本发明属于生物制药技术领域，涉及一种贝美前列素中间体的生物催化合成方法。
背景技术：
贝美前列素(bimatoprost)是allergan公司研发的一种的前列腺素脂肪酸酰胺的类似物，在2001年fda批准用于治疗青光眼，具有很好的降眼压效果和安全性。后来经过验证发现还具有增长睫毛和治疗男性秃发的功效，于2008年被fda批准可用于增长睫毛。
贝美前列素报道的较多的合成路线主要有如下几步反应，例如，us2005209337中公开的合成路线，其中的羰基手性还原通过化学法制备，大量使用有机溶剂，对环境不友好，手性纯度低。
技术实现要素：
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种贝美前列素中间体的生物催化合成方法。
本发明的技术方案如下：
一种贝美前列素中间体的酶催化合成方法，它包括以下步骤：
(1)在氮气保护下，将草酰氯和二氯甲烷的混合溶液降温至-75～-65℃，加入二甲基亚砜和化合物v搅拌反应1.5～3h后，再加入三乙胺升温至-55～-45℃进行反应，待反应完全后，加入磷酸二氢钠进行淬灭反应，制备化合物iv；
(2)在氮气保护下，将(2-氧代-4-苯基丁基)磷酸二甲酯、氯化锂溶于乙腈中，将得到的混合液降温至-10～0℃，依次加入n,n-二异丙基乙胺和化合物iv进行化学反应，制备化合物iii；
(3)将化合物iii溶于甲醇中，与碳酸钾在20～25℃进行化学反应，制备化合物ii；
(4)以化合物ii为底物，在酮羰基还原酶丙酮粉、辅酶/辅酶循环氢供体nadp /nadph、辅酶循环酶、助溶剂和缓冲液的存在下，于20～30℃生物催化反应生成化合物i，
其中，酮羰基还原酶丙酮粉是由geotrichumcandidumapg5菌体经发酵培养，离心收集菌体后，与丙酮在-25～-15℃的条件下混合制成。本发明提交的geotrichumcandidumapg5菌体由菌株菌种库采购，菌种库编号：geotrichumcandidumnbrc5767；
具体合成路线如下：
在一种优选方案中，在步骤(1)中，化合物v与草酰氯的摩尔比为1:1.1～1.6，优选为1:1.4。
进一步地，化合物v与二甲基亚砜的摩尔比为1:3.5～4.5，优选为1:3.8。
进一步地，化合物v与三乙胺的质量体积比为1:2.0～3.0g/ml，优选为1:2.5g/ml。
在一种更优选方案中，在步骤(1)中，在氮气保护下，将草酰氯和二氯甲烷的混合溶液降温至-75～-65℃，加入二甲基亚砜(dmso)搅拌反应1h，再缓慢滴加含化合物v的二氯甲烷溶液继续搅拌反应1h后，再加入三乙胺升温至-50℃进行反应，待反应完全后，加入10％磷酸二氢钠水溶液进行淬灭反应，分液后，经氯化钠溶液洗涤、干燥后，得到含化合物iv的二氯甲烷溶液，可以直接用于下一步骤中。
对于本发明而言，在步骤(2)中，(2-氧代-4-苯基丁基)磷酸二甲酯、氯化锂与n,n-二异丙基乙胺、化合物iv的摩尔比为1:2.0～3.0:1.2～1.8:0.9-1.0，优选为1:2.7:1.5:0.96。
在一种优选方案中，在步骤(2)中，在氮气保护下，将(2-氧代-4-苯基丁基)磷酸二甲酯、氯化锂溶于乙腈中，将得到的混合液降温至-10～0℃，滴加n,n-二异丙基乙胺(dipea)搅拌均匀后，于-10～-5℃滴加上述步骤(1)中制备的含化合物iv的二氯甲烷溶液进行化学反应，待反应完全后，经氯化钠溶液洗涤、干燥后，得到化合物iii。
在步骤(3)中，在制备化合物ii的过程时，化合物iii与碳酸钾的摩尔比为1:0.7～1.2，优选为1:0.9。
在一种优选方案中，在步骤(3)中，将化合物iii溶于甲醇中，与碳酸钾在20～25℃进行化学反应，待反应完成后，加入盐酸调节溶液的ph至6，经甲基叔丁醚萃取后，加入甲磺酸搅拌45min左右，再以饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥后，得到化合物ii。
对于本发明而言，在步骤(4)中，以化合物ii为底物，经酶催化合成制备贝美前列素中间体化合物i时，化合物ii与酮羰基还原酶丙酮粉的质量比为1:0.1～1，优选为1:0.6。
进一步地，助溶剂为异丙醇，甲醇或乙醇，优选为异丙醇。其中，化合物ii与助溶剂的质量体积比为1:5～15g/ml，优选为1:10g/ml。
进一步地，在步骤(4)中，辅酶循环酶为葡糖脱氢酶或异丙醇脱氢酶，优选为异丙醇脱氢酶。其中，酮羰基还原酶丙酮粉与辅酶循环酶为葡糖脱的质量比为2.5～3.5:1，优选为3:1。
在步骤(4)中，所选用的缓冲液可以但不局限于mes缓冲液、pb缓冲液或tris-hcl缓冲液。然而，在实际使用过程中，选择不同的缓冲液，对缓冲液的浓度和ph需要严格控制。对于mes缓冲液而言，该缓冲液的浓度为0.1mm，ph为6.0～6.5。对于pb缓冲液而言，该缓冲液的浓度为0.1mm，ph为7.0。对于tris-hcl缓冲液而言，该缓冲液的浓度为0.1mm，ph为8.0。
