本发明涉及植物分子育种
技术领域：
。具体地说是一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法。
背景技术：
：亚麻(linumusitatissimuml.)一般分为油用亚麻和纤维亚麻两种，主要分布于我国华北、西北地区。亚麻具有抗旱、耐瘠薄的特点，适应于严酷的生态环境，已成为旱地农业中不可取代的抗旱作物，在农业结构调整中具有重要作用。亚麻是纺织工业和油脂工业的重要原料。亚麻不仅是非常好的食用保健油，而且还可以用于化工油漆、高档轿车喷漆等行业中。从亚麻籽中提取的亚麻胶在食品、医药、日化行业中有着十分重要的应用价值。亚麻籽中含油率40％左右、蛋白质22～25％、不溶性膳食纤维20～22％、木酚素10％左右，亚麻酸45％～60％，具有降低胆固醇，调节血脂、抑制血栓形成，预防和抗癌效果。亚麻是一种高度自花授粉作物，在高产育种技术上，仍沿用常规育种手段，育种效率低。利用基因工程技术获得适合杂交育种亲本材料成为解决该问题的有效方法之一。随分子育种技术的发展，基因枪介导法目前广泛应用于植物遗传改良当中。国内外针对亚麻的遗传转化开展了大量研究，虽转化受体材料从悬浮细胞系、花药、下胚轴、组织生长点均有培养。在遗传转化法中农杆菌介导和花粉管导入广泛应用获得转化阳性植株，且基因枪介导法的亚麻遗传转化仍待拓展。轮选3号是一个丰产、优质、抗病、抗倒伏性强，生育期较短，抗旱性好，适应性较广的亚麻品种，目前还没有关于其高效组培及遗传转化方法的报道。基因枪法是利用压缩气体等作为动力，把粘附有dna的金粉打向细胞，完成基因转移操作，基因枪在打枪后，会产生很大的气流，利用基因枪法受体材料时，由于受体材料质量较轻，产生的气流容易将受体吹散，影响基因枪的命中率。技术实现要素：为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，使用亚麻雄性不育表达载体可实现亚麻轮选3号的基因枪介导的亚麻遗传高效转化方法。为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，包括如下步骤：(1)培养亚麻轮选3号种子获得下胚轴；(2)采用基因枪法将含亚麻雄性不育表达的载体轰击至亚麻轮选3号下胚轴中，得到枪击后下胚轴；(3)将所述枪击后幼胚接种至诱导培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织；(4)将所述胚性愈伤组织接种至选择培养基中进行培养，得到抗性愈伤组织；(5)将所述抗性愈伤接种至再生培养基中进行培养，得到幼苗；(6)将所述幼苗在生根培养基中培养，得到亚麻轮选3号转基因植株。上述一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，在步骤(1)中，亚麻轮选3号种子用体积分数为70％的酒精表面消毒40s-1min，无菌水冲洗3次后，用质量体积分数为0.1％的hgcl2消毒6min，无菌水冲洗4次，然后在超净工作台中放入种子培养基的三角瓶，黑暗条件23℃培养5-7天后，选择健壮的下胚轴切成1cm。上述一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，在步骤(2)中：(2-1)在轰击前，亚麻轮选3号下胚轴在诱导培养基培养3天后转入直径6cm的培养皿中，23℃预培养4天；(2-2)质粒dna包裹的方法为：取出50μl的金粉甘油混合物，加入5μl亚麻雄性不育基因表达载体、50μl的浓度为2.5mcacl2和20μl的浓度为0.1m亚精胺，一边加一边震荡混匀；加140μl的70％酒精，震荡2分钟，静止1分钟，去上清；加140μl的100％酒精，震荡2分钟，静止1分钟，去上清；加60μl的100％乙醇，用枪吸打混匀后取8μl100％乙醇置于微粒载膜中央，并平铺，凉至完全干燥后用于轰击亚麻下胚轴组织，其中金粉甘油混合物为3mg金粉加50μl甘油；含有目的基因的亚麻雄性不育基因的表达载体ms-f为part27重组载体；(2-3)将基因枪置于基因枪用样品架上，然后轰击亚麻下胚轴组织，轰击参数为：1100psi氦气压力，27inhg真空度，6cm射击距离，亚麻下胚轴需轰击2次。上述一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，所述基因枪用样品架，包括真空室和位于真空室顶部的基因枪固定筒，所述真空室的内壁底部通过支架固定连接有支撑组件，所述支撑组件的底部连通有抽气管，所述支撑组件通过抽气管连通有真空罐，所述真空室的内壁顶部设置有进气环，所述进气环的顶部连通有进气管；所述支撑组件包括上支撑筒和下支撑筒，所述下支撑筒的顶端设置有第一微孔板，所述下支撑筒的侧壁设置有外螺纹，所述上支撑筒的内壁设置有内螺纹，所述上支撑筒的底端和下支撑筒的上端通过内螺纹和外螺纹螺纹连接，且所述上支撑筒的底端压紧第一微孔板的顶部，所述上支撑筒的内壁上部固定连接有支撑横杆，所述上支撑筒的内壁顶部开设有卡槽，所述下支撑筒的底部固定连接有缓冲皮膜；所述下支撑筒的底部通过支架与真空室的内壁底部固定连接，所述缓冲皮膜底部中间与抽气管连通并通过抽气管与真空罐连通，所述抽气管的中部设置有第二调速阀。