本发明属于基因编辑，具体地，本发明涉及靶向hla-i类分子的通用型car-t细胞及其应用。
背景技术：
人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,hla)又称为组织相容性复合体，是机体免疫系统区分“自我”与“非我”的主要标志。hla可分为i、ii、iii三大类，其中，hla-i类分子表达在几乎所有有核细胞的细胞膜表面，hla-ii类分子主要表达在抗原递呈细胞如树突状细胞、巨噬细胞和b细胞表面。在同种异体移植过程中，hla-i类分子是引起移植排斥反应的主要抗原。在临床应用中，hla配型是进行器官或骨髓造血干细胞移植手术的必需工作，全相合或半相合移植，配合免疫抑制药物的使用，能够大幅度移植成功率。然而，由于hla分子的多基因特性及其高度的序列多态性，要获得匹配的移植器官需要进行大规模的筛选工作，耗时耗力，严重制约了供者器官或细胞的来源。而目前的各种方案都无法从根本上实现简易可行的抑制移植排斥。
因此，本领域急需一种针对hla-i类分子的通用型的cart细胞的改造方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种针对hla-i类分子的通用型的cart细胞的改造方法。
本发明的第一方面，提供了一种用于制备通用型car-t细胞的试剂，所述试剂包括：
(i)靶向i类人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen-i,hla-i)的sgrna或用于表达所述sgrna的表达载体，所述sgrna为选自下组的一种或多种核苷酸序列：
(a1)靶向α链的hla-a转座子的sgrna：hla1-sgrna1～hla1-sgrna250；
(a2)靶向α链的hla-b转座子的sgrna：hla1-sgrna251～hla1-sgrna481；
(a3)靶向α链的hla-c转座子的sgrna：hla1-sgrna482～hla1-sgrna726；
(a4)靶向α链的hla-e转座子的sgrna：hla1-sgrna727～hla1-sgrna956；
(a5)靶向α链的hla-f转座子的sgrna：hla1-sgrna957～hla1-sgrna1226；
(a6)靶向α链的hla-g转座子的sgrna：hla1-sgrna1227～hla1-sgrna1447；以及
(ii)无或表达cas9蛋白或表达cas9蛋白的表达盒。
在另一优选例中，所述的靶向hla-i的α链的sgrna包括1、2、3、4、5或6种sgrna。
在另一优选例中，所述的sgrna包括靶向hla-i的α链的sgrna和/或靶向hla-i的b2m的sgrna。
在另一优选例中，所述的hla-i的α链的sgrna包括靶向靶向hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、和/或hla-g转座子的sgrna。
在另一优选例中，所述靶向hla-i的α链的sgrna包括含有识别区序列为选自如seqidno.:1-250、seqidno.:251-481、seqidno.:482-726、seqidno.:727-956、seqidno.:957-1226、和seqidno.:1227-1447中任一所示的核苷酸序列的sgrna。
在另一优选例中，所述各sgrna包括含有其对应识别区序列的核苷酸，例如，hla1-sgrna1包括含有如seqidno.:1所示序列的核苷酸。
在另一优选例中，所述各sgrna的序列包括各sgrna识别区序列和相应的全长sgrna序列。
在另一优选例中，所述各sgrna的序列包括选自下组的序列：(1)sgrna识别区序列；或(2)相应的全长sgrna序列。
在另一优选例中，所述的各sgrna的识别区序列如表1所示。
在另一优选例中，所述的靶向hla1的α链的sgrna还包括与所述识别区序列相连且位于3’端的附加序列。
在另一优选例中，所述附加序列如seqidno.:1448所示。
在另一优选例中，所述靶向hla1的α链基因的各sgrna为经过或未经过化学基团修饰的。
在另一优选例中，所述靶向hla1的α链基因来源于哺乳动物，较佳地，来源于小鼠、大鼠、或人。
本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
(i)第一容器以及位于所述第一容器内的第一表达载体，所述第一表达载体含有第一表达盒，所述第一表达盒用于表达所述靶向hla-i的α链的sgrna；
以及任选的
