本发明涉及细胞实验技术领域，特别是涉及一种基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法。
背景技术：
自噬是指细胞将一些受到损伤的细胞器、细胞内折叠或聚集错误的蛋白等细胞质成分进行包裹运送至溶酶体并进行降解的过程。自噬与细胞的生存、死亡以及永生化息息相关，自噬可以清除细胞代谢过程中产生的废物而有利于细胞生存。自噬是细胞应对各种病理变化及损伤的一种适应性保护机制，而且也对细胞的分化、发育和维持细胞的稳态起重要的作用。
自噬是依赖自身溶酶体来程序性地消化自身且形成特征性自噬小体，又被称为“ⅱ型程序性死亡”。自噬对细胞的影响并不一定是导致细胞走向死亡，然而细胞自噬水平过高可以溶解自身重要的结构而导致细胞死亡。
在卵巢组织的一些激活自噬的通路中，当自噬活动激活过于频繁时，会引起卵巢组织的加速衰老，进一步可能导致卵巢组织细胞的程序性死亡，进而引起早发性卵巢功能不全(poi)。在某种情况下，自噬过度可能会出现一些病理状态，如颗粒细胞死亡。越来越多的研究发现，卵巢颗粒细胞过度自噬导致的卵泡闭锁和停止发育，可能是早发性卵巢功能不全(poi)的发病机制之一。建立一种基于过度自噬的细胞损伤模型，进一步研究自噬在poi发病过程中的机制，可以为临床治疗poi提供更好的理论依据和治疗策略。
技术实现要素：
基于细胞损伤模型的建立研究现状，当前关于细胞损伤相关疾病的研究主要存在以下技术问题：(1)细胞损伤模型成功率低；(2)细胞损伤后的评价指标不客观；(3)细胞损伤后的评价体系不系统；(4)可重复性较差。
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法，包括以下步骤：
步骤1：卵巢上皮细胞cho进行体外培养；
步骤2：应用转染试剂lipofectamine3000将lc3-egfp转染到卵巢上皮细胞cho中；
步骤3：利用分选流式细胞仪将转染成功的cho细胞分选出来，得到过度表达自噬的卵巢上皮cho细胞株；
步骤4：根据过度表达自噬的卵巢上皮cho细胞的线粒体功能和线粒体氧化应激水平的改变，以及细胞周期阻滞情况，对过度表达自噬引起细胞功能的损伤情况进行鉴定，得到所述基于过度自噬的细胞损伤模型。
在本发明一个较佳实施例中，在步骤1中，卵巢上皮细胞cho进行体外培养的方法为：将cho细胞在含有10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、0.1mg/l链霉素的dmem培养基，并在含5％co2环境下，37℃培养箱中生长。
进一步的，所述构建方法还包括利用激光共聚焦显微镜观察对步骤3所得的过度表达自噬的卵巢上皮细胞cho细胞株进行验证。
为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种利用如上所述基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法构建的细胞损伤模型。
为解决上述技术问题，本发明还采用的另一个技术方案是：提供一种利用如上所述的细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，包括：
(1)检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体功能的影响；
(2)检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体氧化应激水平的影响；
(3)检测过度表达自噬对cho细胞的细胞周期阻滞的影响。
在本发明一个较佳实施例中，所述线粒体功能的影响包括表达水平、线粒体膜电位、线粒体融合相关蛋白表达的影响。
进一步的，检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体表达水平的影响的方法是利用mitrotrackerred染色。
进一步的，检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体膜电位的影响的方法是利用tmre染色。
进一步的，检测过度表达自噬对cho细胞线粒体融合相关蛋白表达的影响的方法包括从cho细胞中提取线粒体融合相关蛋白mitofusin-2，利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体融合相关蛋白mitofusin-2表达的影响。
在本发明一个较佳实施例中，检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体氧化应激水平的影响的方法包括利用mitosox染色或从cho细胞中提取抗氧化酶sod2蛋白，利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的抗氧化酶sod2表达的影响。
在本发明一个较佳实施例中，检测过度表达自噬对cho细胞的细胞周期阻滞的影响的方法包括从cho细胞中提取cdc2和cdk6细胞周期相关蛋白，利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的细胞周期相关蛋白cdc2和cdk6表达的影响。
本发明的有益效果是：本发明首先提供一种过度表达lc3蛋白细胞株的构建方法，继而通过建立过度表达自噬的cho细胞，评估过度表达自噬对cho细胞的一系列功能，包括线粒体表达，线粒体膜电位，线粒体氧化应激，细胞周期等所造成的影响，建立一种切实可行的基于细胞过度自噬的cho细胞损伤实验模型。本发明所构建的过度自噬细胞损伤模型是一种可靠的、可重复性俱佳的标准化卵巢上皮细胞体外损伤模型，可为研究过度自噬引起的细胞损伤提供一个新的细胞研究平台。
附图说明
图1是激光共聚焦显微镜下观察筛选的过度表达自噬的仓鼠卵巢上皮细胞cho细胞株的情况，图a是转染了n1-egfp的cho细胞，图b是转染了lc3-egfp的cho细胞。
图2是利用mitrotrackerred染色检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体表达水平的影响，图2a是cho-n1和cho-lc3细胞mitrotrackerred染色结果图，图2b是cho-n1和cho-lc3两组的mitrotrackerred染色平均荧光强度。