上述一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，所述卡槽内卡接有固定环，所述固定环的底部固定连接有第二微孔板，所述第二微孔板的底部搭接在支撑横杆的顶部，所述第一微孔板的直径大于第二微孔板的直径，所述第一微孔板表面的微孔内径小于第二微孔板表面的微孔内径。上述一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，所述进气环的内壁中部设置有过滤板，所述进气环的底部沿其周向均匀开设有排气孔，所述进气环的顶部连通有进气管，所述进气管的中部设置有第一调速阀，所述进气环的顶部与真空室的内壁顶部固定连接；所述真空室的正面设置有密封门，所述真空室的顶部连通有第一负压表，所述真空罐的顶部连通有第二负压表；所述真空罐的侧面连通有第二真空泵，所述真空室的背面分别连通有第一真空泵和单向排气阀；所述真空室的正面设置有控制器，所述控制器通过导线分别与真空室连通的第一负压表、与真空罐连通的第二负压表、第一真空泵、第二真空泵、抽气管中部的第二调速阀和进气管中部的第一调速阀电性连接。上述一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，在步骤(3)中，轰击后的下胚轴在诱导培养基，23℃白光照16h/黑暗8h培养4天，得到胚性愈伤组织；在步骤(4)中，下胚轴表面有愈伤突起时再转移至选择培养基上进行选择，以后每7天转移1次，27℃白光16h/黑暗8h培养14-21天，选择能够正常生长的愈伤组织，经3～4次选择后，抗除草剂的愈伤组织转入诱导培养基上诱导胚状体的形成，得到抗性愈伤组织；在步骤(5)中，27℃，光照周期为白光16h/黑暗8h条件下培养21-28天，将发育好的胚状体转移再生培养基上萌发生长，得到幼苗；在步骤(6)中，当幼苗有3-5叶片时，切下植株放入装有生根培养基的三角瓶，23℃，光照周期为白光16h/黑暗8h条件下培养14-21天，选择根系生长健壮的植株移栽到小花盆中，用塑料袋包裹保湿，2周后去掉塑料袋，将植株移入大花盆中，小花盆中的基质为土、腐植质、有机肥按照质量比为1:1:1进行混合。上述一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，种子培养基为ms大量50ml/l、ms有机5ml/l、肌醇5ml/l、铁盐2.5ml/l、ms微量0.5ml/l、蔗糖15g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中倒入三角瓶中待用；诱导培养基为ms大量100ml/l、ms有机10ml/l、肌醇6ml/l、铁盐5ml/l、ms微量1ml/l、蔗糖30g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.1-0.5mg/lnaa和0.1-0.5mg/ltdz，倒入培养皿中待用；再生培养基为ms大量100ml/l、ms有机10ml/l、肌醇6ml/l、铁盐5ml/l、ms微量1ml/l、蔗糖30g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.1-0.5mg/lnaa和0.1-0.5mg/ltdz，倒入培养皿中待用；选择培养基为ms大量100ml/l、ms有机10ml/l、肌醇6ml/l、铁盐5ml/l、ms微量1ml/l、蔗糖30g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.1-0.5mg/lnaa、0.1-0.5mg/ltdz和41％的草甘膦6ml/l，倒入培养皿中待用；生根培养基为ms大量50ml/l、ms有机5ml/l、肌醇3ml/l、铁盐2.5ml/l、ms微量0.5ml/l、蔗糖15g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.1-0.5mg/lnaa和0.2-1.0mg/lccc，倒入三角瓶中待用。上述一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，诱导培养基、再生培养基、选择培养基中加入0.2mg/lnaa和0.2mg/ltdz；生根培养基中，加入0.2mg/lnaa和0.5mg/lccc。