本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及重组质粒及其应用。
背景技术：
线粒体是细胞凋亡最主要的发起者和执行者，线粒体凋亡通路中，b细胞淋巴瘤2(b-celllymphoma2，bcl-2)家族的各个亚型蛋白广泛参与凋亡信号的转导调控。bcl-2家族蛋白的一个显著特征是具有bcl-2同源结构域(bcl-2homologydomain，bh)。典型的抗凋亡成员如bcl-2、bcl-xl、mcl-1等含有4个短的保守的bh结构域(bh1～bh4)和一个c端疏水尾状结构，而其它一些促凋亡成员则缺少bh4结构域。在这些促凋亡成员中，有一类蛋白质如bcl-2相关死亡启动子同源基因编码蛋白(bcl-2associatedagonistofcelldeath，bad)，仅含有bh3结构域。相关实验证实，bh3结构域是细胞凋亡的关键性结构域，bad蛋白在细胞内源性凋亡调节中发挥着重要作用。
bad蛋白上氨基酸的修饰，如磷酸化，会影响其促凋亡作用的发挥，例如，bad蛋白丝氨酸位点的磷酸化，会使其功能由促进细胞凋亡转变为促进细胞生存。正常人源野生型bad蛋白中，在上游信号蛋白激酶(主要为akt)的作用下，bad蛋白发生磷酸化。磷酸化后的bad蛋白会被14-3-3蛋白识别结合并带出线粒体，从而使bad蛋白失去了对线粒体中抗凋亡蛋白的结合抑制，导致抗凋亡蛋白的活性释放，进而增强了细胞抵抗凋亡的能力。
从肿瘤的发生发展与治疗的角度来看，bad蛋白的表达和磷酸化能影响到多种肿瘤的形成发展及其对药物治疗的敏感性。研究发现，在绝大多数癌症中，pi3k/akt和mapk等重要促癌信号通路都处于高度激活的状态，而处于他们下游的bad蛋白也处于高度磷酸化激活的状态，bad蛋白的高度磷酸化激活抑制了肿瘤细胞的内源性凋亡，从而促进肿瘤细胞存活。bad蛋白作为直接调控细胞内源性凋亡与存活的重要靶点，如果能够对其磷酸化非其上游激酶进行直接抑制，有可能会产生更为优越的抑瘤效果。
为了研究通过靶向抑制bad的磷酸化来调控肿瘤细胞的内源性凋亡，从而达到肿瘤治疗目的的方案，需要合适的表达载体来表达bad蛋白。然而，现有质粒产品在后续的蛋白印迹分析中往往难以区分内、外源bad蛋白。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种容易区分内源和外源蛋白的重组质粒及其应用。
本发明的第一方面，提供重组质粒，该重组质粒包括质粒载体和外源核酸序列，外源核酸序列编码n-末端带有蛋白标签的人源bad蛋白的融合蛋白。
根据本发明实施例的重组质粒，至少具有如下有益效果：
本发明实施例所构建的重组质粒所表达的人源bad蛋白在其n-末端带有蛋白标签，通过该蛋白标签，方便检测外源bad蛋白在靶细胞中的表达，便于将外源bad蛋白与内源bad蛋白进行区分。
根据本发明的一些实施例，人源bad蛋白在s75、s99、s118中至少一个位点具有突变。人源bad蛋白的三个丝氨酸位点(s75、s99和s118)的磷酸化，会使该蛋白的功能由促进细胞凋亡转变为促进细胞生存。如果这些丝氨酸位点发生突变成其它无法被磷酸化的氨基酸(例如苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸以外的不含羟基的氨基酸)，该蛋白失去在该位点的磷酸化能力，降低其促进细胞生存功能的转变，增强细胞的内源性死亡。从肿瘤的发生发展与治疗来看，bad蛋白的磷酸化与多种肿瘤的治疗耐受药相关，这些磷酸化位点具有作为肿瘤治疗靶点的潜力，通过点突变去磷酸化对于肿瘤的预防和治疗具有指导性意义。
根据本发明的一些实施例，人源bad蛋白具有s75a、s99a、s118a中至少一种突变。s75、s99和s118位点由丝氨酸突变为丙氨酸，该蛋白在上述位点失去其磷酸化能力，细胞的内源性死亡得到增强。
根据本发明的一些实施例，人源bad蛋白具有s99a突变。s99是野生型人源bad蛋白发挥其生理功能的重要调节位点。该位点突变为丙氨酸后，bad蛋白失去在该位点的磷酸化能力，降低了bad蛋白被14-3-3蛋白带出线粒体的可能性，从而增强了细胞的内源性死亡，对于肿瘤治疗具有重要意义。
根据本发明的一些实施例，外源核酸序列包含如seqidno.1所示的核苷酸序列，该外源核酸序列编码n-末端带有蛋白标签的野生型人源bad蛋白的融合蛋白。