(ii)第二容器以及位于所述第二容器内的第二表达载体，所述第二表达载体含有第二表达盒，所述第二表达盒用于表达cas9蛋白的表达盒；
其中，所述靶向α链的sgrna,为靶向hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、和/或hla-g转座子的sgrna，所述sgrna核苷酸序列选自seqidno.:1-250、seqidno.:251-481、seqidno.:482-726、seqidno.:727-956、seqidno.:957-1226、和seqidno.:1227-1447中任一所示核苷酸序列。
在另一优选例中，所述第一表达盒还用于表达靶向hla-i的b2m的sgrna。
在另一优选例中，所述第一、和第二容器中任何一个为同一容器。
在另一优选例中，所述第一、和第二表达载体为独立的或相连的。
在另一优选例中，所述第一、和第二表达载体位于相同或不同的容器内。
在另一优选例中，所述第一、和第二表达盒位于相同或不同的载体上。
在另一优选例中，所述第一、和第二表达盒位于同一载体。
在另一优选例中，所述的载体选自下组：dna、rna、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。
在另一优选例中，所述表达载体为所述sgrna插入px458载体后得到的载体。
本发明的第三方面，提供了一种制备通用型car-t细胞的方法，所述方法包括：
(1)提供一待改造的car-t细胞；
(2)利用本发明第一方面所述的试剂改造所述car-t细胞，得到通用型car-t细胞；和
任选的(3)验证得到的car-t细胞为通用型car-t细胞。
在另一优选例中，所述待改造的car-t细胞来源于人和非人哺乳动物。
本发明的第四方面，提供了一种通用型car-t细胞，所述car-t细胞为利用本发明第一方面所述的试剂、本发明第二方面所述的试剂盒或本发明第三方面所述的方法制备的car-t细胞。
在另一优选例中，所述通用型car-t细胞为不表达或低表达hla1的α链基因的car-t细胞。
在另一优选例中，所述“低表达”指所述car-t细胞hla1的α链基因的表达量g1与正常car-t细胞hla1的α链基因的表达量g0的比值，即g1/g0≤0.5，较佳地g1/g0≤0.3，更佳地≤0.2，更佳地≤0.1，最佳地为0。
本发明的第五方面，提供了一种细胞制剂，所述细胞制剂含有本发明第四方面所述的通用型car-t细胞。
在另一优选例中，所述细胞制剂为液态制剂。
在另一优选例中，所述细胞制剂的剂型包括注射剂。
在另一优选例中，所述制剂中所述car-t细胞的浓度为1×104-1×1010个细胞/ml，较佳地1×105-1×109个细胞/ml。
本发明的第六方面，提供了本发明第一方面所述的试剂的用途，所述试剂用于(a)敲除hla-i的α链基因；和/或(b)制备通用型car-t细胞。
本发明的第七方面，提供了一种sgrna，所述sgrna选自下组中所述的任一核酸序列：
(a1)靶向α链的hla-a转座子的sgrna：hla1-sgrna1～hla1-sgrna250；
(a2)靶向α链的hla-b转座子的sgrna：hla1-sgrna251～hla1-sgrna481；
(a3)靶向α链的hla-c转座子的sgrna：hla1-sgrna482～hla1-sgrna726；
(a4)靶向α链的hla-e转座子的sgrna：hla1-sgrna727～hla1-sgrna956；
(a5)靶向α链的hla-f转座子的sgrna：hla1-sgrna957～hla1-sgrna1226；和/或
(a6)靶向α链的hla-g转座子的sgrna：hla1-sgrna1227～hla1-sgrna1447。
在另一优选例中，所述的靶向hla-i的α链的sgrna还包括与所述识别区序列相连且位于3’端的附加序列。
在另一优选例中，所述的靶向hla-i的α链的sgrna还包括位于所述识别区序列3’端的附加序列。
在另一优选例中，所述附加序列如seqidno.:1448所示。
本发明的第八方面，提供了一种载体，所述载体包含本发明第七方面所述的sgrna。
本发明的第九方面，提供了一种基因编辑系统，所述基因编辑系统包含本发明第七方面中所述的sgrna。
在另一优选例中，所述基因编辑系统为crispr/cas系统，优选地为crispr/cas9系统。
在另一优选例中，利用所述crispr/cas9系统进行基因失活编辑，获得的基因失活率≥70％，较佳地≥80％，更佳地≥90％。
本发明的第十方面，提供了一种car-t改造方案，所述car-t改造方案包含以下步骤：
