技术领域：
本发明涉及一种基于crispr-cas9系统构建敲除epb41基因的thp-1细胞系，属于生物技术领域。
背景技术：
thp-1是人外周血的单核细胞系，最初来源于急性单核细胞性白血病患者，属于悬浮细胞，适合用于转染或感染实验，其表面抗原hla型为：a2，a9，b5，drw1，drw2。蛋白质4.1r(epb41基因)是一种膜-细胞骨架交联剂和衔接子，可以结合细胞质的血纤蛋白丝细丝复合物和多种跨膜蛋白。另外，蛋白4.1r在cd4 t淋巴细胞活化和信号转导的起始阶段发挥负调控作用。蛋白4.1r通过对cd8 t细胞的lat和erk蛋白磷酸化水平的负调控作用从而负调控cd8 t细胞活化与增殖。蛋白4.1r通过抑制cd4 t细胞活化从而减轻由小鼠自身抗原mog诱导小鼠脑脊髓炎(eae)模型自身免疫病理损伤。
鉴于蛋白4.1r在免疫反应中的重要作用，获得敲除epb41基因的细胞系对于研究蛋白4.1r的功能研究十分重要目前，4.1r缺失小鼠生育率低，繁殖周期长等问题。人源4.1r缺失的细胞系未见报道，为了更好的研究4.1r的功能，特别在一些免疫反应中的作用，急需发明一种敲除epb41基因的细胞系用于4.1r功能的研究，包括用于研究蛋白4.1r缺失对细胞膜功能的影响，也可用于研究蛋白4.1r与一些免疫反应或其它信号通路蛋白分子直接或间接的相互作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种基于crispr-cas9编辑技术的敲除人源epb41基因的细胞系及其构建方法。
一种基于crispr-cas9系统构建epb41基因敲除细胞系的方法，所述方法以人epb41基因第一外显子中的蛋白编码序列，第四外显子和第五外显子中的蛋白编码序列中符合5‘-g-n18-ngg-3或5‘-g-n20-ngg-3’或5’-ccn-n18-c-3’或5’-ccn-n20-c-3’序列规则排列的片段的“n18或n20”为靶序列；n表示a、t、c、g中的任一种，其中“n18”和“n20”分别为18和20个脱氧核苷酸。
优选地，所述的靶序列如seq-no.1，seq-no.2和seq-no.3所示。
优选地，所述的靶序列seq-no.1序列位于epb41基因第一外显子序列上；seq-no.2序列位于epb41基因第4外显子序列；seq-no.3序列位于epb41基因第7外显子序列。
根据靶序列的不同，所述方法为如下方法a或方法b或方法c：
方法a(靶序列为seqidno.1)，包括如下步骤：
(a1)sgrna的设计和寡核苷酸链的合成，并进行寡核苷酸链的合成根据人epb41基因的第一号外显子，第四号外显子和第七号外显子设计了1条sgrna，合成名称为正向单链dna-1和名称为反向单链dna-1的2个单链dna，所述正向单链dna-1的序列如seq-no.4所述反向单链dna-1的序列如seq-no.5；
(a2)将所述正向单链dna-1和反向单链dna-1进行退火反应，得到双链dna-1；
(a3)将上述双链dna-1连接到lenticrisprv2质粒的限制性内切酶bsmbi的切割位点处，得到重组质粒，标记为lenticrisprv2(b)-grna-epb41-1；
(a4)将上述lenticrisprv2(b)-grna-epb41-1，pcmv-vsv-g和pspax2质粒共转染到293t细胞包出慢病毒上清；
(a5)将上述慢病毒上清，加入thp-1细胞，经嘌呤霉素筛选后，获得epb41基因敲除细胞系；
方法b(靶序列为seqidno.2)，包括如下步骤：
(b1)sgrna的设计和寡核苷酸链的合成，并进行寡核苷酸链的合成根据人epb41基因的第四号外显子设计1条sgrna，合成名称为正向单链dna-2和名称为反向单链dna-2的2个单链dna，所述正向单链dna-2的序列如seq-no.6；所述反向单链dna-2的序列如seq-no.7(b2)将所述正向单链dna-2和反向单链dna-2进行退火反应，得到双链dna-2；
