用于调节PD-1PD-L1通路的RNAi表达质粒的制作方法

本申请属于肿瘤防治
技术领域：
：，具体涉及一种用于调节pd-1/pd-l1通路的rnai表达质粒专利申请事宜。
背景技术：
：：程序性死亡受体1（programmeddeath1），是一种重要的免疫抑制分子，它表达于肿瘤微环境中的免疫细胞，包括活化的t淋巴细胞、b淋巴细胞和自然杀伤细胞（nk）等，尤其高表达于ctl（细胞毒性t淋巴细胞）。pd-1有两个配体，分别是程序性死亡配体1（programmeddeathligand1，pd-l1，也称为cd274或b7-h1）和程序性死亡配体2（programmeddeathligand2，pd-l2；也称为cd273或b7-dc）。其中pd-l1是pd-1的主要配体，它主要表达于乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等肿瘤细胞。已有研究认为，pd-1/pd-l1并不直接参与细胞凋亡途径，而是通过相互作用抑制t淋巴细胞的活化和增殖，间接影响肿瘤细胞的死亡。基于这些研究，借助于抗体的应用，通过阻断pd-1/pd-l1的相互作用在部分肿瘤的防控和治疗中已经表现出了较好应用效果。但抗体治疗的高剂量和长期应用需要，使得该技术成本高昂，而且容易“脱靶”，使得开发新的pd-1/pd-l1通路抑制药物仍然具有十分重要的技术意义。rna干扰作为基因功能研究的支撑技术，在医疗领域，已在各种由于基因活性改变导致的疾病中得到了初步应用，包括癌症、自身免疫性疾病、遗传性显性疾病等。rnai可以高度特异性的调节靶基因，其在细胞中的主要作用是下调特定目标蛋白的表达。在基因治疗中，rnai可以通过两种不同的途径触发：一种是基于rna的方法，人工合成小干扰rna（smallinterferingrnas，sirnas），将其传递至靶细胞。sirna通常是一段由21个核苷酸组成的双链rna，它具有较好特异性rnai触发活性。另一种是基于dna的策略，合成更长的短发夹rna（shorthairpinrnas，shrnas），进一步克隆到质粒载体中，并在靶细胞内被dicer加工成sirna，这使得构建rnai质粒载体以沉默哺乳动物细胞内的基因表达成为可能。因此，如能基于rna干扰技术开发一种针对现有pd-1和pd-l1抗体治疗的替代性技术，对于相关疾病的治疗是具有积极的技术意义的。但实际技术开发而言，尽管rnai技术原理较为成熟，但如何将所构建的sirnas或者shrna输送到患病部位，则是该技术能否实现预期的关键。现有技术中，以相关纳米材料作为载体来运输和携带相关药物已有较多研究。其中聚乙烯亚胺（pei）即是一种研究得较为广泛的rnai递送系统。然而，由于其不良的毒性和体内不稳定性（尤其是在全身给药期间），限制了其进一步的临床应用。近年来，一些无机纳米生物材料，如介孔二氧化硅纳米粒子（msns）、金纳米颗粒（aus）、碳纳米管（cnt）等在生物医药中的应用研究得到了较多重视。其中，具有中孔结构的介孔二氧化硅纳米粒子（mesoporoussilicananoparticles，msns）更是由于具有较大的表面积、可调节的孔径体积等可以增加其对药物分子和抗原的负载量的技术优势，得到了更多关注。因此，在确保应用效果基础上，如能基于现有纳米材料，结合rna干扰技术开发一种新的pd-1/pd-l1通路调节技术，对于相关肿瘤的防控具有十分重要的科研意义和技术价值。技术实现要素：本申请目的在于提供一种用于调节pd-1/pd-l1通路的rnai表达质粒，同时结合相关纳米载体的应用，可为相关肿瘤防治奠定一定技术基础。本申请所采取的技术方案详述如下。