上述一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，ms大量为ms大量基础盐，ms大量基础盐由溶剂水和溶质组成，所述溶质为硝酸钾、硝酸铵、七水合硫酸镁、磷酸二氢钾和二水合氯化钙或无水氯化钙，其中硝酸钾加入量为19g/l、硝酸铵的加入量为16.5g/l，七水合硫酸镁的加入量为3.7g/l、磷酸二氢钾的加入量为1.7g/l，二水合氯化钙或无水氯化钙的加入量为4.4g/l或3.32g/l；ms有机为ms有机基础盐，ms有机基础盐由溶剂水和溶质组成，所述溶质为盐酸硫胺素vb1、盐酸吡哆醇vb6、烟酸和谷氨酸；盐酸硫胺素vb1加入量为1.00g/l、盐酸吡哆醇vb1加入量为0.50g/l、烟酸加入量为0.50g/l和谷氨酸加入量为2.00g/l；ms微量为ms微量基础盐，ms微量基础盐由溶剂水和溶质组成：所述溶质为水合硫酸锰、七水合硫酸锌、硼酸、碘化钾、二水合钼酸钠、无水合硫酸铜、六水合氯化钴；水合硫酸锰的加入量为22.3g/l、七水合硫酸锌的加入量为8.60g/l、硼酸的加入量为6.20g/l、碘化钾的加入量为0.83g/l、二水合钼酸钠的加入量为0.25g/l、无水合硫酸铜的加入量为0.025g/l、六水合氯化钴的加入量为0.025g/l；肌醇为ms肌醇基础盐，ms肌醇基础盐由溶剂水和溶质组成，所述溶质为肌醇，肌醇的加入量为10.00g/l；铁盐为ms铁盐基础盐，ms铁盐基础盐由溶剂水和溶质组成：所述溶质为七水合硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠，七水合硫酸亚铁的加入量为5.57g/l、乙二胺四乙酸二钠的加入量为7.45g/l。本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：1、通过大量元素、微量元素、有机物及激素的优化组合，使亚麻轮选3号下胚轴愈伤诱导效率最高可达45％；再生出苗效率最高达28％。2、通过基因枪介导，将具有抗除草剂基因和亚麻雄性不育基因连锁的亚麻雄性不育表达载体轰击亚麻下胚轴，可实现亚麻轮选3号的稳定转化。阳性率最高可达38％，转化再生诱导率最高可达5.8％。3.本发明通过大量元素、微量元素、有机物及激素的优化组合，开发出一种适用于亚麻轮选3号组织培养的再生体系，并通过基因枪介导的方式实现该品种的稳定转化。4、本申请中的基因枪用样品架，通过设置第一微孔板和第二微孔板，能够将亚麻下胚轴放置在第二微孔板上，将真空罐和真空室内均抽真空后，且真空罐内的真空度大于真空室内的真空度，通过开启第一调速阀和第二调速阀，外界的气体通过进气环进入真空室内，由于真空罐内的真空度大于真空室内的真空度，进入真空室的气体向下流动并经过第一微孔板和第二微孔板的微孔后被抽入真空罐，外界不断的向真空室内供入气体，气体向下流动，给亚麻下胚轴施加向下的压力，同时真空罐通过第二微孔板表面的微孔对亚麻下胚轴的底部施加一定的吸引力，从而使亚麻下胚轴紧贴在第二微孔板的表面；基因枪开枪产生的气流使真空室内真空度下降，真空室内真空度和真空罐内有较大的压力差，真空罐吸引亚麻下胚轴的力度更大，继而保证亚麻下胚轴在基因枪开枪时也能够紧贴第二微孔板的表面。5、本申请中的基因枪用样品架，通过在支撑组件底部设置缓冲皮膜，能够在基因枪开枪后真空室内真空度快速下降，此时真空罐内真空度和真空室内真空度存在较大压力差，缓冲皮膜由于具有一定的弹性会产生一定的形变，能够缓冲一定的压力差，避免真空罐对第二微孔板上部的亚麻下胚轴造成过度吸引，避免损伤亚麻下胚轴；且在基因枪开枪后，控制器控制第二调速阀逐渐缩小节流口面积，进一步限制抽气速度，避免对亚麻下胚轴造成过度吸引。6、通过设置第一调速阀，能够控制外界气体以稳定的流量进入真空室，通过是设置第二调速阀，能够控制外界进入真空室的气体以稳定的速度被抽出，从而在真空室内形成稳定的气流，进而使亚麻下胚轴稳定的保持在第二微孔板的顶部；第一微孔板的直径大于第二微孔板的直径，有利于空气快速通过第一微孔板，且能够分散来自真空罐的负压吸引力，避免支撑组件内负压力不均匀。7、通过基因枪用样品架，使得亚麻雄性不育表达载体被稳定的轰击进入亚麻下胚轴内，提高命中率，有利于实现亚麻轮选3号的稳定转化。附图说明图1亚麻轮选3号种子培养；图2亚麻轮选3号下胚轴生长表型图3亚麻轮选3号下胚轴愈伤诱导表型；图4亚麻轮选3号下胚轴抗性再生出苗表型图5亚麻轮选3号组培苗生根；图6亚麻轮选3号组培苗阳性检测；图7基因枪用样品架的侧视剖面结构示意图；图8基因枪用样品架的进气环的剖面结构示意图；图9基因枪用样品架的支撑组件的剖面结构示意图；图10基因枪用样品架的支撑组件的立体结构示意图；图11基因枪用样品架的固定环的结构示意图。图中附图标记表示为：1-真空室；2-基因枪固定筒；3-第一负压表；4-进气环；5-第一调速阀；6-进气管；7-单向排气阀；8-密封门；9-支撑组件；10-抽气管；11-第二调速阀；12-真空罐；13-第二负压表；14-第一真空泵；15-第二真空泵；16-过滤板；17-排气孔；18-上支撑筒；19-下支撑筒；20-第一微孔板；21-支撑横杆；22-卡槽；23-固定环；24-第二微孔板；25-缓冲皮膜；26-控制器。具体实施方式实施例1、亚麻雄性不育载体构建以亚麻雄性不育基因ms2-f序列为目标，选择该基因不同的2个片段172和944，构建了2个双链rna表达盒载体phannibal-172和phannibal-944，此基础上，利用植物表达载体part27，以及克隆的拟南芥绒毡层特异a9启动子和抗除草剂基因epsps，构建2个抗除草剂基因和亚麻雄性不育基因连锁的亚麻雄性不育表达载体。