(b3)将上述双链dna-2连接到lenticrisprv2质粒的限制性内切酶bsmbi的切割位点处，得到重组质粒，标记为lenticrisprv2(b)-grna-epb41-2；
(b4)将上述lenticrisprv2(b)-grna-epb41-2，pcmv-vsv-g和pspax2质粒共转染到293t细胞包出慢病毒上清；
(b5)将上述慢病毒上清，加入thp-1细胞，经嘌呤霉素筛选后，获得epb41基因敲除细胞系；
方法c(靶序列为seqidno.3)，包括如下步骤：
(c1)sgrna的设计和寡核苷酸链的合成，并进行寡核苷酸链的合成根据人epb41基因的第七号外显子设计了1条sgrna，合成名称为正向单链dna-3和名称为反向单链dna-3的2个单链dna，所述正向单链dna-3的序列如seq-no.8；所述反向单链dna-3的序列如seq-no.9(c2)将所述正向单链dna-3和反向单链dna-3进行退火反应，得到双链dna-3；
(c3)将上述双链dna-2连接到lenticrisprv2质粒的限制性内切酶bsmbi的切割位点处，得到重组质粒，标记为lenticrisprv2(b)-grna-epb41-3；
(c4)将上述lenticrisprv2(b)-grna-epb41-3，pcmv-vsv-g和pspax2质粒共转染到293t细胞包出慢病毒上清；
(c5)将上述慢病毒上清，加入thp-1细胞，经嘌呤霉素筛选后，获得epb41基因敲除细胞系。
进一步地，所述的步骤(a3)、步骤(b3)和步骤(c3)中，所述质粒分别为lenticrisprv2(b)-grna-epb41-1，lenticrisprv2(b)-grna-epb41-2和lenticrisprv2(b)-grna-epb41-3。
本发明第二目的是要求保护利用上述方法制备得到的epb41基因被敲除的细胞系hp-1-ko-epb41-1，thp-1-ko-epb41-2和thp-1-ko-epb41-3及其应用。
本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了靶向人epb41基因的sgrna，然后将sgrna克隆至带有cas9基因的lenticrisprv2质粒并将质粒转染至细胞中，利用crispr-cas9系统达到基因沉默，通过药物筛选，从而获得人源epb41敲除的细胞系。
本发明的优点在于：
1，敲除epb41基因的thp-1细胞系，由于单个位点切割后某些片段的缺失起移码突变，故不能正确表达fscn1蛋白。
2，本发明利用第一次设计三条针对人源细胞系sgrna。
3，本发明构建的epb41基因敲除是在基因组水平上形成移码突变，故可以随着细胞的分裂增殖传递到下一代，形成稳定的epb41基因敲除细胞系。
本发明的用途如下：1，细胞系可作为研究蛋白4.1r对细胞膜的功能研究的实验材料。
2，细胞系可作为研究蛋白4.1r与一些蛋白分子直接或间接相互作用研究的实验材料。
3，可用于研究缺失蛋白4.1r对一些信号通路中关键信号分子磷酸化的影响。
附图说明
图1为lenticrisprv2载体质粒的酶切后电泳图，其中约11000bp的是酶切后所学的目的片段；
图2将引物退火与酶切后的lenticrisprv2载体连接，对连接后的质粒测序的结果。
图3epb41敲除细胞系的pcr扩增产物，g1，g2和g3分别是细胞系thp-1-ko-epb41-1，thp-1-ko-epb41-2和thp-1-ko-epb41-3基因组dna平pcr扩增产物的电泳图(约200bp)。
图4为细胞系基因组dnapcr扩增产物的测序结果，其中，图4(1-1)，图(2-2)和图(3-3)分别是thp-1-ko-epb41-1，thp-1-ko-epb41-2和thp-1-ko-epb41-3基因组dnapcr扩增产物的测序结果。