(i)根据受者、供者hla的分型情况，确定hla-i类分子6个等位基因中需要基因编辑的的不匹配成员；和
(ii)根据步骤(i)所述的匹配结果，选择本发明第一方面所述的试剂中一种或多种，选择性地敲除供者细胞hla-i类分子，获得构建与受者全相合或半相合的cart产品。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1表示了hla-a2、hla-b的敲除效率。
图2表示了在cart细胞中，也分别实现了实现tcr与hla(hla-a2、hla-b)的双敲除。
图3显示了使用h1、h2、h3、h4单条序列编辑的car-t细胞，依然具备对靶细胞的高效杀伤水平。
图4显示了使用h1、h2、h3、h4两两组合序列编辑的car-t细胞，依然具备对靶细胞的高效杀伤水平。
图5显示了使用h1、h2、h3、h4及其组合制备的ucar-t细胞，增殖能力良好。
图6显示了使用h1、h2、h3、h4及其组合制备的ucar-t细胞对异体nk细胞的杀伤作用显示出优异的耐受能力。
图7显示了使用h1、h2、h3、h4及其组合制备的ucar-t细胞对异体t细胞的杀伤作用显示出优异的耐受能力。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现在通用型的cart细胞上，选择性敲除供者细胞hla-i类分子的改造方法。
在此基础上，发明人完成了本发明。
术语说明
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
人类白细胞抗原(hla)
人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,hla)又称为组织相容性复合体，是机体免疫系统区分“自我”与“非我”的主要标志。hla可分为i、ii、iii三大类，其中，hla-i类分子表达在几乎所有有核细胞的细胞膜表面，hla-ii类分子主要表达在抗原递呈细胞如树突状细胞、巨噬细胞和b细胞表面。在同种异体移植过程中，hla-i类分子是引起移植排斥反应的主要抗原。在临床应用中，hla配型是进行器官或骨髓造血干细胞移植手术的必需工作，全相合或半相合移植，配合免疫抑制药物的使用，能够大幅度移植成功率。
由于hla抗原，尤其是hla-i类分子抗原是介导同种异体移植排斥的主要免疫原，对移植细胞进行hla-i类分子的改造或敲除可降低移植后的免疫排斥效应。根据基因座不同，hla-i类分子可进一步分为hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g6个亚类，其中hla-a、hla-b、hla-c属于主要组织相容性复合体(高度多态性)，hla-e、hla-f、hla-g属于次要相容性复合体(序列较为保守)。所有的hla-i类分子均是由一条高多态性的α链和一条恒定的β链构成的异二聚体，β链又称为β微球蛋白(βmicroglobulin，b2m)。hla-i的α链和β链在细胞内部与抗原肽结合后被转运至细胞膜表面。hla-i的α链和β链二者缺一不可，否则会影响hla分子与抗原肽的组装及其在细胞膜表面的表达。
sgrna:单链向导核糖核苷酸
本文所述的“sgrna”，由两部分构成，其一为与基因组特异性位点发生互补结合的结构域，具体为附表中sgrna靶位点pam序列前端的20位核苷酸序列，与靶位点不同的是，sgrna中此部分序列的胸腺嘧啶t必须被尿嘧啶u取代；其二为与cas9蛋白结合的共有基序，该段序列为：
guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu(seqidno.:1448)。
具体实例：假如某sgrna靶位点序列为：cgactggccagggcgcctgtcgg，其中cgg为ngg的pam序列，pam前20位核苷酸序列为cgactggccagggcgcctgt，将该序列中的t改成u，则为cgacuggccagggcgccugu，将此序列与固有序列相接，则sgrna全序列是：
cgacuggccagggcgccuguguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu。
需要指出的是，在实际实施过程中，我们对sgrna进行了化学修饰，具体修饰为：5‘端前3位核苷酸和3’端倒数第2、3、4位核苷酸都进行了硫代和2位甲氧基(2-ome-modified)修饰，分别以*和斜体加粗表示，因此，最终的sgrna序列为：