根据本发明的一些实施例，外源核酸序列包含如seqidno.3所示的核苷酸序列，该外源核酸序列编码n-末端带有蛋白标签的具有s99a突变的人源bad蛋白的融合蛋白。
根据本发明的一些实施例，融合蛋白包含如seqidno.2所示的氨基酸序列，该融合蛋白为n-末端带有蛋白标签的野生型人源bad蛋白。
根据本发明的一些实施例，融合蛋白包含如seqidno.4所示的氨基酸序列，该融合蛋白为n-末端带有蛋白标签的具有s99a突变的人源bad蛋白。
根据本发明的一些实施例，质粒载体为真核表达载体。采用真核表达载体使重组质粒能够在真核细胞中进行表达，从而更方便准确研究靶向于bad蛋白的肿瘤治疗方案中的分子机制。
根据本发明的一些实施例，蛋白标签为myc标签、flag标签。
根据本发明的一些实施例，蛋白标签为flag标签。flag标签通常不会与人源bad蛋白相互作用或影响其功能、性质，有利于对融合蛋白进行下游研究；融合蛋白可以直接通过flag进行亲和层析，纯化有活性的融合蛋白，提高纯化效率；而且，flag标签可以被抗flag的抗体识别，方便对含有flag标签的融合蛋白进行检测、鉴定，对内源bad蛋白和外源bad蛋白进行区分。
本发明的第二方面，提供宿主细胞，该宿主细胞转入由上述的重组质粒。该宿主细胞中，内源bad蛋白和外源bad蛋白可以通过蛋白标签进行区分。
根据本发明的一些实施例，宿主细胞可以是任选的原核细胞或真核细胞，根据宿主细胞类型的不同，可以采用本领域熟知的各类能够导入上述质粒的方法。
根据本发明的一些实施例，宿主细胞为肿瘤细胞株。在需要对肿瘤细胞进行体内、体外双重标记时，采用上述重组质粒转染得到的宿主细胞进行实验，方便对肿瘤细胞的定性和定量观察。肿瘤细胞株可以是任选的肿瘤细胞，诸如妇科肿瘤细胞、泌尿系统肿瘤细胞、神经系统肿瘤细胞、头颈部肿瘤细胞、肺癌细胞、消化系统肿瘤细胞等。而且，宿主细胞内重组质粒所编码的bad蛋白为人源蛋白，避免其它来源的bad蛋白的引入而造成的分子信号干扰，使肿瘤细胞株所构建的模型更加纯粹。
本发明的第三方面，提供动物模型的构建方法，该构建方法包括以下步骤：向非人动物施用上述的宿主细胞。
本发明的第四方面，提供上述的宿主细胞在制备或筛选用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为真核表达载体pcdna3.1( )的质粒图谱；
图2为本发明实施例的真核表达质粒pcdna3.1( )-flag-hbad-wt的质粒图谱；
图3为本发明实施例的真核表达质粒pcdna3.1( )-flag-hbad-s99a的质粒图谱；
图4为本发明实施例的卵巢癌细胞系ovcar2宿主细胞实验结果；
图5为本发明实施例的子宫内膜癌细胞系an3宿主细胞实验结果；
图6为本发明实施例的肺癌细胞系pc9宿主细胞实验结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本发明的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
本实施例提供重组质粒，其制备方法如下：
(1)dna片段合成
根据人源bad蛋白的mrna序列(nm_032989.3)为蓝本，在其5′端添加flag标签的编码序列后，交由生物公司合成编码融合蛋白flag-hbad-wt的dna片段。dna片段经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后回收，具有如下的核苷酸序列：
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融合蛋白flag-hbad-wt的氨基酸序列如下：
mdykddddkgsmfqipefepseqedsssaerglgpspagdgpsgsgkhhrqapgllwdashqqeqptssshhggagaveirsrhssypagteddegmgeepspfrgrsrsappnlwaaqrygrelrrmsdefvdsfkkglprpksagtatqmrqssswtrvfqswwdrnlgrgssapsq(seqidno.2)。
(2)重组质粒的构建
