本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用苎麻bnxth2基因提高辣椒抗寒能力的方法。
背景技术：
辣椒(capsicumanmuuml.)是一种重要的喜温性蔬菜,在北方保护地种植面积较大,但由于冬季温度低,光照弱,影响了北方地区辣椒的生产。苗期越冬易受突然寒流低温(0℃以下)霜冻或早春阴雨低温(0℃以上)的冷害,严重影响辣椒的生长、早期产量和商品性。急需一种增强辣椒抗寒冬的一种技术。
近期的研究发现xth5/7过表达(oxxth5、oxxth7)转基因植物在低温处理下植株存活率实验发现，过表达xth基因能够促进辣椒细胞壁中半纤维素的积累从而增强植株抗冻性。番茄xth3基因也发现与植物抗寒性相关。
利用bnxth2基因增强辣椒抗寒能力，可以有效解决辣椒抗寒的问题。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种利用苎麻bnxth2基因提高辣椒抗寒能力的方法，经过实验表明，利用苎麻bnxth2基因可以有效提高辣椒的抗寒能力。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用苎麻bnxth2基因提高辣椒抗寒能力的方法，所述方法具体为将苎麻bnxth2基因在辣椒中过表达。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
s1、bnxth2基因过表达载体的构建；
1.1)提取整株的总rna并反转录为cdna；
1.2)以步骤1.1)得到的cdna为模板，采用引物bnxth2-f和bnxth2-r进行pcr扩增，得到带酶切位点的bnxth2的开放阅读框；
bnxth2-f:cgggatccatgagatcatcatcaagtagt；
bnxth2-r:cgagctcctagtagccagcgaggcact；
1.3)将表达载体pbi121和bnxth2片段进行酶切，酶切体系如下：
37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的pcr片段；
1.4)采用t4连接酶将步骤1.3)中得到的pcr片段与载体片段连接，具体体系如下：
16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；
1.5)质粒提取：
将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；
1.6)转化eha105：
利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌eha105转化；
s2、对辣椒进行农杆菌侵染转化及组织培养：
2.1)接种农杆菌至含rif kan的yep液体培养基中，摇菌至od＝1.5；
2.2)4℃离心后加入含0.3％as的1/2ms液体培养基重悬，使其od＝0.5；
2.3)将辣椒带子叶胚轴下胚轴进行农杆菌浸染后共培养2d后，转移至ms 6-ba3mg/l naa0.8mg/l tim300mg/l kan100mg/l愈伤培养基上，每14d更换培养基直至长出丛生芽；
2.4)将丛生芽转移至生根培养基1/2ms iba0.7mg/l tim300mg/l kan100mg/l，直至长出1cm左右根系，移入营养钵中正常养护，收获种子，待收获种子低温烘干，4℃保存。
s3、转bnxth2基因辣椒抗寒冻能力鉴别
将野生型与转bnxth2基因t3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2-3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5士l)℃,(10士l)℃,(15士l)℃(对照)下处理,第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及mda含量。具体地说，不同低温处理后第5d测定幼苗的mda含量低温处理第5d,转基因株系在(5士1)℃mda的含量比非转基因株系低28.72％；转基因株系在(5士1)℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％，因此可以判定bnxth2基因在辣椒体内表达可明显提高辣椒抗寒能力。
本发明的有益效果在于：实验证明，通过将bnxth2基因在辣椒体内过表达可明显提高辣椒抗寒能力。
具体实施方式
以下对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1
一、总rna的提取及第一链cdna的合成
采用rna提取试剂盒提取辣椒总rna；然后取5μl总rna，
根据转录组测序bnxth2基因片段克隆bnxth2完整的orf(序列为seqidno:1)，推导出编码氨基酸序列(序列为seqidno:2)。
二、序列分析
经分析发现bnxth2cdna长开放阅读框大小为870bp，预测编码289个氨基酸。发现bnxth2蛋白具有典型的gh16_xet和glyco_hydro_16结构域，属于xet_c超家族、lamg超家族与skn1超家族。
实施例2
本实施例提供了一种bnxth2的转基因试验方法，具体来说是将bnxth2基因转导到辣椒中，观察转基因辣椒在低温下的表型变化。
1、bnxth2基因过表达载体的构建
s1、bnxth2基因过表达载体的构建；
1.1)提取整株的总rna并反转录为cdna；