c*g*a*cuggccagggcgccuguguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu*u*u*u。
本案例中，除非加以特别说明，所有的靶位点转换为完整的sgrna序列全部遵循如上规则，sgrna均使用化学合成法进行制备。所有sgrna信息如下表1-6所示：
表1
表2
表3
表4
表5
表6
需注意，
以表1中的序列为例。
本发明的sgrna序列由两部分组成，前一部分是表1示出的具体的序列(即对应sgrna的靶向序列)，后一部分是相同的共有基序(seqidno.:1448)。
以表1中的seqidno:1为例，seqidno.:1的序列全长为“ccagucacagacugaccgaguggguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu”，该序列正是由表1中的对应sgrna的靶向序列与共有基序(seqidno.:1448)组成。
因此，seqidno.:1－1447都是由表1－表6中的各自的对应sgrna的靶向序列与共有基序(seqidno.:1448)两部分组成。
sgrna的筛选方法
本文所述sgrna的筛选方法，采用荧光素酶报告系统来对设计的sgrna切割活性进行筛选。实施过程中，puca(luc)是sgrna的报告基因质粒，其中的luc(luciferase)基因内部含有终止密码子和crispr/cas9的靶位点序列。终止密码子和靶位点序列两端为luciferase的互补重复序列(“er”)。终止密码子导致luc的翻译提前终止，表达无功能的荧光素酶(”lucifer”)。核酸酶对靶位点的切割会引发基于ssa(singlestrandannealing)的dna修复机制，互补序列(“er”)通过重组而形成了完整的荧光素酶编码序列，从而表达有功能的荧光素酶。荧光素酶的活性与crispr/cas9的活性成正相关。precutpuca(luc)是平末端线性化的puca(luc)质粒。平末端pcr产物可以不经过酶切而直接连入载体中。克隆位点两端含有测序引物m13f和m13r，外侧为截短的荧光素酶编码序列“lucifer”和“erase”。
本发明的技术方案包含以下的有益效果：
1.本发明提供了一种靶向具体hla座位子的hla-i类分子改造方案，通过设计特异的向导rna序列，选择性地敲除异体cart细胞中的hla-i类分子的转座子，在降低宿主t细胞免疫排异的同时，又能降低大规模hla基因敲除带来的潜在风险。
2.一种通用型的cart细胞，这种cart细胞来源于健康供者，经过体外的基因转导使之表达嵌合抗原受体分子car(靶向cd19、bcma、psma等)，随后通过基因编辑的方式特异地敲除其hla-a和hla-b分子，同时保留hla-c、hla-e、hla-f、hla-g的表达，构建免疫原性降低的、可在异体间使用的通用型cart产品。这是我们重点保护的应用。又或者，根据受者、供者hla的分型情况，选择性地敲除供者细胞hla-i类分子6个等位基因中的不匹配成员，构建与受者全相合或半相合的cart产品。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1sgrna设计
基于hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、hla-g基因组序列，在全外显子范围内使用美国broadinstitute在线设计工具gppsgrnadesigner(https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design)进行sgrna序列设计，选择“crisprko”、“spyocas9ngg”以及“humangrch38”控件，生成序列表格中所有符合要求的sgrna序列，依据优先级选取每个基因的前10位作为优选序列。
实施例2电转人原代t细胞
1.仪器与材料：
①lonza4d-nucleofectortmsystem细胞核转仪
②试剂盒为p3primarycell4d-nucleofectortmxkit，lonza,v4xp-3024
③制备好的处于激活状态的car-t细胞
④商品化cas9蛋白(放置冰上)(
⑤各靶点的sgrna(放置冰上)。
2.具体操作步骤(适用于100μl规格的电转杯)：
(1)按照82μlsolution 18μlsupplement/每个电转杯，按电转总数，配置一个电转液mix，混匀，放室温。
(2)孵育cas9蛋白和总的sgrna(按照cas9：总的sgrna＝25ug:10ug为最优)，孵育体系为：