实施例2、亚麻轮选3号下胚轴遗传转化方法一、本实施例中所涉及的ms大量、ms微量、ms有机、肌醇和铁盐的配制方法如下：ms大量为ms大量基础盐，ms大量基础盐由溶剂水和溶质组成，所述溶质为硝酸钾、硝酸铵、七水合硫酸镁、磷酸二氢钾和二水合氯化钙或无水氯化钙，加入量如表1所示：表1成分使用浓度(g/l)硝酸钾kno319硝酸铵nh4no316.5七水合硫酸镁mgso4·7h2o3.7磷酸二氢钾kh2po41.7二水合氯化钙或无水氯化钙caci2·2h2o或caci24.4或3.32ms微量为ms微量基础盐，ms微量基础盐由溶剂水和溶质组成：所述溶质为水合硫酸锰、七水合硫酸锌、硼酸、碘化钾、二水合钼酸钠、无水合硫酸铜、六水合氯化钴；加入量如表2所示：表2成分使用浓度(g/l)水合硫酸锰mnso4·h2o22.30七水合硫酸锌znso4·7h2o8.60硼酸h3bo46.20碘化钾ki0.83二水合钼酸钠na2mo·2h2o0.25无水合硫酸铜cuso4·5h2o0.025六水合氯化钴coci2·6h2o0.025ms有机为ms有机基础盐，ms有机基础盐由溶剂水和溶质组成，所述溶质为盐酸硫胺素vb1、盐酸吡哆醇vb1、烟酸和谷氨酸；加入量如表3所示：表3成分使用浓度(mg/ml)盐酸硫胺素vb11.00盐酸吡哆醇vb60.50烟酸0.50甘氨酸2.00肌醇为ms肌醇基础盐，ms肌醇基础盐由溶剂水和溶质组成，所述溶质为肌醇，加入量如表4所示：表4成分使用浓度(g/l)肌醇10.00铁盐为ms铁盐基础盐，ms铁盐基础盐由溶剂水和溶质组成：所述溶质为七水合硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠，加入量如表5所示：表5成分使用浓度(g/l)七水合硫酸亚铁feso4·7h2o5.57乙二胺四乙酸二钠na2edta7.45二、亚麻轮选3号下胚轴组织培养方法1、培养亚麻轮选3号种子获得下胚轴挑取饱满健壮的轮选3号种子，用纱布包好，放入烧杯中。用自来水流冲洗亚麻种子30min，用70％的酒精表面消毒40s-50s，无菌水冲洗3次后，用质量浓度为0.1％的hgcl2消毒6min，无菌水冲洗4次，然后在超净工作台中接种到种子培养基的三角瓶，每瓶接8粒种子，黑暗条件23℃培养4天后，将三角瓶中长好的种子下胚轴放入灭菌的空培养皿中，并用镊子和手术刀将其切成1cm左右。种子培养基为ms大量50ml/l、ms有机5ml/l、肌醇5ml/l、铁盐2.5ml/l、ms微量0.5ml/l、蔗糖15g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中倒入三角瓶中待用；2、采用基因枪法轰击下胚轴(2-1)轰击前，将切好的下胚轴转入诱导培养基中，每瓶接入25个下胚轴。光照16h/黑暗8h，27℃培养4天后，下胚轴转入新的诱导培养基的培养皿中，整齐摆好基因枪轰击的中央地带，50个下胚轴置于基因枪用样品架的第二微孔板24上。(2-2)质粒dna包埋(1)、用厂家提供的嵌入工具将放置微粒载体的黄片固定在钢碗底部环内。(2)、将阻挡网和固定好的载体放入小培养皿中，用报纸包好，在121℃下湿热灭菌20分钟。(3)、称取6mg金粉(可打十二枪)到1.5ml离心管中，加1ml70％酒精震荡3到5分钟，静止15分钟，离心5秒。(4)、加入1ml水震荡1分钟、静止1分钟、短暂离心后去上清，重复以上三步三次。(5)、加入100μl50％的甘油放入4℃避氧保存，即为金粉甘油混合物。(能保存两周)(6)、取出步骤(5)中制备的金粉甘油混合物，再次震荡5分钟后，取50μl的金粉甘油混合物。(7)、向取出50μl的金粉甘油混合物(3mg金粉加50μl甘油)，加入5μl质粒dna、50μl的2.5mcacl2和20μl的0.1m亚精胺，一边加一边震荡混匀。(8)、加完后再震荡2-3分钟，然后静止1分钟，然后离心2秒，去上清。(9)、加140μl70％酒精，震荡2分钟，静止1分钟，去上清。(10)、加140μl100％乙醇，震荡2分钟，静止1分钟，去上清。(11)、加60μl100％乙醇，用枪吸打混匀后取8μl100％乙醇置于microcarrier上，并平铺，凉至完全干燥，待用。(2-3)将基因枪置于基因枪用样品架上，然后轰击亚麻下胚轴组织。