图1是真核表达载体pcdna3.1( )的质粒图谱，图2是真核表达质粒pcdna3.1-flag-hbad-wt的质粒图谱，参考图1和图2，将真核表达载体pcdna3.1( )用nhei与ecori酶切后回收，然后与步骤1回收产物经酶切后的产物在连接酶作用下连接。连接产物转化感受态细胞后，涂布于含有卡那霉素抗性的lb固体培养基上，过夜培养后挑单克隆扩增培养并抽提质粒。将抽提的质粒送公司进行测序鉴定，阳性质粒即为表达n-末端带有flag蛋白标签的人源野生型bad蛋白的融合蛋白的真核表达质粒pcdna3.1( )-flag-hbad-wt(wt表示wildtype，野生型)。
(3)点突变pcr引入s99a突变位点
引物设计如下：
s99a-f：cggagtcgccacagcgccgcgccccccaacctc(seqidno.5)
s99a-r：gaggttggggggcgcggcgctgtggcgactccg(seqidno.6)
以pcdna3.1-flag-hbad-wt为模板，按表1配制pcr体系：
表1.pcr体系
体系配制完成后按以下条件进行点突变pcr，在pcdna3.1-flag-hbad-wt中的野生型hbad蛋白中引入s99a点突变：95℃，5min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，2min，20个循环；72℃，5min。
琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物条带大小正确后，使用dmt酶对pcr产物进行消化，37℃孵育1h。消化产物转化至dmt感受态细胞后涂布于含有卡那霉素抗性的lb固体培养基上，过夜培养后挑单克隆扩增培养并抽提质粒。将抽提的质粒送公司进行测序鉴定。阳性质粒即为pcdna3.1( )-flag-hbad-s99a。图3为pcdna3.1( )-flag-hbad-s99a的质粒图谱。
flag-hbad-s99a具有如下核苷酸序列：
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融合蛋白flag-hbad-s99a的氨基酸序列如下：
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实施例2
本实施例提供宿主细胞，其制备方法及验证方法的具体步骤如下：
选择卵巢癌细胞系ovcar2、子宫内膜癌细胞系an3及肺癌细胞系pc9作为实验对象接种于6孔板，当细胞密度达70％时，各孔以实施例1中的重组质粒pcdna3.1( )-flag-hbad-wt以及pcdna3.1( )-flag-hbad-s99a分别与脂质体(lipofectaminetm3000，货号l3000015，购自thermofisher公司)按照其产品说明书的方法进行转染，得到对应的宿主细胞。
实施例3
卵巢癌细胞系ovcar2宿主细胞实验
设置实验组和对照组的ovcar2宿主细胞，参考实施例2，实验组转染重组质粒pcdna3.1( )-flag-hbad-s99a，对照组转染pcdna3.1( )空载体。
1.蛋白免疫印记实验
转染后的细胞培养48h后，收集细胞，提取总蛋白样品。样品电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上，实验组和对照组各自分别与s99位点磷酸化bad抗体(pbad(ser99))、s75位点磷酸化bad抗体(pbad(ser75))、bad抗体和内参抗体(actin)孵育，二抗免疫作用后，显色反应。结果如图4的a所示。
2.细胞存活及凋亡实验
转染后的细胞培养72h后，检测其细胞存活率。收集细胞，caspase3/7活性细胞凋亡检测试剂盒检测caspase3/7酶活。结果如图4的b所示，从图中可以看到，实验组s99a突变使细胞存活率相比于对照组有显著下降(p<0.01)，而caspase3/7酶活显著上升(p<0.001)，细胞凋亡率更高。
实施例4
子宫内膜癌细胞系an3宿主细胞实验
设置实验组1、实验组2和对照组的an3宿主细胞，参考实施例2，实验组1转染重组质粒pcdna3.1( )-flag-hbad-s99a，实验组2转染重组质粒pcdna3.1( )-flag-hbad-wt，对照组转染pcdna3.1( )空载体。
1.蛋白免疫印记实验