图3是利用tmre染色检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体膜电位的影响，图3a是cho-n1和cho-lc3细胞tmre染色结果图，图3b是cho-n1和cho-lc3两组的tmre染色平均荧光强度。
图4是利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体融合相关蛋白mitofusin-2表达的影响，图4a是cho-n1和cho-lc3细胞检测mitofusin-2表达的westernblot结果图，图4b是cho-n1和cho-lc3两组的mitofusin-2表达的相对定量图。
图5是利用mitosox染色检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体氧化应激的影响，图5a是cho-n1和cho-lc3细胞mitosox染色结果图，图5b是cho-n1和cho-lc3两组的mitosox染色平均荧光强度。
图6是利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的抗氧化酶sod2表达的影响，图6a是cho-n1和cho-lc3细胞检测抗氧化酶sod2表达的westernblot结果图，图6b是cho-n1和cho-lc3两组的sod2表达的相对定量图。
图7是利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞周期(cdc2，cdk6)的影响，图7a是cho-n1和cho-lc3细胞检测cdc2表达的westernblot结果图，图7b是cho-n1和cho-lc3两组的cdc2表达的相对定量图，图7c是cho-n1和cho-lc3细胞检测cdk6表达的westernblot结果图，图7d是cho-n1和cho-lc3两组的cdc2表达的相对定量图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1：筛选稳定表达lc3-egfp的仓鼠卵巢上皮细胞株
1)仓鼠卵巢上皮细胞cho体外培养；
卵巢上皮细胞cho细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，细胞培养试剂包括培养基dubucco’smodifiedeagle’smedium(dmem)和胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)购自gibco公司，谷氨酰胺(l-glutamine)、青霉素(penicillin)、链霉素(streptomycin)购自sigma-aldrich公司，转染试剂lipofectamine3000购自invitrogen公司。cho细胞在含有10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺，100单位/ml青霉素、0.1mg/l链霉素的dmem培养基，并在含5％co2环境下，37℃培养箱中生长。
2)lc3-egfp转染cho细胞，并用分选流式进行分选；
胰酶消化cho细胞，接种于6孔板(3×105个/孔)，培养24小时后，应用转染试剂lipofectamine3000将lc3-egfp和对照n1-egfp分别转染到仓鼠卵巢上皮细胞cho中；48小时后，利用分选流式细胞仪将转染成功的cho细胞分选出来；在含有600ug/ml的g418完全培养基中培养，筛选出稳定表达自噬的lc3-cho细胞系；成功筛选后，lc3-cho细胞在含有300ug/ml的g418完全培养基中继续培养。
3)lc3-cho阳性细胞株的检测。
用激光共聚焦显微镜对阳性细胞进行荧光鉴定，最后获得稳定转染自噬的lc3-cho细胞株，如图1所示。
实施例2：检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体功能的影响；
1)利用mitrotrackerred染色检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体表达水平的影响，如图2所示。
将5μmmitotrackerred染料加到lc3-cho和对照n1-cho细胞培养基中，37℃孵育30分钟。lc3-cho和对照n1-cho细胞分别用pbs洗3次，后用激光共聚焦显微镜(lsm800,zeiss)检测荧光强度。获取图片时所用的参数保持一致。与对照组相比，cho-lc3组细胞mitrotrackerred染色的平均荧光强度(代表线粒体的表达)显著降低，****p<0.0001。
2)利用tmre染色检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体膜电位的影响，如图3所示。
将100nmtmre染料加到lc3-cho和对照n1-cho细胞培养基中，37℃孵育20分钟。lc3-cho和对照n1-cho细胞分别用pbs洗3次，后用激光共聚焦显微镜(lsm800,zeiss)检测荧光强度。获取图片时所用的参数保持一致。与对照组相比，cho-lc3组细胞tmre染色的平均荧光强度(代表线粒体膜电位)显著降低，****p<0.0001。
3)利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体融合相关蛋白mitofusin-2表达的影响，如图4所示。
①从lc3-cho和对照n1-cho细胞中抽提蛋白；
从lc3-cho和对照n1-cho细胞培养皿中小心倾去培养液。用预冷的pbs清洗细胞2次，小心倾去pbs。细胞培养皿中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂(含蛋白酶抑制剂，pmsf和磷酸酶抑制剂的混合液)，轻轻摇动1分钟。用细胞刮将细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，置冰上裂解15分钟。裂解液于预冷的离心机中12，000rpm离心15分钟。弃去沉淀，lc3-cho和对照n1-cho上清液(蛋白)立刻转移入新的离心管中，100℃煮10分钟，-80℃保存待用。
②利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体融合相关蛋白mitofusin-2表达的影响。
