本发明涉及转基因研究领域，主要是一种转座因子载体及获得其无选择标记转基因后代的方法。
背景技术：
dna载体应用于植物遗传转化研究领域时，通常会包含一个能表现抗生素抗性或除草剂抗性的选择标记基因，在植物遗传转化过程中用于筛选转化细胞。然而，标记基因在转基因植物体内长期保留，可能会对人类健康安全和周遭环境造成潜在的危害，当植物转化完成后，需要剔除选择性标记基因。创制无选择性标记转基因植株可避免这些风险并促进转基因植物的商业化种植。因此，近年来，建立高效而可靠的无选择标记转基因技术，已成为转基因育种应用的研究热点。
基于玉米ac/ds转座因子的转座因子介导的转基因重整合方法，把目的基因置于ds因子内部，通过t-dna转化把携带目的基因的ds因子、ac转座酶基因以及转化选择标记等导入植物基因组。在ac转座酶作用下，ds从t-dna整合位点转座到另一位点，然后通过遗传重组和遗传分离，产生无t-dna和稳定遗传的ds个体，从而获得无选择标记目的基因植株。转座子技术相对于其他无选择标记系统具有两个主要的优点：第一，通过ds转座，只需要获得少数初始转化植株，就可以在分离世代通过繁殖获得目的基因独立整合的后代群体，以便筛选合适的转基因整合位点，避免转基因表达水平受“位置”效应的影响。第二，带有目的基因的转座因子，在植物基因组中稳定转座后，其插入边界清楚、转基因dna结构变异的频率较低，有利于目的基因的稳定表达。
最初，goldsbrough设计的t-dna转化载体含有nptii选择标记基因、无转座功能的顺式ac转座酶基因以及嵌合在ds元件中的gus报告基因。在转化番茄之后，ds/gus元件转座到非连锁的位点，并在转化体自交之后与nptii发生分离，从而产生了去除nptii或者ds/gus的转基因后代。然而，稳定的ds插入系的鉴定常常依赖于对大量的转基因后代进行southernblot印记杂交分析，这种方法费力且效率低。
在gao等(2015)建立的单荧光蛋白遗传标记的ac/ds转座因子系统中，通过gfp荧光检测区分携带t-dna选择标记的转基因后代和无选择标记的后代。剔除gfp荧光阳性植株，然后对阴性植株进行ds和目的基因序列的pcr检测，筛选无选择标记的ds植株。必须指出的是：在上述单荧光蛋白标记的ac/ds转座因子载体的转基因植株群体中，由于gfp基因可能被就近转座的ds因子插入失活，或因为植物转化过程中t-dna发生重组，一定比例的植株的gfp基因表达受到影响，因而一部分荧光检测呈阴性的分离植株仍然携带转化标记或t-dna序列。为了对上述转座子系统进行改进，本研究构建了携带gfp绿色荧光蛋白和mcherry红色荧光蛋白的双荧光蛋白标记的ac/ds转座因子载体，显著提高了选择系统的稳定性，降低了上述“伪”无选择标记目的基因植株的筛选频率。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种转座因子载体及获得其无选择标记转基因后代的方法，即一种产生无选择标记转基因植物的转座因子载体及其转基因后代的筛选方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。一种产生无选择标记转基因植物的转座因子载体，通过以下步骤构建：1)将绿色荧光蛋白基因(gfp)、红色荧光蛋白(mcherry)、潮霉素抗性选择标记基因(hpt)、来源于玉米的ac转座酶基因(actpase)和ds转座因子串联组装在一起，构建转座因子载体pbdl11，其中ds因子不带有任何选择标记，并且预先在其内部设计一个asci单酶切位点；2)构建一个在多克隆位点两侧均含有asci酶切位点的中间载体pbdl11，以组装任意目的基因，然后将目的基因切下并克隆到ds因子内部。
