本发明属于基因工程技术领域和肿瘤免疫治疗领域，涉及一种多功能病毒载体的制备方法及其应用。
背景技术：
背景技术
目前对于肿瘤的治疗不少的新型治疗手段已经在临床上应用，这对于提升生存期并改善生活质量极为有效，但是由于肿瘤耐药性的原因，使得大部分抗癌药物在后期失去了治疗效果，进而导致肿瘤的复发和反复。基因治疗在未来将是肿瘤患者一个可能的选择，有可能解决化疗药物失活、多药耐药性的产生等现象，目前选择的靶点有细胞死亡/凋亡的基因、药物代谢途径靶点基因、表观遗传相关基因等。所以，针对新的基因靶点设计基因治疗药物进而进行有效的肿瘤治疗具有重要意义。
利用基因工程修饰的t细胞(如car-t、tcr-t)进行过继性免疫治疗已取得突破性进展，例如利用cd19car-t进行白血病治疗，90%的急性淋巴细胞白血病患者得到完全缓解。然而，基于免疫细胞的肿瘤靶向治疗在实体肿瘤的治疗中效果非常有限，主要原因在于：（1）免疫检查点，例如pd-1.tim-3，lag-3，ctla-4等限制了car-t细胞在肿瘤局部的存活时间；（2）此外，肿瘤局部缺少刺激免疫细胞增殖的细胞因子，例如il-2，il-12，il-15等削弱了car-t细胞在肿瘤局部的抑瘤作用；（3）肿瘤组织的异质性导致传统针对单一靶点的car-t细胞很难完全清除所有的肿瘤细胞。
慢病毒载体在基因治疗应用中取得了很大的进展，大规模生产临床级病毒载体来转移遗传物质已经可以实现。慢病毒载体可以广泛地转导多种细胞类型，并整合到分裂细胞和非分裂细胞的宿主基因组中，从而使转基因在体内外长期表达。
针对目前的临床需求和问题，研究者已经尝试多种解决方案，例如，用携带il-12的car-t治疗肿瘤；用car-t细胞联合双特性抗体克服肿瘤异质性导致的肿瘤免疫逃逸；用shrna敲降car-t细胞的免疫检查点基因pd-1或tim-3等以阻断免疫检查点引发的car-t细胞耗竭等。但是这些方法都是在某一个层面，部分解决car-t细胞治疗实体肿瘤遇到的困境,提示多种手段联用将大有前景。但由于免疫细胞天然具有抵抗外源基因转导的特性，从而在同一细胞上多次转导几种不同功能的病毒载体难以实现，造成难以将多种手段联合起来解决问题。
因此，在本发明中我们提出了一种转染人类细胞的慢病毒载体用于转染car-t细胞，构建一种同时具有基因干扰、调控性表达和car组成型表达的多功能病毒载体，包括应用基因治疗的技术调节靶点基因表达，能够明显降低恶性肿瘤细胞入侵及扩散，有效提高cart细胞在肿瘤细胞中发挥作用，以实现多手段联合治疗肿瘤。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种多功能病毒载体的制备方法，用于减少细胞转导的次数,实现一次转导,达到三次转导的功能,并大大提高效率。用此载体可以制备多功能的car-t细胞，并提高car-t细胞制备效率，以提高肿瘤治疗效果。
为实现该目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种多功能组合启动子，可以用于构建多种病毒载体，所述多功能组合启动子包括由三个启动子u6或h1启动子、nfat启动子和ef1a/5’-ltr启动子构成的组合启动子框架，所述组合启动子还包括三组多克隆位点（mcs）。
本发明中，三个启动子可以在框架内随意组合，拓展了载体的功能。
本发明中，u6或h1为驱动干扰的启动子，nfat为可诱导表达启动子,ef1a/5’-ltr为组成型表达杂合启动子。
优选地，所述三个启动子都伴随有固定的多克隆位点（mcs）。
优选地，组合启动子包含顺序连接的u6-mcs1，nfat-mcs2和ef1a/5’-ltr-mcs3序列。
优选地，所述病毒载体为慢病毒载体或者逆转录病毒。
优选地，所述u6启动子的核酸序列如seqidno.1所示。
优选地，所述多克隆位点lv-mcs1的核酸序列如seqidno.2所示。
优选地，所述nfat的核酸序列如seqidno.3所示。
优选地，所述多克隆位点lv-mcs2的核酸序列如seqidno.4所示。
优选地，所述ef1a/5’-ltr的核酸序列如seqidno.5所示。
优选地，所述多克隆位点lv-mcs3的核酸序列如seqidno.6所示。
优选地，所述慢病毒载体的核酸序列如seqidno.7所示。
优选地，所述多克隆位点rv-mcs1的核酸序列如seqidno.8所示。
优选地，所述多克隆位点rv-mcs2的核酸序列如seqidno.9所示。
优选地，所述多克隆位点rv-mcs3的核酸序列如seqidno.10所示。
优选地，所述逆转录载体的核酸序列如seqidno.11所示。
附图说明
图1为pcdh-trip重组慢病毒载体示意图。
图2为pcdh-trip重组慢病毒载体结构图。
图3为pcdh-trip重组慢病毒载体酶切图，m：dna标准分子量，1：pcdh-trip重组载体。