图5epb41敲除细胞系和转染未连接grna的lenticrisprv2质粒的thp-1细胞系(作为后续实验的阳性对照)，其中v2泳道为转染未连接grna的lenticrisprv2质粒的thp-1细胞系，g1，g2和g3泳道分别为thp-1-ko-epb41-1，thp-1-ko-epb41-2和thp-1-ko-epb41-3细胞系。
图6为v2和g1细胞感染hiv病毒载量比较图。
具体实施方式
下面将结合说明书附图，对本发明进行详细描述。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种基于crispr-cas9编辑技术的敲除epb41基因的细胞系的构建方法
1.sgrna的设计和寡核苷酸链的合成，分别针对人epb41基因的第1号外显子，第4号外显子和第7号外显子设计了三条sgrna，并进行寡核苷酸链的合成。靶序列如seq-no.1，seq-no.2和seq-no.3所示。
2.lenticrisprv2酶切
(1)lenticrisprv2酶切与末端去磷酸化：
37℃，切30min。
(2)1％琼脂糖凝胶电泳检测(结果见图1)；tiangelmidipurificationkit凝胶回收lenticrisprv2大片段，浓度测定。
3.lenticrisprv2载体的构建
(1)grna引物退火与磷酸化：
oligo1(100μm)1μl
oligo2(100μm)1μl
10×t4ligationbuffer1μl
t4pnk0.5μl
ddh2o6.5μl
37℃，30min，95℃，5min；之后每分钟降5℃，直至降至25℃。
(2)1：200稀释上述各双链片段于无菌水中。
(3)连接：
25℃，水浴30min。
(4)转化；冰上解冻快速dh5α感受态细胞，取1μl连接产物加入，冰上30min。涂皿，37℃培养。挑单克隆，每玻璃试管加入amp液体lb10ml，摇菌培养并保菌。质粒提取，测定浓度和测序鉴定(结果见图2)。
4.epb41基因敲除的thp-1细胞系的构建
(1)1×pbs洗293t细胞，0.25％胰酶消化。
(2)293t细胞800rpm离心后计数，4×105个/ml。
(3)每孔加入0.5ml10％fbsrpmi-1640细胞悬液，将细胞铺于24孔板中，37℃培养24h。待细胞长到70％—90％，用于转染crispr质粒。
(4)24孔板内293t细胞转染：参照
(5)转染2天，收集293t细胞包出的慢病毒上清，3000rpm，20min离心。冰上备用，其余上清可-80℃冻存。
(6)将thp-1细胞计数，离心并重悬后，每孔2×104个铺于96孔u底板内。100μl/孔。
(7)取293t细胞上清100μl/孔加入thp-1细胞中，切记不可取到293t细胞。补加2mg/mlpolybrene8μl/孔。
(8)培养2—3天。取500ml10％fbsrpmi-1640，加入10mg/mlpuromycin100μl，作为crispr筛选培养基4℃备用。
(9)将96孔u底板300g，5min离心，加入200μl/孔2μg/mlpuromycin10％fbsrpmi-1640。
(10)37℃、5％co2细胞培养箱培养3天，观察细胞是否感染上慢病毒。
(11)每3—4天换一次筛选培养基，连续筛选一个月左右，待肉眼可见细胞团，则转移至48孔或者24孔板内继续扩大培养，最后转移入t25cm2细胞培养瓶内培养。
(12)筛选的thp-1-ko-epb41-1，thp-1-ko-epb41-2和thp-1-ko-epb41-3细胞系冻存。
实施例2.epb41基因敲除的thp-1细胞系基因水平鉴定
(1)提取三株细胞系thp-1-ko-epb41-1，thp-1-ko-epb41-2和thp-1-ko-epb41-3内的基因组dna。(天根公司的基因组提取试剂盒目录号：dp304)