用于调节pd-1/pd-l1通路的rnai表达质粒，该表达质粒命名为shpd-l1，具体通过如下步骤构建获得：（一）设计引物根据pd-l1基因序列（genbank登录号：nm_021893.3），设计上下游引物如下：pd-l1引物上游：5’-gccgaaatgatacacaattcga-3’，pd-l1引物下游：5’-ccgaaatgatacacaattcga-3’；（二）提取rna提取，并反转录成cdna备用以b16-ova细胞（黑色素瘤细胞）基因组为提取对象，提取其总rna，并反转录为cdna备用；（三）pcr扩增以步骤（二）中的cdna为模板，利用步骤（一）中所设计引物进行pcr扩增，并回收目的dna片段；具体pcr扩增序列（114bp）如seqidno.1所示，具体如下：tgccgaaatgatacacaattcgactcgagtcgaattgtgtatcatttcggttttttcacggctttactatgtgttaagctgagctcagcttaacacatagtaaagccaaaaaag；（四）酶切，并与psicor-gfpvector连接利用hpai、xhoi酶分别对步骤（三）所回收目的dna片段与psicor-gfpvector进行双酶切；酶切后分别回收酶切产物，并利用t4dna连接酶进行连接；（五）转化、筛选和鉴定采用热激转化法，将步骤（四）中连接产物转化s3感受态细胞，并进行筛选，检测和鉴定，确保质粒连接重组正确，并将重组正确的质粒命名为：shpd-l1。具体应用时，通过静电吸附方式，将质粒shpd-l1负载到msn-nh2的介孔后，在msn（介孔二氧化硅）表面再包覆ccm（cancercellmembrane，癌细胞膜），并将之命名为：ccm/msn@shpd-l1纳米载体，从而便于应用；具体通过如下步骤制备：（一）制备msn@shpd-l1纳米复合物首先，采用无菌水对电位为正电荷的氨基化的介孔二氧化硅纳米颗粒（平均粒径为200nm）进行清洗；随后，在圆底烧瓶中加入前述清洗后的msn纳米粒和质粒shpd-l1（以质量比计，msn：shpd-l1=10~40:1，优选情况下，msn比值不应低于30），再加入适量pbs7.2溶液，磁力搅拌器搅拌过夜以进行静电吸附；最后，4℃、12000rpm离心30min，所得沉淀即为msn@shpd-l1纳米复合物；（二）提取b16-ova细胞膜，并制备细胞膜囊泡首先，培养b16-ova细胞，并选取生长状态良好的细胞用pbs7.2清洗一遍，之后用含有edta但不含胰酶的细胞消化液处理细胞（尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解膜蛋白），离心收集细胞备用；随后，对所收集的细胞进行匀浆裂解，具体而言：向每1×107个细胞沉淀中加入500µlcer试剂，再加1/100蛋白酶抑制剂pmsf，震荡重悬后冰浴2分钟，再转移到冰预冷的玻璃匀浆器内，在冰水浴中充分匀浆处理，确保细胞充分破碎；再后，将破碎后的细胞转移到新的离心管中，4℃、800g离心5min，收集上清液（胞膜-胞浆混合物）于新的离心管中；最后，加入上清液1/10体积的mer（membraneextractionreagent，北京普利莱基因技术有限公司的nuc-cyto-mempreparationkit（胞核-胞浆-胞膜制备试剂盒）中的一个试剂）与上清液混合，冰浴5分钟后，4ºc、14000rpm离心30min，收取沉淀物即为欲提取的b16-ova细胞膜碎片；制备细胞膜囊泡时，在上述所提取的细胞膜碎片沉淀物中加入适量pbs7.2，超声处理，以重悬细胞膜；再用组装有400nm聚碳酸酯薄膜的挤出机挤压细胞膜悬液，从而最终获得细胞膜囊泡；（三）制备ccm/msn@shpd-l1纳米复合物首先，将步骤（一）中所制备的msn@shpd-l1纳米复合物与步骤（二）所制备细胞膜囊泡混合均匀；混合时，可参考如下比例：每1mgmsn和1×107细胞所提取的细胞膜；随后，用组装有200nm聚碳酸酯薄膜的挤出机挤压混合液，以产生细胞膜包裹的纳米粒子，最终所得即为ccm/msn@shpd-l1纳米复合物。所述rnai表达质粒shpd-l1或ccm/msn@shpd-l1纳米载体在制备抗肿瘤药剂中的应用，所述肿瘤，具体例如为黑色素瘤；具体应用时，还可配合化疗应用。瘤免疫疗法开启了肿瘤治疗的新时代，免疫治疗通常依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境（tme）内免疫细胞的相互作用。肿瘤细胞通过免疫检查点抑制t细胞活性，造成肿瘤细胞免疫逃逸。