作为优选，步骤1)具体地说，分别将不能移动的ac转座酶基因(actpase)、绿色荧光蛋白基因(gfp)、具有转座能力的ds因子、红色荧光蛋白(mcherry)以及潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)顺次组装为顺式ac/ds转座因子载体pbdl11；由于该载体同时含有actpase和ds，所以当t-dna转入植物细胞后，便会发生ds的转座行为；在ds内部设有一个稀有的八碱基asci单酶切位点，以便再导入目的基因；随着ds在植物基因组的跳跃，目的基因也会整合到基因组中新的位置；而hpt被用作转基因的抗性选择标记。作为优选，步骤2)具体地说，在克隆中间载体pbdl11的多克隆位点两侧设计asci双酶切位点，可以将任意不含该位点的目的基因组装其内，随后将目的基因从中间载体释放出来，导入到与之配套的ds因子的asci酶切位点。
一种转座因子载体的转基因后代的筛选方法，包含以下步骤：1)在转化水稻的过程中，gfp和mcherry用作报告基因正向筛选t0代被转化的阳性植物细胞和植株，而在t1代以及后续分离世代，gfp和mcherry用作负选择标记以筛查并淘汰含有t-dna的gfp和mcherry双荧光或单荧光阳性植株，从而富集荧光阴性植株中非连锁的ds(目的基因)转座事件；2)将荧光阴性植株的叶片混合成池，提取混池样品dna并通过pcr检测目的基因，然后对阳性混池中的每一个体分别进行目的基因的检测，由此获得的阳性植株便是无选择标记的转基因个体。
作为优选，步骤1)具体地说，在愈伤组织的选择培养、分化培养乃至阳性t0植株的筛选等过程中，可以通过台式荧光检测器检测水稻的转化愈伤组织细胞和转基因植株的绿色荧光和红色荧光，以区分成功的转化事件和未成功的转化事件；从t0代阳性植株收获t1代种子，在其发芽之后，按照同样的方法观察t1代幼苗的绿色荧光和红色荧光，以负向选择的方式淘汰那些带有双荧光或单荧光的含有t-dna(包括gfp基因、mcherry基因、潮霉素抗性选择标记、ac转座酶)的t1代植株，同时，那些转座到t-dna附近的非连锁转座事件也被剔除；最终，将非连锁的ds(目的基因)转座事件富集到荧光阴性的无选择标记后代当中；t2代乃至更多的分离世代，也可以按照上述方法筛选非连锁的ds(目的基因)转座事件。
作为优选，所述步骤2)具体地说，在转基因分离世代(t1、t2等)，在完成荧光阳性植株的负选择之后，将5-8个荧光阴性植株的叶片等量混合，构成混合池，提取混合池样品dna，通过pcr检测目的基因，以筛选带目的基因的无选择标记混合池；然后对阳性混合池中每一个体分别进行目的基因的检测，从而获得带有目的基因的无选择标记植株。通过这种dna混合手段，可以对荧光阴性群体中含有目的基因的无选择标记个体进行高通量的筛选。
发明有益的效果是：本发明将基于gfp荧光筛选的负选择方法，与基于gfp阴性混合池中目的基因的pcr检测的正选择方法相结合，建立两步筛选法，从而可以从ac/ds转座因子载体的转基因后代高效地筛选无选择标记的转基因个体。本发明将基于gfp和mcherry双荧光筛选的负选择方法，与基于荧光阴性混合池中目的基因的pcr检测的正选择方法相结合，建立两步筛选法，从而可以从ac/ds转座因子载体的转基因后代高效地筛选无选择标记的转基因个体。
附图说明
图1用于产生无选择标记转基因植物的双荧光蛋白ac/ds转座因子载体。
a，pbdl11和plj26(gaoetal.,2015)分别为转座因子介导的转基因重新整合的双荧光和单荧光通用载体，pbdl11和plj26的ascⅰ位点用于插入目的基因。actpase，ac转座酶；gfp，绿色荧光蛋白；ds，ds转座元件；mcherry，红色荧光蛋白；hpt，潮霉素磷酸转移酶；lb和rb，t-dna左边界和右边界序列；b，ds介导的转基因重新整合示意图，在actpase存在的条件下，基于ds的目的基因从t-dna上切离并整合到非连锁的染色体位点。转座的ds与t-dna发生重组便产生无选择标记的t1代植株。goi，目的基因；