图4为pbabe-trip逆转录病毒表达载体示意图。
图5为pbabe-trip逆转录病毒表达载体结构图。
图6为pbabe-trip重组逆转录病毒载体酶切图，m：dna标准分子量，1：pbabe-trip重组载体。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1，pcdh-trip重组慢病毒载体的构建。
（1）设计并合成如seqidno.7所示的u6-mcs1-nfat-mcs2-ef1a-mcs3dna片段。
（2）采用sphi和sali对载体pcdh-cmv-mcs-ef1a-copgfp进行双酶切，酶切体系见表1，酶切后对载体片段进行琼脂糖凝胶电泳回收。
表1，载体双酶切体系建立。
（3）采用t4dna连接酶，将同样经过sphi和sali双酶切的seqidno.7合成片段与凝胶回收获得的慢病毒载体进行dna连接反应，连接体系见表2，连接反应在22°c下保持60min。
表2，t4dna连接酶连接体系。
（4）将10μl连接产物加入到100μlstbl3感受态细胞中，冰上孵育30min，42°c水浴45s，再置于冰上2min，加入600μl的lb液体培养基；感受态细菌在37°c下150rpm摇床复苏培养45min，随后取100µl细菌涂布于含有氨苄青霉素抗性的lb平板上，37°c倒置培养16h，挑取阳性菌落于含有氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中，37°c下200rpm培养12～16h，得到pcdh-trip重组载体的阳性菌。pcdh-trip重组载体如图1-2所示。
采用质粒小量提取试剂盒(kitver.4.0，货号9760)提取pcdh-trip重组载体，然后采用paci和xhoi限制性内切酶对pcdh-trip重组载体进行双酶切。
酶切产物的电泳图如图3所示，可以看到两条长度分别为1739bp和5602bp的片段，其中1739bp的片段为seqidno.7中的多功能组合启动子片段，5602bp的片段为pcdh，说明pcdh-trip重组载体构建成功。
实施例2，pcdh-trip重组慢病毒包装。
pcdh-trip慢病毒包装：将构建的pcdh-trip慢病毒载体和包装质粒共转染hek293细胞，包装病毒，收集和浓缩病毒液，进行滴度检测和moi值的测定，病毒液的滴度>1.00e 09tu/ml。
实施例3，pbabe-trip重组逆转录病毒载体构建。
（1）设计并合成如seqidno.11中的的多功能组合启动子片段。
（2）采用sphi和sali对载体pbabe载体进行双酶切，酶切体系见表3，酶切后对载体片段进行琼脂糖凝胶电泳回收。
表3，载体双酶切体系建立。
（3）采用t4dna连接酶，将同样经过sphi和sali双酶切的seqidno.7合成片段与凝胶回收获得的病毒载体进行dna连接反应，连接体系见表4，连接反应在22°c下保持60min。
表4，t4dna连接酶连接体系。
（4）将10μl连接产物加入到100μlstbl3感受态细胞中，冰上孵育30min，42°c水浴45s，再置于冰上2min，加入600μl的lb液体培养基；感受态细菌在37°c下150rpm摇床复苏培养45min，随后取100µl细菌涂布于含有氨苄青霉素抗性的lb平板上，37°c倒置培养16h，挑取阳性菌落于含有氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中，37°c下200rpm培养12～16h，得到pbabe-trip重组载体的阳性菌。pbabe-trip重组载体如图1-2所示。
采用质粒小量提取试剂盒(takaraminibestplasmidpurificationkitver.4.0，货号9760)提取pbabe-trip重组载体，然后采用paci和xhoi限制性内切酶对pbabe-trip重组载体进行双酶切。
酶切产物的电泳图如图3所示，可以看到两条长度分别为1485bp和5865bp的片段，其中1485bp的片段为多功能组合启动子片段，5865bp的片段为pbabe，说明pbabe-trip重组载体构建成功。
实施例4，pbabe-trip重组逆转录病毒包装。
pbabe-trip逆转录病毒包装：将构建的pbabe-trip逆转录病毒载体和包装质粒共转染gp2-293细胞，包装病毒，收集病毒液，进行滴度检测，病毒液的滴度>1.00e 08tu/ml。
综上所述，本发明构建了包含u6-mcs1-nfat-mcs2-ef1a-mcs3多功能组合启动子，利用分子克隆技术，将组合启动子连接到慢病毒载体中，构建得到的pcdh-trip多功能慢病毒载体；将组合启动子连接到逆转录病毒载体中，构建得到pbabe-trip多功能逆转录病毒载体；将构建的病毒载体包装后得到的相应的慢病毒或逆转录病毒，具有快速构建多功能cart细胞功能，显著提高了制备cart细胞的效率。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110>镇江维根生物科技有限公司