cas9(10ug/ul):2μl
10×cas9buffer:1μl
总sgrna10ug:xμl
rnasefree水补加至10μl
(3)电转之前细胞计数，每个电转杯细胞数控制在1-5×106。
(4)13000rpm/min,室温离心3min，收集cart细胞，用pbs(预热)洗两遍，用之前配置好的电转液mix温和重悬细胞。
(5)分别向每个孵育cas9蛋白和总的sgrna的ep管以及空白对照组中加100ul,吹匀之后，转至对应的电转杯中，注意不要产生气泡影响电转效率。
(6)电转之前将加有完全培养基的细胞培养板放进培养箱中预热。
(7)打开电转仪，将电转杯放入槽孔，选择相应程序(stimulatedhumantcell)，启动电转。
(8)电转之后，快速将细胞转入细胞培养板中，放入培养箱中培养。
(9)如有需要，24h之后，将cas9蛋白和总的sgrna的用量减半或1/4用量以同等条件进行二次电转。
(10)将上述细胞放置培养箱中扩增5天，流式检测tcr/hla敲除效率，必要时用磁珠负选法富集单敲和双敲阴性细胞。
实施例3流式细胞术检测敲除效率
按照以下检测方法，分别验证hla-a2、hla-b的敲除效率：
①电转第5天取样检测，每组电转细胞取适量细胞悬液(约1*106个细胞)以及对照组t细胞(用于设置blank组和control组)，放于1.5mlep管中，1000rpm离心5min。
②弃上清，向每个ep管中加入1mlfacsstainingbuffer(含2％fbs的pbs)，1000rpm离心5min，重复洗涤1次。
③100μlstainingbuffer重悬细胞沉淀，加入0.8ulpe-antihumanhla-a2(200ug/ml)抗体，轻轻漩涡振荡混匀，4℃孵育40min。
④每个ep管中加入1mlfacsstainingbuffer，1000rpm离心5min，重复洗涤2次。
⑤每个ep管中加入100μlfacsstainingbuffer重悬细胞沉淀，按照1:200比例加入alexafluortm488goatanti-rabbitlgg(h l)(2mg/ml)，4℃避光孵育30min。
⑥每个ep管中加入1mlfacsstainingbuffer，1000rpm离心5min，重复洗涤2次
⑦200-300μlfacsstainingbuffer重悬细胞，流式仪cytoflex进行上机分析
⑧用流式分析软件cytexpert分析结果。
结果：如图1所示,hla-a2、hla-b的敲除效率分别为43.3％和54.42％,成功实现敲除。而如图2所示，在cart细胞中，也分别实现了实现tcr与hla(hla-a2、hla-b)的双敲除。
实施例4优化靶定序列的筛选
4.1靶位点测序&puca(luc)-target质粒构建
(1)以欲打靶的细胞系或动物的基因组为模板，利用高保真dna聚合酶扩增靶位点序列，取一部分进行测序验证，另一部分留作克隆用。
(2)在上一步骤获得的pcr产物，琼脂糖凝胶电泳，回收。
(3)将pcr产物与precutpuca(luc)质粒连接，以fermentas的t4dnaligase(el0011)为例，体系如下：
4.2pcs(puro)-target质粒构建
(1)合成sgrnaoligo。
(2)将oligo用纯水溶解，终浓度为100μm。
(3)退火。两条互补oligo各取15μl混合，并放入沸水浴煮5min后自然降温至室温，约2小时。
(4)连接。将precutpcs(puro)载体与annealedoligo按以下反应体系进行连接反应。以fermentas的t4dnaligase为例。
室温连接30min后，取5μl转化至50μl感受态细菌中，培养板(氨苄青霉素)培养过夜。
(5)从过夜培养的板中，挑取2个克隆，接种于2～4ml培养液(氨苄青霉素)，摇床培养过夜。
(6)摇菌培养过夜后，提取质粒，并测序验证(引物u6)。
4.3转染hek293t细胞
使用试剂盒中选配的hek293t细胞系。转染参数如下：
一般设置n＝3孔/组。puca-target质粒20ng/孔，pcs(puro)质粒80ng/孔，即质量比为1:4(ng:ng)。con组用无关质粒补齐至100ng/孔。
(1)消化hek293t细胞，按照3×104cell/孔接种96孔板。
(2)24小时后，观察各孔细胞状态。
(3)为保证数据的准确性和实验的可重复性，用无菌水稀释质粒，将各组质粒浓度稀释至一致，或保证各组之间的质粒样品体积相同。
(4)向1.5mlep管中加入opti-mem或dmem(无血清，无抗生素)。