1.2)以步骤1.1)得到的cdna为模板，采用引物bnxth2-f和bnxth2-r进行pcr扩增，得到带酶切位点的bnxth2的开放阅读框；
bnxth2-f:cgggatccatgagatcatcatcaagtagt；
bnxth2-r:cgagctcctagtagccagcgaggcact；
1.3)将表达载体pbi121和bnxth2片段进行酶切，酶切体系如下：
37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的pcr片段；
1.4)采用t4连接酶将步骤1.3)中得到的pcr片段与载体片段连接，具体体系如下：
pcr片段1μl
pbi1214μl
5×t4dnaligasebuffer2μl
t4dnaligase1μl
ddh2o2μl
16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；
1.5)质粒提取：
将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；
1.6)转化eha105：
利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌eha105转化；
s2、对辣椒进行农杆菌侵染转化及组织培养：
2.1)接种农杆菌至含rif kan的yep液体培养基中，摇菌至od＝1.5；
2.2)4℃离心后加入含0.3％as的1/2ms液体培养基重悬，使其od＝0.5；
2.3)将辣椒带子叶胚轴下胚轴进行农杆菌浸染后共培养2d后，转移至ms 6-ba3mg/l naa0.8mg/l tim300mg/l kan100mg/l愈伤培养基上，每14d更换培养基直至长出丛生芽；
2.4)将丛生芽转移至生根培养基1/2ms iba0.7mg/l tim300mg/l kan100mg/l，直至长出1cm左右根系，移入营养钵中正常养护，收获种子，待收获种子低温烘干，4℃保存。
2.5)转bnxth2基因t3代辣椒抗寒的鉴定
将野生型与转bnxth2基因t3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2-3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5士l)℃,(10士l)℃,(15士l)℃(对照)下处理,第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及mda含量。
结果如表1所示，不同低温处理后第5d测定幼苗的mda含量低温处理第5d,转基因株系在(5士1)℃mda的含量比非转基因株系低28.72％。转基因株系在(5士1)℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％。结果如下表所示，表明转基因植株提高了抗寒性。
表1bnxth2基因辣椒与非转基因辣椒生理生化指标
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
<110>湖南农业大学
<120>一种利用bnxth2基因提高植物抗寒能力的方法
<130>123
<141>2020-11-30
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>870
<212>dna
<213>人工序列()
<400>1
atgagatcatcatcaagtagtgtattgttagctattattattattggttgttattggttt60
gtctcagtgttgggacgaccagccacttttcaagaggacttcagggtcacatggtccgac120
tcccatctcaggcaaatcgaaggtggcagtgccattcagctagtccttgaccaatcctca180
ggatgtgggttttcttcgaagaaacggtacttgtttgggcgtgtgagcatgaagatcaag240
ctcatccccggtgactctgcagggacagtcactgccttttatatgaactcggacaccgac300
acaattcgcgacgagttggacttcgagttcttgggcaaccggagcggccagccgtacacg360
gtgcagactaacatcttcgctcatgggaagggcgacagagagcaaagggtcaacctttgg420
tttgacccttcggcggcttaccacacttacactataatgtggacccaccgcaggattaca480
ttccttgtggacgatgtgcccataagggtttacaaaaacaatgaggcaaagggaattccc540
taccctctccaccagcccatggggatctactcaaccctatgggaagccgacgactgggcg600
acgcgcggcggcctcgagaagatcaactggagcaaggccccgtttttcgcctactacaag660
gacttcgacatcgagggctgccccgtccctggccccgcaaactgcgcctccaaccccgcc720
aattggtgggagggaccggcttaccaaggcctcagcgccatcgaggcccgccgctacaag780
tgggtccggatgtaccacatgatctacgactactgcaccgataagtcgcggtaccccgtg840
cccccgccggagtgcctcgctggctactag870
<210>2