c，ac/ds载体pbdl23和pbdl22的ds原件中含有水稻抗稻瘟病基因pi21的rnai表达盒，可用于无标记转基因水稻植株的转化。
图2ac/ds转座因子载体pbdl23和pbdl22转化的水稻愈伤组织中的荧光蛋白表达。
a，携带pbdl23或pbdl22载体的农杆菌共转化水稻愈伤组织，在潮霉素选择培养基上培养19天后，进行第二轮选择培养，并进行gfp和mcherry荧光可视化筛选；
b，作为对照，源自单荧光ac/ds转座因子载体plj26(gaoetal.,2015)的pbdl22转化水稻愈伤组织，并进行gfp荧光检测。
图3pbdl23t1混合池目的基因与t-dna序列的检测。
a，通过4对引物检测pbdl23t1混合池是否带有目的基因；
b，pbdl23t1混合池t-dna序列的检测。
c，通过4对引物检测pbdl23t1单株水稻是否带有目的基因；
d，通过4对引物检测pbdl22t1单株水稻是否带有目的基因。
图4pbdl23无选择标记植株southern分析。
a，使用ds探针的southern杂交结果；
b，使用gfp探针的southern杂交结果；
c，使用hpt探针的southern杂交结果。
图5pbdl23无选择标记水稻pi21转录物水平的实时定量rt-pcr分析。
横轴:野生对照日本晴，以及14yd270-1、14yd273-2、14yd271-3共3个株系的t2代纯合子植株；纵轴:pi21基因的相对表达量(osef-tu基因作为内参比)。
图6pbdl23无选择标记水稻与对照株系接种tmc-1的抗病表型。
pi21-rnai-mf:t2代纯合株系14yd270-1；npb:日本晴；co39:感病品种；pi9:抗病品种。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明做详细的介绍：
实施例：以水稻抗稻瘟病基因pi21的rnai表达盒为例，通过ac/ds转座载体，高效筛选无选择标记转基因抗稻瘟病水稻种质材料。
载体构建：首先，将绿色荧光蛋白基因(gfp)、红色荧光蛋白基因(mcherry)、潮霉素抗性选择标记基因(hpt)、来源于玉米的ac转座酶和ds转座因子串联组装在一起，构建转座因子通用载体pbdl11，随后将目的基因pi21-rnai表达盒导入ds元件，形成终载体pbdl23。同理将目的基因pi21-rnai表达盒导入单荧光通用载体plj26的ds元件，形成对照载体pbdl22。
其中产生无选择标记转基因植物的转座子的双荧光和单荧光通用载体，pbdl11和plj26、目的基因pi21-rnai的转座载体pbdl23、以及对照转座载体pbdl22，如图1所示。具体地说：从载体pbdl09扩增“camv35s:mcherry:tnos”表达框，其pcr引物为mcherryinf(5’gggggcccggtaccgagctccccctcagaagaccag3’)和mcherryinr(5’atgattacgaattcgagctagatctagtaacatagatgacaccgc3’)。将saci酶切的plj26(gaoetal.,2015)大片段，与以上pcr扩增产物通过无缝克隆试剂盒(in-fusionhdcloning,clontech,usa)进行连接，构建pbdl10a。以上无缝克隆引物的个别碱基序列通过适当调整，使pbdl10a中的mcherry表达框靠近gfp的一侧保留单个sacⅰ酶切位点(在以下每个用asci酶切进行无缝克隆的步骤中，引物序列也做适当调整，使插入片段只有一侧保留asci切点)。