘抗病尖柿’接种炭疽病原菌后具有明显的表达变化，参与柿炭疽病抗性。研究结果为柿炭疽病抗性分子研究提供科学依据。
技术研发人员：杜晓云;关长飞;王彦波;杨勇;王孟珂;于晓丽;张硕;赵玲玲;牟红梅;慈志娟
受保护的技术使用者：山东省烟台市农业科学研究院
技术研发日：2020.12.10
技术公布日：2021.03.12