(2)针对三个sgrna的靶向位点设计三对鉴定引物，细胞系thp-1-ko-epb41-1正向和反向鉴定引物序列分别如seq-no.10和seq-no.11；，细胞系thp-1-ko-epb41-2正向和反向鉴定引物序列分别如seq-no.12和seq-no.13；细胞系thp-1-ko–epb41-3正向和反向鉴定引物序列分别如seq-no.14和seq-no.15，ranh提取细胞中基因组dna进行pcr扩增。
(3)pcr扩增产物(约200bp)并进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(结果见附图3)，切下目的条带。
(4)pcr扩增产物胶回收(fastpuregeldnaextractionminikit货号：dc301-01)。
(5)胶回收产物与质粒连接(pclone007versatilesimplevectorkit货号：007vs)。
(6)转化：冰上解冻快速dh5α感受态细胞，将连接好的产物的质粒转化进入感受态细胞，涂板，挑单克隆菌落，送擎科科技公司测序，每个细胞系挑取6个单克隆。(结果见图4)
从图4可以看出：经过grna的靶向作用后是基因组dna缺失碱基a，因此造成基因组dna移码突变，蛋白4.1r不能正常合成。
实施例3westernblot检测4.1r / thp-1和4.1r-/-thp-1细胞4.1r蛋白水平的表达
(1)细胞总蛋白的提取
收集对数生长期状态良好的thp-1细胞，用1×pbs洗涤两遍，800rpm离心5min，弃上清；按western裂解液：蛋白抑制剂(pmsf)的比例为100：1配制细胞裂解液，加入收集的细胞中，吹打混匀，冰上裂解30min，隔5min震荡一次，使其充分裂解；4℃，12000rpm离心10min，吸取上清到1.5ml离心管中，取一小部分蛋白，用于检测蛋白浓度，其余加入5×sdsloadingbuffer，在沸水中煮5min，分装保存于-80℃冰箱备用。
(2)蛋白浓度测定
根据bca蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定，具体步骤如下：
工作液的配制：根据标准品和样品的数量，按照试剂a：试剂b＝50：1比例配制bca工作液并充分混匀；稀释标准品：用1×pbs将10μlbsa标准品稀释至100μl，使其终浓度为0.5mg/ml。标准品按照每孔0、2、4、6、8、12、16、20μl加到96孔板中，并加1×pbs补足至20μl；将样品稀释，每孔加20μl样品到96孔板中，每个样品都做3个重复孔；每孔依次加入200μlbca工作液，在37℃培养箱孵育1h，用酶标仪在570nm处读取od值，并记录读数；制作标准曲线，根据标准曲线计算待测样品的蛋白浓度。
(3)westernblot
①制胶
根据说明书配制10％分离胶。
将分离胶小心加入玻璃板中，避免气泡产生，剩余2ml的上层空间，用超纯水水封，室温静置30min，当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固。倒掉超纯水，用吸水纸吸弃水分。
再按照说明书按配制浓缩胶。
加入配置好的浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡，室温静置30min；待上层胶凝固后，拔去梳齿即可用于电泳。
②上样及电泳
将胶板放入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液，缓慢拔掉梳子，加入蛋白marker和蛋白样品。按照恒压80v开始电泳，待溴酚蓝到达分离胶处时，将电压更改为120v，待溴酚蓝至分离胶最下端1cm处时结束电泳；
③半干转
电泳结束后，打开胶板将蛋白胶取出，按照蛋白marker指示，在目的蛋白对应的位置切下相应大小的蛋白胶，将pvdf膜剪成与蛋白胶大小一致的形状，先在甲醇中浸泡1-2min，然后与蛋白胶一同放入转膜缓冲液中浸泡20min。在电转槽按照顺序依次放入：滤纸→pvdf膜→蛋白胶→滤纸，压紧于转膜槽内，正负极对应好后，转膜15min；
④封闭