(5)将dna质粒加入到第(4)步的ep管中，混匀。
(6)将lipofect1.0加入到上一步的ep管中，混匀，室温静置10分钟。
(7)将转染混合液加到96孔板中。轻轻敲击96孔板以混匀。
(8)37℃，5％co2，培养24h后检测荧光素酶活性。
4.4荧光素酶活性检测
从转染的96孔板中吸取50μl上清至黑色不透明96孔板中。配制luc反应液，避光保存。
使用96孔发光仪(promegaglomax-multi detectionsystem)检测：
参数设置如下：luc反应液体积50μl/孔
delaytime1s
integrationtime1s
4.5数据分析：计算每组的平均值。将con组作为数值1，计算出各组的relativeluciferaseactivity。一般阳性对照pc组数值至少可达到con组的10倍。根据本领域技术人员的公知，当sgrna活性高于pc组50％时，其活性时，其活性基本满足因打靶实验。当靶位点范围内的多条sgrna活性均低于pc组的50％时，可能由于靶位点序列的特殊性导致，但只要实验组的数值显著高于con组数值，则仍可判断sgrna是具有活性的。
实施例5效果验证
实验过程：
1、细胞增殖比较实验
(1)从健康志愿者捐献外周血中用人淋巴细胞分离液分离出pbmc。
(2)利用美天旎人cd4和cd8磁珠分选出tcell。
(3)调整细胞密度为1x106cell/ml，接种于75cm3培养瓶中，随后加入cd3和cd28复合物，按照1:100比例加入激活培养基，混匀培养。
(4)刺激48h后，取样使用nc200计数仪计数，将细胞分成三组，起始量为2*10^6,一组为tcellblank,另外两组感染cd19慢病毒。
(5)感染48h换液，其中一组利用不同sgrna做电转实验制备cd19-ucart细胞，另外一组作为普通cd19-cart细胞。
(6)培养过程中，使用相同的培养基以及培养密度，分别在不同天数同取样计数。
2、不同电转组cd19细胞与普通cd19cart细胞杀伤比较实验
(1)制备不同sgrna与tcr联用制备的cd19-electedcart细胞作为效应细胞，靶细胞为raji-luciferas细胞。
(2)分别对靶细胞和效应细胞计数，1000rpm离心5min，加对应体积培养基重悬，使细胞密度为：靶细胞：2x10^5个/ml效应细胞(e:t＝10:1)：2x10^6个/ml。
(3)将效应细胞按照相应的效靶比稀释相应倍数，效靶比分别为为：10：1，5：1，2：1，1：1，1：2组。
(4)取96孔板，按照如下表格设计实验，每孔体系均为100ul，将靶细胞和效应细胞按照每孔50ul铺在板内，不足100ul的孔用培养基补足至100ul。
(5)将96孔板混匀，并加样孔的周围加pbs一圈，放置培养箱培养。
(6)培养20h左右，转移细胞悬液至白板中，注意不要有气泡，每孔中加入30ulluciferase(20×)底物,避光混匀，用酶标仪读值。
3、异体nk和t细胞共孵育杀伤实验
(1)从细胞库中复苏异体pbmc细胞以及ucar-t细胞，b2m-/-t细胞，静置培养24h，待细胞状态恢复后进行共培养实验。
(2)使用humannkcellisolationkit(miltenyi)试剂盒和humantcellisolationkit(miltenyi)试剂盒将异体pbmc中的nk细胞和t进行分选培养，具体方法参照试剂盒说明书。
(3)靶细胞辐照：对三种靶细胞野生型t细胞，ucar-t细胞，b2m-/-t细胞进行辐照，终止靶细胞自身扩增。
(4)将靶细胞用pbs洗涤制备成5～10*106/ml的单细胞悬液。
(5)将nk细胞或t细胞进行离心收集，计数，制备成1*106/ml的细胞悬液。
(6)将异体nk细胞或t细胞与三种靶细胞即野生型t细胞，ucar-t细胞，b2m-/-t细胞，按照相应的效靶比进行混合铺板培养。
(7)每孔细胞混合均匀，6h或72h后，取少量细胞进行流式和ldh分析，评价细胞杀伤水平。
(8)杀伤水平计算公式：杀伤率＝(实验组-对照组 培养基)/(完全裂解对照组-本底对照组)x100％。在实验过程中，优选了4条序列，命名为h1、h2、h3、h4，依次对应seqidno.:9、seqidno.:2、seqidno.:258和seqidno.:252，通过实验发现：h1、h2、h3、h4之间相互组合，可以对供体t细胞中的hla-a、hla-b进行高效地敲除/编辑(图1和图2)，将经过h1、h2、h3、h4序列及其任意组合编辑过的car-t细胞称为ucar-t。