<120>一种多功能病毒载体的构建和应用
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1.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组载体包括由u6或h1启动子、nfat诱导表达启动子和ef1a/5’-ltr杂合组成性表达启动子构成的多功能组合启动子框架。
2.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述多功能组合启动子还包括三组多克隆位点（mcs）：
所述的u6启动子后多克隆位点mcs1，其限制性酶切位点为ecori和agei；nfat启动子后多克隆位点mcs2，其限制性酶切位点为nhei和bamhi；ef1a/5’-ltr启动子后多克隆位点mcs3，其限制性酶切位点为xbai和sali：
所述的重组载体为逆转录病毒载体或慢病毒载体；
所述的组合启动子的组成顺序为u6-mcs1-nfat-mcs2-ef1a/5’-ltr-mcs3；
所述的组合启动子的组成顺序不限于u6-mcs1-nfat-mcs2-ef1a/5’-ltr-mcs3，可以是其他顺序的组合。
3.根据权利要求1或2所述的重组载体，其特征在于，所述u6启动子的核酸序列如seqidno.1所示；
所述的多克隆位点lv-mcs1的核酸序列如seqidno.2所示；
所述的nfat的核酸序列如seqidno.3所示；
所述的多克隆位点lv-mcs2的核酸序列如seqidno.4所示；
所述的ef1a/5’-ltr的核酸序列如seqidno.5所示；
所述的多克隆位点lv-mcs3的核酸序列如seqidno.6所示；
所述的多功能lv载体的核酸序列如seqidno.7所示；
所述的多克隆位点rv-mcs1的核酸序列如seqidno.8所示；
所述的多克隆位点rv-mcs2的核酸序列如seqidno.9所示；
所述的多克隆位点lv-mcs3的核酸序列如seqidno.10所示；
所述的多功能rv载体的核酸序列如seqidno.11所示。
4.一种多功能慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括权利要求1-3任一项所述的多功能组合启动子，所述生物慢病毒载体所用的核酸序列如seqidno.7所示。
5.一种多功能逆转录病毒载体，其特征在于，所述逆转录病毒载体包括权利要求1-3任一项所述的多功能组合启动子，所述的逆转录病毒载体所用的核酸序列如seqidno.11所示。
6.一种制备如权利要求4所述的多功能慢病毒载体及病毒包装的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建如权利要求1-3任一项所述的组合启动子；
(2)将步骤(1)所述组合启动子克隆入慢病毒载体中，得到多功能慢病毒载体；
(3)将步骤(2)所述的慢病毒表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞并筛选阳性克隆；
(4)将筛选后的慢病毒载体质粒和包装质粒共转染哺乳动物细胞，包装得到所述慢病毒。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建的方法为任意基因片段可以插入seqidno.7所示的组合启动子中的任一多克隆位点，所述的步骤(4)所述的哺乳动物细胞为hek293细胞。
8.制备如权利要求5所述的多功能逆转录病毒载体的方法,根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建如权利要求1-3任一项所述的组合启动子；
(2)将步骤(1)所述组合启动子克隆入逆转录病毒载体中，得到多功能逆转录病毒载体；
(3)将步骤(2)所述的逆转录病毒载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞并筛选阳性克隆；
(4)将筛选后的逆转录病毒载体质粒和包装质粒共转染哺乳动物细胞，包装得到所述逆转录病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述构建的方法为任意基因片段可以插入seqidno.11所示的组合启动子中的任一多克隆位点，所述的步骤(4)所述的哺乳动物细胞为gp2-293细胞。
10.一种如权利要求2和3所述的组合启动子多功能病毒载体的应用，其特征在于：用于制备t细胞、巨噬细胞、nk细胞或nkt细胞的免疫疗法治疗肿瘤，进一步地，用于制备稳定的基因敲低或者过表达哺乳动物细胞株。
技术总结