然后通过sacⅰ酶切从plj26回收ds因子片段，插入pbdl10a的saci位点，得到pbdl11载体。水稻actin1启动子序列通过引物bdl14-f4(5′ctaattgaatggagcgccgtcgaggtcattcatatgct3′)和bdl14-r(5′gcaggaattcggcgcgcccctacaaaaaagctccgcac3′)进行扩增，模板为pzj63。通过无缝克隆方法，向pbdl11的ds内部的asci切点插入actin1启动子序列构建pbdl14。pbdl14只在actin1启动子下游保留单个asci切点。再通过无缝克隆向pbdl14的actin1启动子的下游插入t3apolya加尾序列，构建pbdl15。扩增t3apolya加尾序列(pisumsativumrbcs-3apolya)的pcr引物序列为pbdl15-f(5′tttttgtaggggcgcgccagctttcgtccgtatcatcg3′)和pbdl15-r1(5′gcaggaattcggagcacctcgacacaaaaagcctatac3′)，模板为pzj70。用ascⅰ酶切pbdl18，回收表达水稻稻瘟病抗性的pi21-rnai表达框(fukuokaetal.,2009)，插入pbdl15的asci位点，构建双荧光蛋白ac/ds转座因子载体pbdl23。同时向plj26载体(gaoetal.,2015)的ds因子内部插入pi21-rnai表达框，构建作为对照的单荧光蛋白ac/ds转座因子载体pbdl22。pbdl22通过如下步骤构建。首先从pbdl07无缝克隆扩增actin1启动子序列，插入plj26的asci酶切位点，构建pbdl20载体。从pbdl07无缝克隆扩增t3apolya加尾序列，插入pbdl20的ascⅰ切点，获得pbdl21载体。ascⅰ酶切pbdl18，回收pi21-rna表达框，插入pbdl21，得到pbdl22载体。
水稻转化和转化植株的荧光检测：载体经过酶切和测序验证正确之后，通过电激法分别转化农杆菌菌系eha105。取日本晴(npb)水稻种子，去壳和表面灭菌，在含2,4-d的nb培养基上进行愈伤组织诱导培养。水稻愈伤组织分别与以上农杆菌转化菌株共培养(co-cultivation)，3天之后用无菌水洗去愈伤组织上的农杆菌，在含50mg/l潮霉素的nb选择培养基上进行选择培养。选取抗潮霉素的转化愈伤组织，在分化培养基上进行分化培养，获得再生水稻植株。通过灯式荧光检测器(fluorescentproteinmacrodetectorset,biologicallaboratoryequipmentmaintenanceandserviceltd,budapest,hungary)检查再生植株的gfp和mcherry荧光信号(图2)，作为选择水稻初级转化体(t0代)的标准。对于pbdl23转化水稻材料，留下双荧光(gfp 和mcherry )的t0代植株，筛除单荧光(gfp 或mcherry )和无荧光(gfp-和mcherry-)的植株。对于对照材料pbdl22转化水稻，筛除无荧光植株，仅留下绿色单荧光t0代植株。将多个独立转化的pbdl23和pbdl22水稻转化苗(t0代)转移到土壤并在成熟时收获t1种子。