基因枪用样品架，如图7包括真空室1和位于真空室1顶部的基因枪固定筒2，所述真空室1的顶部连通有第一负压表3，所述真空室1的正面设置有密封门8，所述真空室1的背面分别连通有第一真空泵14和单向排气阀7，所述真空室1的正面设置有控制器26，所述控制器26通过导线分别与真空室1连通的第一负压表3、与真空罐12连通的第二负压表13、第一真空泵14、第二真空泵15、抽气管10中部的第二调速阀11和进气管6中部的第一调速阀5电性连接，通过设置第一调速阀5，能够控制外界气体以稳定的流量进入真空室1，通过是设置第二调速阀11，能够控制外界进入真空室1的气体以稳定的速度被抽出，从而在真空室1内形成稳定的气流，进而使亚麻下胚轴稳定的保持在第二微孔板24的顶部，所述真空室1的内壁底部通过支架固定连接有支撑组件9，如图9-10所示，所述支撑组件9包括上支撑筒18和下支撑筒19，所述下支撑筒19的顶端设置有第一微孔板20，所述下支撑筒19的侧壁设置有外螺纹，所述上支撑筒18的内壁设置有内螺纹，所述上支撑筒18的底端和下支撑筒19的上端通过内螺纹和外螺纹螺纹连接，且所述上支撑筒18的底端压紧第一微孔板20的顶部，所述上支撑筒18的内壁上部固定连接有支撑横杆21，所述下支撑筒19的底部固定连接有缓冲皮膜25，通过设置缓冲皮膜25，能够在基因枪开枪后真空室1内真空度快速下降，此时真空罐12内真空度和真空室1内真空度存在较大压力差，缓冲皮膜25由于具有一定的弹性会产生一定的形变，能够缓冲一定的压力差，避免真空罐12对第二微孔板24上部的亚麻下胚轴造成过度吸引，避免损伤亚麻下胚轴；且在基因枪开枪后，控制器26控制第二调速阀11逐渐缩小节流口面积，进一步限制抽气速度，避免对亚麻下胚轴造成过度吸引，所述上支撑筒18的内壁顶部开设有卡槽22，所述卡槽22内卡接有固定环23，如图11所示所述固定环23的底部固定连接有第二微孔板24，所述第二微孔板24的底部搭接在支撑横杆21的顶部，所述第一微孔板20的直径大于第二微孔板24的直径，所述第一微孔板20表面的微孔内径小于第二微孔板24表面的微孔内径，通过设置第一微孔板20和第二微孔板24，能够将亚麻下胚轴放置在第二微孔板24上，将真空罐12和真空室1内均抽真空后，且真空罐12内的真空度大于真空室1内的真空度，通过开启第一调速阀5和第二调速阀11，外界的气体通过进气环4进入真空室1内，由于真空罐12内的真空度大于真空室1内的真空度，进入真空室1的气体向下流动并经过第一微孔板20和第二微孔板24的微孔后被抽入真空罐12，外界不断的向真空室1内供入气体，气体向下流动，给亚麻下胚轴施加向下的压力，同时真空罐12通过第二微孔板24表面的微孔对亚麻下胚轴的底部施加一定的吸引力，从而使亚麻下胚轴紧贴在第二微孔板24的表面；所述下支撑筒19的底部通过支架与真空室1的内壁底部固定连接，所述缓冲皮膜25底部中间与抽气管10连通并通过抽气管10与真空罐12连通，所述抽气管10的中部设置有第二调速阀11，所述真空罐12的顶部连通有第二负压表13，所述真空罐12的侧面连通有第二真空泵15，在基因枪开枪产生的气流使真空室1内真空度下降，真空室1内真空度和真空罐12内有较大的压力差，真空罐12吸引亚麻下胚轴的力度更大，继而保证亚麻下胚轴在基因枪开枪时也能够紧贴第二微孔板24的表面。所述真空室1的内壁顶部设置有进气环4，如图8所示，所述进气环4的内壁中部设置有过滤板16，所述进气环4的底部沿其周向均匀开设有排气孔17，所述进气环4的顶部连通有进气管6，所述进气环4的顶部连通有进气管6，所述进气管6的中部设置有第一调速阀5，所述进气环4的顶部与真空室1的内壁顶部固定连接。使用时：用70％乙醇对基因枪表面及真空室1进行消毒。将基因枪插入基因枪固定筒2内，并使基因枪与固定筒之间密封，将进气管6连通洁净的气源，根据亚麻下胚轴的直径选择第二微孔板24，第二微孔板24的微孔孔径小于用于实验的亚麻下胚轴直径，然后将亚麻下胚轴放置在第二微孔板24的顶部，当准备工作完成后，关闭密封门8，通过控制器26打开第一真空泵14和第二真空泵15，此时第一调速阀5完全关闭，第二调速阀11完全开启，第一真空泵14将真空室1内的气体抽出，第二真空泵15将真空罐12内的气体抽出，由于第二调速阀11完全开启，即真空罐12和真空室1处于完全连通状态，两者真空度相等，当真空室1内抽至设定真空度后，第一真空泵14停止工作，第二真空泵15继续工作，同时控制器26控制第一调速阀5打开一定的角度，并控制第二调速阀11闭合相应的角度，使第一调速阀5和第二调速阀11处于相同的开合角度，此时，洁净气源的气体通过进气管6进入进气环4，进气环4对气体进行过滤，将气流分散并通过多个排气孔17将气流排入真空室1，由于第二真空泵15继续工作，真空罐12的负压度大于真空室1负压度，对气体进行吸引，气体通过第二微孔板24和第一微孔板20表面的微孔被抽入真空罐12，向下流动的气流会对亚麻下胚轴施加向下的压力，同时第二微孔板24下方的真空度大于其上部的真空度，从而对亚麻下胚轴实现吸引；当基因枪开枪时，基因枪与控制器26联动，基因枪产生的气流使真空室1内真空度迅速下降，造成真空室1和真空罐12具有较大的压力差，真空罐12通过第二微孔板24吸引亚麻下胚轴，真空室1内气流快速通过第二微孔板24表面的微孔，对亚麻下胚轴下压，增加对亚麻下胚轴的吸引力度，避免其被吹散，由于真空室1内压力大于下支撑筒19内部压力，缓冲皮膜25向内产生形变，提供一定的缓冲，避免压差过大对亚麻下胚轴造成过度吸引，同时，在基因枪开枪的同时，控制器26控制第二调速阀11逐渐缩小节流面积直至完全闭合，并控制第二真空泵15停止工作，进一步避免对亚麻下胚轴过度吸引，当真空室1内的气压大于大气压时，真空室1内部气体通过单向排气阀7排出。轰击参数为：1100psi氦气压力，27inhg真空度，6cm射击距离，亚麻下胚轴需轰击2次。