转染后的细胞培养48h后，收集细胞，提取总蛋白样品。样品电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上，实验组1、实验组2和对照组各自分别与s99位点磷酸化bad抗体(pbad(ser99))、s75位点磷酸化bad抗体(pbad(ser75))、bad抗体、flag标签抗体和内参抗体(actin)孵育，二抗免疫作用后，显色反应。结果如图5的a所示。
2.细胞存活及凋亡实验
转染后的细胞培养72h后，检测其细胞存活率。收集细胞，caspase3/7活性细胞凋亡检测试剂盒检测caspase3/7酶活。结果如图5的b所示，从图中可以看到，实验组2中bad蛋白的高水平表达使细胞存活率相比于对照组有显著下降(p<0.01)，同时，实验组1的s99a突变又使得细胞存活率相比于实验组2或对照组均有显著差异。同理，实验组1、实验组2和对照组的caspase3/7酶活两两之间均存在显著差异(p<0.001)，细胞凋亡率依次递减。
实施例5
肺癌细胞系pc9宿主细胞实验
设置实验组和对照组的pc9宿主细胞，参考实施例2，实验组转染重组质粒pcdna3.1( )-flag-hbad-s99a，对照组转染pcdna3.1( )空载体。
1.蛋白免疫印记实验
转染后的细胞培养48h后，收集细胞，提取总蛋白样品。样品电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上，实验组和对照组各自分别与s99位点磷酸化bad抗体(pbad(ser99))、bad抗体、flag标签抗体和内参抗体(actin)孵育，二抗免疫作用后，显色反应。结果如图6的a所示。
2.细胞存活及凋亡实验
转染后的细胞培养72h后，检测其细胞存活率。收集细胞，caspase3/7活性细胞凋亡检测试剂盒检测caspase3/7酶活。结果如图6的b所示，从图中可以看到，实验组s99a突变使细胞存活率相比于对照组有显著下降(p<0.01)，而caspase3/7酶活显著上升(p<0.001)，细胞凋亡率更高。
实施例6
本实施例提供一种动物模型的构建方法，包括以下步骤：
以0.6％戊巴比妥钠对小鼠腹腔注射进行麻醉，取右侧卧位固定于鼠板，以75％乙醇常规消毒，在左腋下行1cm左右切口，钝性分离皮下及肌层至肋骨表面层次，能清晰看见粉红色左肺上下运动，在肋骨上缘以微量进样器垂直刺入3～4mm，缓慢注射含有2×106个实施例5中实验组肺癌细胞系pc9宿主细胞的matrigel胶悬液100μl于肺内，停止数秒后，缓慢拔出微量进样器，医用胶封闭针孔。逐层缝合关腹，再次乙醇消毒。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
sequencelisting
<110>清华-伯克利深圳学院筹备办公室
<120>重组质粒及其应用
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1.重组质粒，其特征在于，包括质粒载体和外源核酸序列，所述外源核酸序列编码n-末端带有蛋白标签的人源bad蛋白的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述人源bad蛋白在s75、s99、s118中至少一个位点具有突变。
3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述人源bad蛋白具有s75a、s99a、s118a中至少一种突变。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述外源核酸序列包含如seqidno.3所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述融合蛋白包含如seqidno.4所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1～5任一项所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒载体为真核表达载体。
7.根据权利要求1～5任一项所述的重组质粒，所述蛋白标签为flag标签。
8.转入有权利要求1～7任一项所述的重组质粒的宿主细胞。
9.动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：向非人动物施用权利要求8所述的宿主细胞。
10.权利要求8所述的宿主细胞在制备或筛选用于治疗或预防癌症的药物中的应用。
技术总结