cho-lc3和cho-n1蛋白样品在12％的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用线粒体融合相关蛋白mitofusin-2的抗体进行检测。与对照组相比，cho-lc3组细胞mitofusin-2表达量显著降低，**p<0.01。
实施例3：检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体氧化应激的影响；
1)利用mitosox染色检测过度表达自噬对cho细胞的氧化应激水平的影响，如图5所示；
将5μmmitosox染料加到lc3-cho和对照n1-cho细胞培养基中，37℃孵育10分钟。lc3-cho和对照n1-cho细胞分别用pbs洗3次，后用激光共聚焦显微镜(lsm800,zeiss)检测荧光强度。获取图片时所用的参数保持一致。与对照组相比，cho-lc3组细胞mitosox染色的平均荧光强度(代表线粒体氧化应激水平)显著升高，****p<0.0001。
2)利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的抗氧化酶sod2表达的影响，如图6所示；
①从lc3-cho和对照n1-cho细胞中抽提蛋白(步骤同上)；
②利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的抗氧化酶sod2表达的影响。
cho-lc3和cho-n1蛋白样品在12％的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用抗氧化酶超氧化物歧化酶2(superoxide-dimutase-2，sod2)的抗体进行检测。与对照组相比，cho-lc3组细胞mitofusin-2表达量明显降低，*p<0.05。
实施例4：利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的细胞周期的影响，如图7所示；
1)从lc3-cho和对照n1-cho细胞中抽提蛋白(步骤同上)；
2)利用westernblot检测过度表达自噬对细胞周期的影响。
cho-lc3和cho-n1蛋白样品在12％的sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上分离，然后转移到硝酸纤维素膜上，用细胞分裂周期2(celldivisioncycle2，cdc2)和周期蛋白依赖激酶6(cyclin-dependentkinases6，cdk6)的抗体进行检测。与对照组相比，cho-lc3组细胞cdc2表达量明显降低(*p<0.05)，而cdk6表达量显著上升(*p<0.01)。
应当理解本文所述的例子和实施方式仅为了说明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可根据它做出各种修改或变化，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：卵巢上皮细胞cho进行体外培养；
步骤2：应用转染试剂lipofectamine3000将lc3-egfp转染到卵巢上皮细胞cho中；
步骤3：利用分选流式细胞仪将转染成功的cho细胞分选出来，得到过度表达自噬的卵巢上皮cho细胞株；
步骤4：根据过度表达自噬的卵巢上皮cho细胞的线粒体功能和线粒体氧化应激水平的改变，以及细胞周期阻滞情况，对过度表达自噬引起细胞功能的损伤情况进行鉴定，得到所述基于过度自噬的细胞损伤模型。
2.根据权利要求1所述的基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法，其特征在于，在步骤1中，卵巢上皮细胞cho进行体外培养的方法为：将cho细胞在含有10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、0.1mg/l链霉素的dmem培养基，并在含5％co2环境下，37℃培养箱中生长。
3.根据权利要求1或2所述的基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括利用激光共聚焦显微镜观察对步骤3所得的过度表达自噬的卵巢上皮细胞cho细胞株进行验证。
4.一种利用如权利要求1至3任一项所述基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法构建的细胞损伤模型。
5.一种利用如权利要求4所述的细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，包括：
(1)检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体功能的影响；
(2)检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体氧化应激水平的影响；
(3)检测过度表达自噬对cho细胞的细胞周期阻滞的影响。
6.根据权利要求5所述的利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，所述线粒体功能的影响包括表达水平、线粒体膜电位、线粒体融合相关蛋白表达的影响。
7.根据权利要求6所述的利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体表达水平的影响的方法是利用mitrotrackerred染色。
8.根据权利要求6所述的利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体膜电位的影响的方法是利用tmre染色。
9.根据权利要求5所述的利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，检测过度表达自噬对cho细胞的线粒体氧化应激水平的影响的方法包括利用mitosox染色或从cho细胞中提取抗氧化酶sod2蛋白，利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的抗氧化酶sod2表达的影响。
10.根据权利要求5所述的利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，检测过度表达自噬对cho细胞的细胞周期阻滞的影响的方法包括从cho细胞中提取cdc2和cdk6细胞周期相关蛋白，利用westernblot检测过度表达自噬对cho细胞的细胞周期相关蛋白cdc2和cdk6表达的影响。
技术总结