3、愈伤组织诱导培养将所述枪击后幼胚接种至愈伤诱导培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织；轰击后的下胚轴在诱导培养基23℃培养4天，光照16h/黑暗8h，得到胚性愈伤组织；诱导培养基为ms大量100ml/l、ms有机10ml/l、肌醇6ml/l、铁盐5ml/l、ms微量1ml/l、蔗糖30g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.2mg/lnaa和0.2mg/ltdz，倒入培养皿中待用；4、选择培养将所述胚性愈伤组织接种至选择培养基中进行培养，得到抗性愈伤组织；将所述胚性愈伤组织转入选择培养基上进行选择，以后每7天转移1次，选择能够正常生长的愈伤组织，经3～4次选择后，抗除草剂草甘膦的愈伤组织转入诱导培养基上诱导胚状体的形成，得到抗性愈伤组织；选择培养基光照16h/黑暗8h，27℃培养14-21天。选择培养基为ms大量100ml/l、ms有机10ml/l、肌醇6ml/l、铁盐5ml/l、ms微量1ml/l、蔗糖30g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.2mg/lnaa、0.2mg/ltdz和41％的草甘膦6ml/l，倒入培养皿中待用；5、再生培养：将所述抗性愈伤接种至再生培养基中进行培养，得到幼苗。2-3周后，将发育好的胚状体转移再生培养基上萌发生长，每7天转移1次，再生培养基光照16h/黑暗8h，27℃培养21-28天。再生培养基为ms大量100ml/l、ms有机10ml/l、肌醇6ml/l、铁盐5ml/l、ms微量1ml/l、蔗糖30g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.1-0.5mg/lnaa和0.1-0.5mg/ltdz，倒入培养皿中待用；6、生根培养当胚状体上小植株3-5叶片时，切下植株放入生根培养基上，再生培养基光照16h/黑暗8h，27℃培养21-28天。选择根系生长健壮的植株移栽到小花盆中，用塑料袋包裹保湿，2周后去掉塑料袋，将植株移入大花盆中，小花盆中的基质为土、腐植质、有机肥按照质量比为1:1:1进行混合。生根培养基为ms大量50ml/l、ms有机5ml/l、肌醇3ml/l、铁盐2.5ml/l、ms微量0.5ml/l、蔗糖15g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.1-0.5mg/lnaa和0.2-1.0mg/lccc，倒入三角瓶中待用。本实施例中的诱导培养基为ms基础盐的基础上，对不同浓度的6ba naa和tdz naa激素组合进行筛选，如表6和表7所示，结论为0.2mg/ltdz 0.2mg/lnaa组合的亚麻下胚轴诱导率最高。表66ba naa组合浓度筛选6ba浓度naa浓度亚麻下胚轴诱导率(％)0.5mg/l0.1mg/l10％0.5mg/l0.2mg/l7％0.5mg/l0.5mg/l0％1.0mg/l0.1mg/l15％1.0mg/l0.2mg/l12％1.0mg/l0.5mg/l0％表7tdz naa组合浓度筛选tdz浓度naa浓度亚麻下胚轴诱导率(％)0.1mg/l0.1mg/l16％0.1mg/l0.2mg/l13％0.1mg/l0.5mg/l0％0.2mg/l0.1mg/l34％0.2mg/l0.2mg/l45％0.2mg/l0.5mg/l28％0.5mg/l0.1mg/l7％0.5mg/l0.2mg/l0％0.5mg/l0.5mg/l0％本实施例中的生根培养基为ms基础盐的基础上，对不同浓度的naa ccc激素组合进行筛选，结论为0.2mg/lnaa 0.5mg/lccc组合的亚麻再生苗的生根最好。表8naa和ccc组合浓度筛选显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)培养亚麻轮选3号种子获得下胚轴；
(2)采用基因枪法将含亚麻雄性不育表达的载体轰击至亚麻轮选3号下胚轴中，得到枪击后下胚轴；
(3)将所述枪击后幼胚接种至诱导培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织；
(4)将所述胚性愈伤组织接种至选择培养基中进行培养，得到抗性愈伤组织；
(5)将所述抗性愈伤接种至再生培养基中进行培养，得到幼苗；
(6)将所述幼苗在生根培养基中培养，得到亚麻轮选3号转基因植株。
2.根据权利要求1所述的一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，其特征在于，在步骤(1)中，亚麻轮选3号种子用体积分数为70％的酒精表面消毒40s-1min，无菌水冲洗3次后，用质量体积分数为0.1％的hgcl2消毒6min，无菌水冲洗4次，然后在超净工作台中放入种子培养基的三角瓶，黑暗条件23℃培养5-7天后，选择健壮的下胚轴切成1cm。