无选择标记后代植株的筛选：从独立转化的pbdl23株系与pbdl22株系，各取100粒t1种子发芽。对转pbdl23水稻幼苗进行绿色荧光和红色荧光检测(表1)，对pbdl22幼苗进行绿色荧光检测(表2)，大量、快速地筛除双荧光或单荧光阳性转基因后代植株。取5-8个荧光阴性植株的叶片等量混合，构成混合池，利用tps法小量提取混池样品dna，pcr检测混池样品的目的基因(图3a)，反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s，36cycles；72℃延伸7min；4℃保存。然后分别提取阳性池中每一个体的dna，再次用目的基因引物进行pcr检测，以筛选带有目的基因的无选择标记植株(表1、表2和图3c、d)。为了进一步确认所得的植株是否为无选择标记个体，又对其再进行gfp、mcherry、hpt、actpase的pcr检测，确认各个混合池为t-dna-pcr阴性(图3b)，其反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，26cycles；72℃延伸7min；4℃保存。t2代乃至更多的分离世代，都可以按照上述方法筛选无选择标记转基因个体。通过这种dna混合手段，可以对荧光阴性群体中含有目的基因的无选择标记个体进行高通量的筛选。
t2代无选择性标记水稻植株的分子分析：为了验证双荧光蛋白ac/ds转座因子载体pbdl23的无选择标记植株的株系含有ds序列和pi21-rnai表达框，且不含有t-dna序列，随机选取3个株系中的单株样品dna，使用ds探针、gfp探针和hpt探针进行southern杂交(图4)。同时对上述3个水稻株系的植株通过实时荧光定量rt-pcr(rt-qpcr)进行pi21的表达量测定，以osef-tu为内参基因，采用2-δδct方法计算目的基因相对表达量，每个样本设置3次技术重复，以确认转入目的基因pi21-rnai的表达框是否正常表达(图5)。
t2代无选择性标记水稻植株的抗稻瘟病功能鉴定：采用孢子悬浮液喷雾法向转化pbdl23的无选择标记水稻接种稻瘟菌tmc-1。取-20℃保存的带有稻瘟病孢子的滤纸片放在cm培养基上，于25℃光照培养箱内倒置培养，光照和黑暗时间均为12h。培养至12天后，以0.02％tween20洗脱稻瘟菌孢子并调整孢子液浓度到5*105spores/ml，用于稻瘟病菌接种。发芽的水稻种子播种在土盆中，在convironpgr15多功能植物培养箱(加拿大)内生长10天，光周期14h(光照)/10(黑暗)、光强4级(370μmol/m2/s)、温度26℃(光照)/24℃(黑暗)、湿度85％。取3.5ml上述悬浮孢子液接种一盆长有18-20株的水稻幼苗，先通过喷雾枪头对水稻幼苗垂直喷雾2ml，尽量使所有叶片沾上细小水珠。再用去底盖的可乐瓶罩住有水稻苗的花盆，喷雾枪头伸入瓶口，对着水稻幼苗喷雾1.5ml，使瓶内完全雾化。用封口膜将瓶口密封，放回培养箱于25℃黑暗条件培养34h后，恢复温度26℃(光照)/24℃(黑暗)光照周期。接种后5天，开始病症调查，并观察抗性(图6)。
表1pbdl23转化株系t1代双荧光检测与pcr分析
对每个t1转基因株系的gfp和mcherry分离比例进行卡平方适度检验分析，在卡方值χ20.05小于理论值3.84条件下，接受孟德尔理论遗传分离比例的统计假设。pi21rnai通过引物对p-act-3/nirintron-r,t3a-r2/nirintron-f,p-act-r/ds3-r和t3a-f/ds5-1.8进行检测。gfp,mcherry,hpt,actpase序列检测引物对分别为：ubi-r/ubi-r,35s-mcherry-f/placz-r,hyg-f/hyg-r,ac-tpase-f/ubi-f。g,gfp；r,mcherry； ,阳性；-,阴性；mf,无选择标记ds植株；假mf,带有t-dna序列的ds植株；a,显著；b,非常显著；nd,未检测。
表2pbdl22转化株系t1代双荧光检测与pcr分析