<211>289
<212>prt
<213>人工序列()
<400>2
metargserserserserservalleuleualaileileileilegly
151015
cystyrtrpphevalservalleuglyargproalathrpheglnglu
202530
asppheargvalthrtrpseraspserhisleuargglnileglugly
354045
glyseralaileglnleuvalleuaspglnserserglycysglyphe
505560
serserlyslysargtyrleupheglyargvalsermetlysilelys
65707580
leuileproglyaspseralaglythrvalthralaphetyrmetasn
859095
seraspthraspthrileargaspgluleuasppheglupheleugly
100105110
asnargserglyglnprotyrthrvalglnthrasnilephealahis
115120125
glylysglyasparggluglnargvalasnleutrppheaspproser
130135140
alaalatyrhisthrtyrthrilemettrpthrhisargargilethr
145150155160
pheleuvalaspaspvalproileargvaltyrlysasnasngluala
165170175
lysglyileprotyrproleuhisglnprometglyiletyrserthr
180185190
leutrpglualaaspasptrpalathrargglyglyleuglulysile
195200205
asntrpserlysalaprophephealatyrtyrlysasppheaspile
210215220
gluglycysprovalproglyproalaasncysalaserasnproala
225230235240
asntrptrpgluglyproalatyrglnglyleuseralailegluala
245250255
argargtyrlystrpvalargmettyrhismetiletyrasptyrcys
260265270
thrasplysserargtyrprovalproproproglucysleualagly
275280285
tyr
1.一种利用苎麻bnxth2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法具体为将bnxth2基因在辣椒中进行表达，其中，所述bnxth2基因的完整的开放阅读框如seqidno:1所示，编码氨基酸序列如seqidno:2所示。
2.根据权利要求1所述的利用苎麻bnxth2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
s1、bnxth2基因过表达载体的构建；
1.1)提取植物整株的总rna，反转录为cdna；
1.2)以步骤1.1)得到的cdna为模板，采用引物bnxth2-f和bnxth2-r进行pcr扩增，得到带酶切位点的bnxth2的开放阅读框；
bnxth2-f:cgggatccatgagatcatcatcaagtagt；
bnxth2-r:cgagctcctagtagccagcgaggcact；
1.3)将表达载体pbi121和bnxth2片段进行酶切，酶切体系如下：
37℃反应过夜，凝胶电泳胶回收目的pcr片段；
1.4)采用t4连接酶将步骤1.3)中得到的pcr片段与载体片段连接，具体体系如下：
16℃反应过夜，进行大肠杆菌转化；
1.5)质粒提取：
将步骤1.4)中成功转化大肠杆菌采用质粒提取试剂盒进行质粒提取；
1.6)转化eha105：
利用步骤1.5)提取得到的质粒进行农杆菌eha105转化；
s2、对辣椒进行农杆菌侵染转化：
2.1)接种农杆菌至含30mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的yep液体培养基中，摇菌至od＝1.0；
2.2)4℃离心收集菌体，加入1/2ms液体培养基重悬，使其od＝0.5，得到农杆菌重悬液；
2.3)将辣椒带柄子叶浸入农杆菌重悬液中20min后，20度下共培养2d转移至愈伤及分化培养基为：ms 0.6mg/liaa 5.0mg/l6-ba 300mg/ltim 100mg/lkan，每2周更换一次培养基。
2.4)待长出丛生芽后移入芽伸长培养基为：
ms 0.8mg/liaa 2.0mg/l6-ba 2.0mg/lga3300mg/ltim 300mg/lkan
2.5)后移入生根培养基1/2ms 0.5mg/liaa，生根待根长为1cm左右后移入营养土中正常培养收获辣椒种子。
3.根据权利要求2所述的利用苎麻bnxth2基因提高辣椒抗寒能力的方法，其特征在于，还包括转bnxth2基因辣椒抗寒冻能力鉴别；其中，将野生型与转bnxth2基因t3代辣椒种子浸种催芽后播种于营养土中，15℃正常条件下培养到2-3片叶的幼苗期，将幼苗分别在(5士l)℃,(10士l)℃,(15士l)℃(对照)下处理,第5d和第10d分别取样测定抗坏血酸及mda含量；
不同低温处理后第5d测定幼苗的mda含量低温处理第5d,转基因株系在(5士1)℃mda的含量比非转基因株系低28.72％；转基因株系在(5士1)℃抗坏血酸含量的含量比非转基因株系高58.72％。
技术总结