用1×tbst配制5％的脱脂奶粉，转膜完成后，拿出pvdf膜并标记好，放置摇床上室温封闭2h；
⑤孵育一抗
以1：1000比例用5％的脱脂奶粉稀释4.1r抗体，1：1000比例稀释gapdh抗体，将封闭好的pvdf膜放入孵育盒中，加入相应的抗体稀释液，4℃冰箱过夜孵育。次日用1×tbst洗膜，清洗4次，每次5min；
⑥孵育二抗
用5％脱脂奶粉按照1：4000比例稀释二抗羊抗兔igg-hrp，将pvdf膜放入稀释好的二抗中，放置于室温孵育1h，孵育完成后用1×tbst清洗4次，每次5-10min；
⑦ecl发光显影
洗膜完成后，将ecl发光液按照a液：b液＝1：1混匀，将混合后的发光液均匀滴在pvdf膜上，利用全自动凝胶成像仪进行曝光，获取蛋白条带图片(结果见图5)。epb41敲除细胞系和转染未连接grna的lenticrisprv2质粒的thp-1细胞系(作为后续实验的阳性对照)，其中v2泳道为转染未连接grna的lenticrisprv2质粒的thp-1细胞系，g1，g2和g3泳道分别为thp-1-ko-epb41-1，thp-1-ko-epb41-2和thp-1-ko-epb41-3细胞系。
实施例4蛋白4.1r对hiv感染的影响
1.将4.1r / thp-1(v2)和4.1r-/-thp-1(g1)细胞3×105个/孔铺在12孔板。
2.每孔加入病毒hivmoi＝1，放在37℃，5％co2培养箱吸附6h后，将细胞悬液收集到1.5ml离心管中，800rpm离心5min，弃上清。用1×pbs洗涤2次，无血清的培养基洗一次。
3.10％fbsrpmi-1640培养基重悬，铺于对应12孔板中，放置在37℃，5％co2培养箱培养48h。
4.放置在37℃，5％co2培养箱培养24h，48h后，将细胞悬液收集到1.5ml离心管中，800rpm离心5min，弃上清。用1×pbs洗涤3次，trizol法提取细胞内rna。
5.实时荧光定量pcr检测v2和g1细胞中hiv的病毒载量:
①荧光定量pcr反应配制体系如下：
②程序设置：90℃预变性30s；61℃，20min；95℃，30s；95℃，15s；60℃，1min；45个循环。
实验结果如图6所示：
在hiv感染v2和g1细胞24h，48h后，g1细胞内的病毒载量均高于v2细胞，说明4.1r缺失可以影响hiv感染thp-1细胞，因此本发明发法建立的4.1r-/-thp-1可以用于研究蛋白4.1r对病毒感染及抗病毒免疫反应作用的研究。
序列表
<110>郑州大学
中国科学院昆明动物研究所
<120>一种基于crispr-cas9系统构建epb41基因敲除thp-1细胞系的方法
<130>11
<160>15
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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1.一种基于crispr-cas9系统构建epb41基因敲除thp-1细胞系的方法，其特征在于：所述方法以人epb41基因第1外显子中的蛋白编码序列，第4外显子和第7外显子中的蛋白编码序列中符合5‘-g-n18-ngg-3或5‘-g-n20-ngg-3’或5’-ccn-n18-c-3’或5’-ccn-n20-c-3’序列规则排列的片段的“n18或n20”为靶序列；n表示a、t、c、g中的任一种，其中“n18”和“n20”分别为18和20个脱氧核苷酸。
2.根据权利要求1所述的基于crispr-cas9系统构建epb41基因敲除thp-1细胞系的方法，其特征在于：所述的靶序列如seq-no.1，seq-no.2和seq-no.3所示。
3.根据权利要求2所述的基于crispr-cas9系统构建epb41基因敲除thp-1细胞系的方法，其特征在于：所述的靶序列seq-no.1序列位于epb41基因第一外显子序列上；seq-no.2序列位于epb41基因第4外显子序列；seq-no.3序列位于epb41基因第7外显子序列。