对每个t1转基因株系的gfp和mcherry分离比例进行卡平方适度检验分析，在卡方值χ20.05小于理论值3.84条件下，接受孟德尔理论遗传分离比例的统计假设。pi21rnai通过引物对p-act-3/nirintron-r,t3a-r2/nirintron-f,p-act-r/ds3-r和t3a-f/ds5-1.8进行检测。gfp,hpt,actpase序列检测引物对分别为：ubi-r/ubi-r,hyg-f/hyg-r,ac-tpase-f/ubi-f。g,gfp；r,mcherry； ,阳性；-,阴性；mf,无选择标记ds植株；假mf,带有t-dna序列的ds植株；a,显著；b,非常显著；nd,未检测。
可以理解的是，对本领域技术人员来说，对本发明的技术方案及发明构思加以等同替换或改变都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
1.一种转座因子载体，其特征在于：通过以下步骤构建：
1)将绿色荧光蛋白基因gfp、红色荧光蛋白基因mcherry潮霉素抗性选择标记基因hpt、来源于玉米的ac转座酶基因actpase和ds转座因子串联组装在一起，构建转座因子载体pbdl11，其中ds因子不带有任何选择标记，并且预先在其内部设计一个asci单酶切位点；
2)构建一个在多克隆位点两侧均含有asci酶切位点的中间载体pbdl11，以组装任意目的基因，然后将目的基因切下并克隆到ds因子内部。
2.根据权利要求1所述的转座因子载体，其特征在于：所述步骤1)具体地说，分别将不能移动的ac转座酶基因actpase、绿色荧光蛋白基因gfp、具有转座能力的ds因子、红色荧光蛋白mcherry以及潮霉素磷酸转移酶基因hpt顺次组装为顺式ac/ds转座因子载体pbdl11；在ds内部设有一个稀有的八碱基asci单酶切位点，以便再导入目的基因。
3.根据权利要求1所述的转座因子载体，其特征在于：所述步骤2)具体地说，在克隆中间载体pbdl11的多克隆位点两侧设计asci双酶切位点，可以将任意不含该位点的目的基因组装其内，随后将目的基因从中间载体释放出来，导入到与之配套的ds因子的asci酶切位点。
4.一种转座因子载体转基因后代的筛选方法，其特征在于：包含以下步骤：
1)在转化水稻的过程中，gfp和mcherry用作报告基因正向筛选t0代被转化的阳性植物细胞和植株，而在t1代以及后续分离世代，gfp和mcherry用作负选择标记以筛查并淘汰含有t-dna的荧光阳性植株，从而富集荧光阴性植株中非连锁的ds转座事件；
2)将荧光阴性植株的叶片混合成池，提取混池样品dna并通过pcr检测目的基因，然后对阳性混池中的每一个体分别进行目的基因的检测，由此获得的阳性植株便是无选择标记的转基因个体。
5.根据权利要求4所述的转座因子载体转基因后代的筛选方法，其特征是：所述步骤1)具体地说，在愈伤组织的选择培养、分化培养乃至阳性t0植株的筛选等过程中，通过台式荧光检测器检测水稻的转化愈伤组织细胞和转基因植株的绿色荧光和红色荧光，以区分成功的转化事件和未成功的转化事件；从t0代阳性植株收获t1代种子，在其发芽之后，按照同样的方法观察t1代幼苗的绿色荧光和红色荧光，以负向选择的方式淘汰那些带有双荧光或单荧光的含有t-dna的t1代植株，同时，那些转座到t-dna附近的非连锁转座事件也被剔除；最终，将非连锁的ds转座事件富集到荧光阴性的无选择标记后代当中；t2代乃至更多的分离世代，也可以按照上述方法筛选非连锁的ds转座事件。
6.根据权利要求4所述的转座因子载体转基因后代的筛选方法，其特征是：所述步骤2)具体地说，在转基因分离世代，在完成荧光阳性植株的负选择之后，将5-8个荧光阴性植株的叶片等量混合，构成混合池，提取混合池样品dna，通过pcr检测目的基因，以筛选带目的基因的无选择标记混合池；然后对阳性混合池中每一个体分别进行目的基因的检测，从而获得带有目的基因的无选择标记植株。
技术总结