所以阻断免疫检查点可以重新激活cd8 t细胞介导的免疫应答，其中最具代表性的就是靶向pd-1/pd-l1信号通路的免疫检查点抑制剂。基于基因疗法原理，使用shrna可以特异性下调肿瘤细胞免疫检查点分子的表达，从而阻断免疫检查点重新激活t细胞。而为将rnai分子输送到肿瘤部位且进入靶细胞，本申请充分利用了介孔二氧化硅（msns）良好的生物相容性和负载能力，通过将肿瘤细胞的整个细胞膜涂布在msn表面以赋予其同源靶向和免疫逃逸的能力。基于上述技术构思，本申请中通过构建靶向pd-l1的rnai质粒shpd-l1，并将该质粒负载到带有正电荷的msn-nh2的介孔中，并进一步利用挤压法制备成b16-ova细胞膜包裹的全抗原基因传递纳米载体ccm/msn@shpd-l1。初步研究结果表明，该纳米载体可以被b16-ova细胞内化摄取，b16-ova细胞膜的存在赋予了该纳米载体同源靶向和免疫逃逸的能力。而体外rnai实验结果表明，纳米载体ccm/msn@shpd-l1被b16-ova细胞摄取后能够产生有效的rnai作用，显著降低b16-ova细胞pd-l1基因的表达。进一步动物实验结果表明，该载体在小鼠体内可以有效降低b16-ova肿瘤细胞pd-l1的表达，解除肿瘤细胞对t淋巴细胞的免疫抑制作用。进而增加了cd8 t在肿瘤组织中的浸润比例，同时促进了ifn-γ、tnf-α、perforin和grzb等一系列细胞因子的表达量，最终诱导ctl免疫应答，从而有效地抑制肿瘤生长。总之，本申请所制备的全抗原基因递送纳米载体ccm/msn@shpd-l1，不仅具有良好的生物相容性，同时可以同源靶向肿瘤细胞下调免疫检查点分子pd-l1表达，重新激活cd8 t细胞引发强烈的ctl免疫反应。而且由于该纳米载体可以与放射疗法结合使用，因此对于调节放疗引起的免疫抑制微环境变化，增强肿瘤细胞免疫原性死亡，提高相关肿瘤防控效果具有积极的技术意义，同时也为相关疾病的防控提供了新的技术思路和借鉴参考。附图说明图1为质粒转染b16-ova后的荧光显微镜图片（左侧为绿色荧光图，右侧为白场下的图像）；图2为质粒转染b16-ova后的流式检测结果；图3为b16-ova细胞中pd-l1mrna的表达效率（***p＜0.001）；图4为msn@shpd-l1载体的制备情况；其中：a为利用nanodrop2000测定上清中游离的shrna，再计算不同质量比下shrna被msn的负载率；b为琼脂糖凝胶电泳检测msn负载shrna的情况；图5为功能化纳米载体的表征情况；其中：a为tem表征msn@shpd-l1、ccm/msn@shpd-l1；b为sds-page分析蛋白质组分marker，（lane1）癌细胞裂解物，（lane2）癌细胞膜囊泡，（lane3）ccm/msn@shpd-l1；c为msn@shpd-l1、ccm、ccm/msn@shpd-l1的水动力学尺寸分布；d为msn@shpd-l1、ccm、ccm/msn@shpd-l1的zeta电位；e为ccm/msn@shpd-l1在7天内的水动力学尺寸分布和zeta电位变化情况；图6为各实验组对b16-ova细胞的细胞毒性研究；图中（以24h组别为例），从左至右分别为（以shpd-l1含量计，每个组别下从左至右分别为0µg/ml,3µg/ml,15µg/ml,30µg/ml）：shpd-l1、msn/@shpd-l1、ccm/msn@shnc、ccm/msn@shpd-l1实验组；图7为ccm/msn@shpd-l1纳米载体可被b16-ova细胞内化结果；其中：a为b16-ova细胞与纳米载体共孵育2h后的共聚焦成像；纳米载体由fitc（绿色通道）标记的msn和dii（红色通道）标记的癌细胞膜制成；b16-ova细胞核用hoechst33342（蓝色通道）染色；黄色代表纳米载体的核信号和壳信号的共定位；比例尺=10μm；b为流式检测不同内吞抑制剂对b16-ova细胞摄取纳米载体的影响；结果表示为平均值±sd（n=3），*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；图8为ccm/msn@shpd-l1同源靶向b16-ova细胞；其中：a为b16-ova、4t1、mc38、mcf-7、huvec、dc2.4和raw264.7细胞分别与纳米载体ccm/msn@shpd-l1和msn@shpd-l1共孵育2h后的共聚焦成像；绿色代表dio（绿色通道）标记的msn；各细胞核用hoechst33342（蓝色通道）染色。