实验结果显示，经过编辑的cart细胞其靶细胞杀伤能力、增殖能力并未受影响(图3、图4、图5)，最重要的是，经过编辑的细胞，即ucar-t细胞，在逃避异体自然杀伤细胞(nk细胞)(图6)和t细胞的杀伤功能方面显示出明显的优势，符合异体通用型cart制备的要求(图7)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
1.一种用于制备通用型car-t细胞的试剂，所述试剂包括：
(i)靶向i类人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen-i,hla-i)的sgrna或用于表达所述sgrna的表达载体，所述sgrna为选自下组的一种或多种核苷酸序列：
(a1)靶向α链的hla-a转座子的sgrna：hla1-sgrna1～hla1-sgrna250；
(a2)靶向α链的hla-b转座子的sgrna：hla1-sgrna251～hla1-sgrna481；
(a3)靶向α链的hla-c转座子的sgrna：hla1-sgrna482～hla1-sgrna726；
(a4)靶向α链的hla-e转座子的sgrna：hla1-sgrna727～hla1-sgrna956；
(a5)靶向α链的hla-f转座子的sgrna：hla1-sgrna957～hla1-sgrna1226；
(a6)靶向α链的hla-g转座子的sgrna：hla1-sgrna1227～hla1-sgrna1447；以及
(ii)无或表达cas9蛋白或表达cas9蛋白的表达盒。
2.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有：
(i)第一容器以及位于所述第一容器内的第一表达载体，所述第一表达载体含有第一表达盒，所述第一表达盒用于表达所述靶向hla-i的α链的sgrna；
以及任选的
(ii)第二容器以及位于所述第二容器内的第二表达载体，所述第二表达载体含有第二表达盒，所述第二表达盒用于表达cas9蛋白的表达盒；
其中，所述靶向α链的sgrna,为靶向hla-a、hla-b、hla-c、hla-e、hla-f、和/或hla-g转座子的sgrna，所述sgrna核苷酸序列选自seqidno.:1-250、seqidno.:251-481、seqidno.:482-726、seqidno.:727-956、seqidno.:957-1226、和seqidno.:1227-1447中任一所示核苷酸序列。
3.一种制备通用型car-t细胞的方法，所述方法包括：
(1)提供一待改造的car-t细胞；
(2)利用如权利要求1所述的试剂改造所述car-t细胞，得到通用型car-t细胞；
以及任选的
(3)验证得到的car-t细胞为通用型car-t细胞。
4.一种通用型car-t细胞，所述car-t细胞为利用如权利要求1所述的试剂、如权利要求2所述的试剂盒、或如权利要求3所述的方法制备的car-t细胞。
5.一种细胞制剂，所述细胞制剂含有如权利要求4所述的通用型car-t细胞。
6.一种如权利要求1所述的试剂的用途，所述试剂用于(a)敲除hla-i的α链基因；和/或(b)制备通用型car-t细胞。
7.一种sgrna，所述sgrna选自下组中所述的任一核酸序列：
(1)靶向α链的hla-a转座子的sgrna：hla1-sgrna1～hla1-sgrna250；
(2)靶向α链的hla-b转座子的sgrna：hla1-sgrna251～hla1-sgrna481；
(3)靶向α链的hla-c转座子的sgrna：hla1-sgrna482～hla1-sgrna726；
(4)靶向α链的hla-e转座子的sgrna：hla1-sgrna727～hla1-sgrna956；
(5)靶向α链的hla-f转座子的sgrna：hla1-sgrna957～hla1-sgrna1226；和/或
(6)靶向α链的hla-g转座子的sgrna：hla1-sgrna1227～hla1-sgrna1447。
8.一种载体，所述载体包含如权利要求7所述的sgrna。
9.一种基因编辑系统，所述基因编辑系统包含如权利要求7中所述的sgrna。
10.一种car-t改造方案，所述car-t改造方案包含以下步骤：
(i)根据受者、供者hla的分型情况，确定hla-i类分子6个等位基因中需要基因编辑的的不匹配成员；和
(ii)根据步骤(i)所述的匹配结果，选择如权利要求1所述的试剂中一种或多种，选择性地敲除供者细胞hla-i类分子，获得构建与受者全相合或半相合的car-t产品。
技术总结