4.根据权利要求3所述的基于crispr-cas9系统构建epb41基因敲除thp-1细胞系的方法，其特征在于：所述方法为如下方法a或方法b或方法c：
方法a(靶序列为seqidno.1)，包括如下步骤：
(a1)sgrna的设计和寡核苷酸链的合成，并进行寡核苷酸链的合成根据人epb41基因的第一号外显子设计了1条sgrna，合成名称为正向单链dna-1和名称为反向单链dna-1的2个单链dna，所述正向单链dna-1的序列如seq-no.4；所述正向单链dna-1的序列如seq-no.5；
(a2)将所述正向单链dna-1和反向单链dna-1进行退火反应，得到双链dna-1；
(a3)将上述双链dna-1连接到lenticrisprv2质粒的限制性内切酶bsmbi的切割位点处，得到重组质粒，标记为lenticrisprv2(b)-grna-epb41-1；
(a4)将上述lenticrisprv2(b)-grna-epb41-1，pcmv-vsv-g和pspax2质粒共转染到293t细胞包出慢病毒上清；
(a5)将上述慢病毒上清，加入thp-1细胞，经嘌呤霉素筛选后，获得epb41基因敲除细胞系；
方法b(靶序列为seqidno.2)，包括如下步骤：
(b1)sgrna的设计和寡核苷酸链的合成，并进行寡核苷酸链的合成根据人epb41基因的第四号外显子设计1条sgrna，合成名称为正向单链dna-2和名称为反向单链dna-2的2个单链dna，所述正向单链dna-2的序列如seq-no.6；所述正向单链dna-2的序列如seq-no.7；
(b2)将所述正向单链dna-2和反向单链dna-2进行退火反应，得到双链dna-2；
(b3)将上述双链dna-2连接到lenticrisprv2质粒的限制性内切酶bsmbi的切割位点处，得到重组质粒，标记为lenticrisprv2(b)-grna-epb41-2；
(b4)将上述lenticrisprv2(b)-grna-epb41-2，pcmv-vsv-g和pspax2质粒共转染到293t细胞包出慢病毒上清；
(b5)将上述慢病毒上清，加入thp-1细胞，经嘌呤霉素筛选后，获得epb41基因敲除细胞系；
方法c(靶序列为seqidno.3)，包括如下步骤：
(c1)sgrna的设计和寡核苷酸链的合成，并进行寡核苷酸链的合成根据人epb41基因的第七号外显子设计了1条sgrna，合成名称为正向单链dna-3和名称为反向单链dna-3的2个单链dna，所述正向单链dna-3的序列如seq-no.8；所述正向单链dna-3的序列如seq-no.9；
(c2)将所述正向单链dna-3和反向单链dna-3进行退火反应，得到双链dna-3；
(c3)将上述双链dna-2连接到lenticrisprv2质粒的限制性内切酶bsmbi的切割位点处，得到重组质粒，标记为lenticrisprv2(b)-grna-epb41-3；
(c4)将上述lenticrisprv2(b)-grna-epb41-3，pcmv-vsv-g和pspax2质粒共转染到293t细胞包出慢病毒上清；
(c5)将上述慢病毒上清，加入thp-1细胞，经嘌呤霉素筛选后，获得epb41基因敲除细胞系。
5.根据权利要求4所述的基于crispr-cas9系统构建epb41基因敲除thp-1细胞系的方法，其特征在于：所述的步骤(a3)、步骤(b3)和步骤(c3)中，所述质粒分别为lenticrisprv2(b)-grna-epb41-1，lenticrisprv2(b)-grna-epb41-2和lenticrisprv2(b)-grna-epb41-3。
6.根据权利要求4或权利要求5任一权利要求所述的基于crispr-cas9系统构建epb41基因敲除细胞系的方法建立的epb41基因敲除的thp-1细胞系thp-1-ko-epb41-1，thp-1-ko-epb41-2和thp-1-ko-epb41-3及其应用。
技术总结