比例尺=25μm；b为b16-ova、4t1、mc38、mcf-7、huvec、dc2.4和raw264.7细胞分别与纳米载体ccm/msn@shpd-l1和msn@shpd-l1共孵育2h后的流式图；msn终浓度固定为100μg/ml；结果表示为平均值±sd（n=3），*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；图9为ccm/msn@shpd-l1下调b16-ova细胞pd-l1表达，b16-ova细胞分别与shpd-l1和不同纳米载体包括msn@shpd-l1、ccm/msn@shnc和ccm/msn@shpd-l1（按照所含shpd-l1的量计算终浓度为15μg/ml），pbs组为空白对照组，37℃共孵育48h；其中：a为纳米载体转染b16-ova细胞的荧光显微镜图片；b为流式检测b16-ova细胞gfp表达量；c为流式检测b16-ova细胞pd-l1表达量；d为qrt-pcr检测b16-ova细胞中pd-l1在mrna水平上的相对表达量；结果表示为平均值±sd（n=3），*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；图10为纳米载体的体内抗肿瘤效果；其中：a为治疗方案流程示意图；b为肿瘤体积变化曲线；c为体重变化曲线；结果表示为平均值±sd（n=5），*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；图11为纳米载体的体内抗肿瘤效果；其中：a为流式检测肿瘤细胞pd-l1表达量；b为肿瘤部位cd3 cd8 t细胞的浸润情况，c为小鼠脾脏中ifn-γ cd8 t细胞的比例；d为淋巴结中ifn-γ cd8 t细胞的比例；结果表示为平均值±sd（n=5），*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；图12为ccm/msn@shpd-l1联合放疗体内抗肿瘤效果；其中：a为治疗方案示意图；b为小鼠的肿瘤体积变化曲线；c为小鼠的体重变化曲线；d为小鼠的肿瘤照片；结果表示为平均值±sd（n=5），*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；图13为ccm/msn@shpd-l1联合放疗体内抗肿瘤效果，其中：a为流式检测肿瘤细胞pd-l1表达量；b为流式检测dc细胞pd-l1表达量；c为肿瘤部位cd3 cd8 t细胞的浸润情况；小鼠脾脏（d）和引流淋巴结（e）中ifn-γ cd8 、tnf-α cd8 、perforin cd8 和grzb cd8 的比例；f为肿瘤部位ifn-γ cd8 、tnf-α cd8 的比例；结果表示为平均值±sd（n=5），*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；图14为各实验组小鼠脏器组织（心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）的he染色，比例尺=100μm。具体实施方式下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。