3.根据权利要求1所述的一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，其特征在于，在步骤(2)中：
(2-1)在轰击前，亚麻轮选3号下胚轴在诱导培养基培养3天后转入直径6cm的培养皿中，23℃预培养4天；
(2-2)质粒dna包裹的方法为：取出50μl的金粉甘油混合物，加入5μl亚麻雄性不育基因表达载体、50μl的浓度为2.5mcacl2和20μl的浓度为0.1m亚精胺，一边加一边震荡混匀；加140μl的70％酒精，震荡2分钟，静止1分钟，去上清；加140μl的100％酒精，震荡2分钟，静止1分钟，去上清；加60μl的100％乙醇，用枪吸打混匀后取8μl100％乙醇置于微粒载膜中央，并平铺，凉至完全干燥后用于轰击亚麻下胚轴组织，其中金粉甘油混合物为3mg金粉加50μl甘油；含有目的基因的亚麻雄性不育基因的表达载体ms-f为part27重组载体；
(2-3)将基因枪置于基因枪用样品架上，然后轰击亚麻下胚轴组织，轰击参数为：1100psi氦气压力，27inhg真空度，6cm射击距离，亚麻下胚轴需轰击2次。
4.根据权利要求3所述的一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，其特征在于，所述基因枪用样品架，包括真空室(1)和位于真空室(1)顶部的基因枪固定筒(2)，所述真空室(1)的内壁底部通过支架固定连接有支撑组件(9)，所述支撑组件(9)的底部连通有抽气管(10)，所述支撑组件(9)通过抽气管(10)连通有真空罐(12)，所述真空室(1)的内壁顶部设置有进气环(4)，所述进气环(4)的顶部连通有进气管(6)；所述支撑组件(9)包括上支撑筒(18)和下支撑筒(19)，所述下支撑筒(19)的顶端设置有第一微孔板(20)，所述下支撑筒(19)的侧壁设置有外螺纹，所述上支撑筒(18)的内壁设置有内螺纹，所述上支撑筒(18)的底端和下支撑筒(19)的上端通过内螺纹和外螺纹螺纹连接，且所述上支撑筒(18)的底端压紧第一微孔板(20)的顶部，所述上支撑筒(18)的内壁上部固定连接有支撑横杆(21)，所述上支撑筒(18)的内壁顶部开设有卡槽(22)，所述下支撑筒(19)的底部固定连接有缓冲皮膜(25)；所述下支撑筒(19)的底部通过支架与真空室(1)的内壁底部固定连接，所述缓冲皮膜(25)底部中间与抽气管(10)连通并通过抽气管(10)与真空罐(12)连通，所述抽气管(10)的中部设置有第二调速阀(11)。
5.根据权利要求4所述的一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，其特征在于，所述卡槽(22)内卡接有固定环(23)，所述固定环(23)的底部固定连接有第二微孔板(24)，所述第二微孔板(24)的底部搭接在支撑横杆(21)的顶部，所述第一微孔板(20)的直径大于第二微孔板(24)的直径，所述第一微孔板(20)表面的微孔内径小于第二微孔板(24)表面的微孔内径。
6.根据权利要求4所述的一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，其特征在于，所述进气环(4)的内壁中部设置有过滤板(16)，所述进气环(4)的底部沿其周向均匀开设有排气孔(17)，所述进气环(4)的顶部连通有进气管(6)，所述进气管(6)的中部设置有第一调速阀(5)，所述进气环(4)的顶部与真空室(1)的内壁顶部固定连接；所述真空室(1)的正面设置有密封门(8)，所述真空室(1)的顶部连通有第一负压表(3)，所述真空罐(12)的顶部连通有第二负压表(13)；所述真空罐(12)的侧面连通有第二真空泵(15)，所述真空室(1)的背面分别连通有第一真空泵(14)和单向排气阀(7)；所述真空室(1)的正面设置有控制器(26)，所述控制器(26)通过导线分别与真空室(1)连通的第一负压表(3)、与真空罐(12)连通的第二负压表(13)、第一真空泵(14)、第二真空泵(15)、抽气管(10)中部的第二调速阀(11)和进气管(6)中部的第一调速阀(5)电性连接。
7.根据权利要求2所述的一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，其特征在于，
在步骤(3)中，轰击后的下胚轴在诱导培养基，23℃白光照16h/黑暗8h培养4天，得到胚性愈伤组织；
在步骤(4)中，下胚轴表面有愈伤突起时再转移至选择培养基上进行选择，以后每7天转移1次，27℃白光16h/黑暗8h培养14-21天，选择能够正常生长的愈伤组织，经3～4次选择后，抗除草剂的愈伤组织转入诱导培养基上诱导胚状体的形成，得到抗性愈伤组织；
在步骤(5)中，27℃，光照周期为白光16h/黑暗8h条件下培养21-28天，将发育好的胚状体转移再生培养基上萌发生长，得到幼苗；
在步骤(6)中，当幼苗有3-5叶片时，切下植株放入装有生根培养基的三角瓶，23℃，光照周期为白光16h/黑暗8h条件下培养14-21天，选择根系生长健壮的植株移栽到小花盆中，用塑料袋包裹保湿，2周后去掉塑料袋，将植株移入大花盆中，小花盆中的基质为土、腐植质、有机肥按照质量比为1:1:1进行混合。