生物材料：stable3感受态细胞，北京全式金生物技术公司；pspax2、pmd2.g，addgene；c57bl/6j雌性小鼠，购买于北京维通利华实验动物技术公司，spf级鼠房中饲养，6~8周龄时用于实验；原癌细胞系b16-ova，中国科学院生物物理研究所王盛典老师惠赠；psicor-gfpvector，购自addgene（货号11579）；主要试剂：rpmi-1640液体培养基、dulbecco'smodifiedeaglemedium液体培养基、胎牛血清，biologicalindustries（bi）；opti-mem培养基，gibco；胰蛋白胨、胰蛋白酶、revertaidfirststrandcdnasynthesiskit，赛默飞世尔科技有限公司；pt293转染试剂，思享生物；polybrene，solarbio；dnamarker，宝日医生物技术(北京)有限公司；质粒提取试剂盒，康为世纪；nuc-cyto-mempreparationkit，北京普利莱基因技术有限公司；总rna提取试剂盒，郑州贝贝生物公司；lightcycler480sybrgreenimaster，罗氏公司；msn（介孔二氧化硅）、msn-nh2，，上海羧菲生物科技公司；ova257-264多肽，已公开多肽，由发明人参考现有技术合成；anti-mcd3-percp-eflour710（clone:17a2）、anti-mcd8α-pe（clone:53-6.7）、anti-mifn-γ-apc（clone:xmg1.2）、anti-mcd45-fitc（clone:30-f11）、anti-mcd8α-apc（clone:53-6.7）、anti-mcd274(pd-l1)-apc（clone:mih5）、anti-mcd11b-percp-cy5.5（clone:m1/70）、anti-mcd11c-pe（clone:n418）、anti-mf4/80-efluor450（clone:bm8）、anti-mperforin-apc（clone:ebioomak-d），ebioscience公司；anti-mtnf-α-bv510（clone:mp6-xt22）、anti-mgrzb-bv421，bd公司；lb固体培养基、lb液体培养基、pbs（ph=7.2）缓冲液、0.25%胰蛋白酶溶液、edta消化液、细胞冻存液、0.5mtris-hcl（ph6.8）、10%sds、10%过硫酸铵（ap）、2×sds上样缓冲液（loadingbuffer）、10×tris-甘氨酸电泳缓冲液、脱色液、考马斯亮蓝染液、10×红细胞裂解液、水合氯醛（4%）等，常规配制及操作即可；主要仪器：facscelesta流式细胞仪，bd公司；荧光倒置显微镜，日本奥林巴斯特公司；pcr仪，takara公司；凝胶成像系统，赛默飞世尔科技有限公司；透射电镜（tecnaig2f20-s-twin），fei公司；挤出机，avanti；粒径电位分析仪（nano-s90），malvern公司；实施例1rna干扰（rnai）是一种诱导转录后基因沉默的现象，可调节各种真核生物基因的表达。基于rnai的基因疗法在肿瘤特异性基因治疗中受到了广泛的关注。在治疗中，rnai通过递送小分子双链rna，在细胞内形成rna诱导沉默复合体，切割目标信使rna（mrna），从而根源上控制肿瘤相关基因的表达。在肿瘤细胞中，肿瘤细胞通过上调pd-l1的表达，与t淋巴细胞的pd-1相互作用，造成淋巴细胞功能衰竭并介导肿瘤的免疫逃逸。因此，通过阻断pd-1/pd-l1信号通路可以逆转t淋巴细胞的衰竭状态，进而重新恢复和提升其对肿瘤细胞的杀伤能力。本申请中，发明人构建了特异性靶向pd-l1的rnai表达质粒shpd-l1，本实施例首先就该质粒的构建过程简介如下。（一）设计引物根据pd-l1基因序列（genbank登录号：nm_021893.3），设计上下游引物如下（引物序列由北京六合华大基因科技有限公司合成提供）：pd-l1引物上游：5’-gccgaaatgatacacaattcga-3’，pd-l1引物下游：5’-ccgaaatgatacacaattcga-3’；（二）提取rna提取，并反转录成cdna备用以b16-ova细胞（黑色素瘤细胞）基因组为提取对象，具体操作可参考如下：首先，将冷冻保藏的b16-ova细胞进行复苏，并利用rpmi1640培养基在5%co2、37℃条件下培养至对数期；随后，收集处于对数期的b16-ova细胞，弃去旧培养基，用pbs7.2洗涤一遍，并用0.25%的胰酶消化后，加入含10