8.根据权利要求2所述的一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，其特征在于，
种子培养基为ms大量50ml/l、ms有机5ml/l、肌醇5ml/l、铁盐2.5ml/l、ms微量0.5ml/l、蔗糖15g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中倒入三角瓶中待用；
诱导培养基为ms大量100ml/l、ms有机10ml/l、肌醇6ml/l、铁盐5ml/l、ms微量1ml/l、蔗糖30g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.1-0.5mg/lnaa和0.1-0.5mg/ltdz，倒入培养皿中待用；
再生培养基为ms大量100ml/l、ms有机10ml/l、肌醇6ml/l、铁盐5ml/l、ms微量1ml/l、蔗糖30g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.1-0.5mg/lnaa和0.1-0.5mg/ltdz，倒入培养皿中待用；
选择培养基为ms大量100ml/l、ms有机10ml/l、肌醇6ml/l、铁盐5ml/l、ms微量1ml/l、蔗糖30g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.1-0.5mg/lnaa、0.1-0.5mg/ltdz和41％的草甘膦6ml/l，倒入培养皿中待用；
生根培养基为ms大量50ml/l、ms有机5ml/l、肌醇3ml/l、铁盐2.5ml/l、ms微量0.5ml/l、蔗糖15g/l，调节ph至5.8，琼脂7g/l，高压灭菌，待温度降至55℃左右，在超级工作台中加入0.1-0.5mg/lnaa和0.2-1.0mg/lccc，倒入三角瓶中待用。
9.根据权利要求8所述的一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，其特征在于，诱导培养基、再生培养基、选择培养基中加入0.2mg/lnaa和0.2mg/ltdz；生根培养基中，加入0.2mg/lnaa和0.5mg/lccc。
10.根据权利要求8所述的一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，其特征在于，
ms大量为ms大量基础盐，ms大量基础盐由溶剂水和溶质组成，所述溶质为硝酸钾、硝酸铵、七水合硫酸镁、磷酸二氢钾和二水合氯化钙或无水氯化钙，其中硝酸钾加入量为19g/l、硝酸铵的加入量为16.5g/l，七水合硫酸镁的加入量为3.7g/l、磷酸二氢钾的加入量为1.7g/l，二水合氯化钙或无水氯化钙的加入量为4.4g/l或3.32g/l；
ms有机为ms有机基础盐，ms有机基础盐由溶剂水和溶质组成，所述溶质为盐酸硫胺素vb1、盐酸吡哆醇vb6、烟酸和谷氨酸；盐酸硫胺素vb1加入量为1.00g/l、盐酸吡哆醇vb1加入量为0.50g/l、烟酸加入量为0.50g/l和谷氨酸加入量为2.00g/l；
ms微量为ms微量基础盐，ms微量基础盐由溶剂水和溶质组成：所述溶质为水合硫酸锰、七水合硫酸锌、硼酸、碘化钾、二水合钼酸钠、无水合硫酸铜、六水合氯化钴；水合硫酸锰的加入量为22.3g/l、七水合硫酸锌的加入量为8.60g/l、硼酸的加入量为6.20g/l、碘化钾的加入量为0.83g/l、二水合钼酸钠的加入量为0.25g/l、无水合硫酸铜的加入量为0.025g/l、六水合氯化钴的加入量为0.025g/l；
肌醇为ms肌醇基础盐，ms肌醇基础盐由溶剂水和溶质组成，所述溶质为肌醇，肌醇的加入量为10.00g/l；
铁盐为ms铁盐基础盐，ms铁盐基础盐由溶剂水和溶质组成：所述溶质为七水合硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠，七水合硫酸亚铁的加入量为5.57g/l、乙二胺四乙酸二钠的加入量为7.45g/l。
技术总结本发明公开一种基因枪介导的亚麻遗传转化方法，包括：培养亚麻轮选3号种子获得下胚轴；采用基因枪法将亚麻雄性不育表达载体轰击至亚麻轮选3号下胚轴中；将所述枪击后幼胚接种至愈伤诱导培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织；将所述胚性愈伤组织接种至选择培养基中进行培养；将所述抗性愈伤接种至再生培养基中进行培养，得到幼苗；将所述幼苗在生根培养基中培养，得到亚麻轮选3号转基因植株。本发明通过大量元素、微量元素、有机物及激素的优化组合，开发出一种适用于亚麻轮选3号组织培养的再生体系，并通过基因枪介导的方式实现该品种的稳定转化。
技术研发人员：伊六喜;史树德;张晓明;刘坤;斯钦巴特尔;赵小庆;包文泉;侯建华;王树彦;李志伟;苏少锋
受保护的技术使用者：内蒙古农业大学
技术研发日：2020.11.30
技术公布日：2021.03.12