进一步地，酮羰基还原酶丙酮粉与缓冲液的质量体积比为10～20:1mg/ml，优选为15:1mg/ml。
在一种优选方案中，在步骤(4)中，geotrichumcandidumapg5菌体经发酵培养，离心收集菌体后，与丙酮在-20℃的条件下混合，干燥后制备酮羰基还原酶丙酮粉时，发酵培养的过程为：将geotrichumcandidumapg5菌体接种于培养基中活化培养，在30℃的条件下以130rpm的速度搅拌培养24h小时。
在一种优选方案中，离心收集的湿菌体与丙酮在-20℃的条件下混合时，湿菌体与丙酮的质量体积比为1:7.5～9.5g/ml；优选为1:8.3g/ml。
其中，培养基含有以下组分：甘油30g/l、酵母提取物10g/l、蛋白胨5g/l、磷酸二氢钾11.18g/l和磷酸氢二钾3.12g/l。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明以化合物v为原料，经两步化学反应制备中间产物化合物iii，在反应过程中，避免使用有致突变危害的试剂tempo，优化了反应条件，降低了副产物生成，收率和纯度高。然后，将化合物ⅲ脱去羟基保护得到底物化合物ii，经酶催化反应制备目标产物，增加了底物的水溶性，提高了生物酶催化率。在酶催化反应的过程中，以酮羰基还原酶丙酮粉替代活细胞，具有酶粉保存周期长，操作简单方便，反应条件温和，酶粉用量小，产率高，光学纯度高，更适合工业化生产。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的中间体的生物催化合成方法作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。
实施例1
反应瓶中，氮气保护下依次加入草酰氯(8.0ml，0.08mol)和二氯甲烷(160ml)，冷却至-75～-65℃，滴加dmso(16.0ml，0.22mol)，保持温度-75～-65℃搅拌1h后缓缓滴加化合物ⅴ(16.0g，58mmol)的二氯甲烷溶液(140ml)，继续搅拌1h后，缓慢滴加三乙胺(40ml)，滴毕后升温至-50℃反应2h，监控至原料反应完全后，用10％磷酸二氢钠水溶液(200ml)淬灭反应，搅拌后分液，有机相用饱和氯化钠溶液(100ml×3)洗涤，经无水硫酸钠干燥后过滤，得化合物ⅵ的二氯甲烷溶液备用(其中，化合物ⅵ的纯度为98.5％，收率为92.7％,现做现用)。
实施例2
反应瓶中，在氮气保护下依次加入氯化锂(8.6g，0.25mol)、(2-氧代-4-苯基丁基)磷酸二甲酯(24.0g，0.094mol)和乙腈(170ml)，降温至-10～0℃，滴加dipea(25ml，0.14mol)，搅拌均匀后，于-10～-5℃滴加上述实施例1中制备的化合物ⅵ的二氯甲烷溶液(500ml，0.09mol)，约0.5h加完，反应约2-3h，监控至反应完全后，用饱和氯化钠溶液(160ml×3)洗涤，经无水硫酸钠干燥后过滤，滤液旋干得淡黄色固体，加入石油醚(30ml)，打浆过滤，得白色粉末化合物ⅲ(23.5g，纯度为94.8％，收率为95.2％)。
实施例3
反应瓶中依次加化合物ⅲ(20.8g，51.2mmol)、甲醇(200ml)，待搅拌溶清后，加入碳酸钾粉末(6.4g，44.8mmol)，控制温度为20-25℃，反应约3.5h，监控至反应完全。向得到的反应液中加1mol/l盐酸(约75ml)调节混合溶液的ph至6，再加入水(120ml)，用甲基叔丁醚(320ml×4)萃取，合并有机相，加入甲磺酸(960l)搅拌45min，依次用饱和碳酸氢钠溶液(320ml×2)和饱和氯化钠溶液(320ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥后过滤，滤液减压蒸干得无色油状物化合物ⅱ(16.5g，纯度为98.5％，收率为96.4％)。
实施例4
步骤1：羰基还原酶湿菌体获得
geotrichumcandidumapg5菌体的发酵培养(菌株菌种库采购，菌种库编号：geotrichumcandidumnbrc5767)：
培养基配备：将甘油(30g)、酵母提取物(10g)、蛋白胨(5g)、磷酸二氢钾(11.18g)和磷酸氢二钾(3.12g)与水混合，并用水将体积调节为1.0l。将所得溶液的一部分(30毫升)置于100毫升试管中，其余的置于2l锥形烧瓶中，烧瓶上盖有硅胶盖并进行高温121℃灭菌20min。
发酵培养：1)将geotrichumcandidumapg5菌体接种于上述试管中活化培养，条件为：在30℃的条件下以130rpm搅拌24h；2)将试管中得到的菌体转移到烧瓶中，并在30℃的条件下以130rpm搅拌24h。12000rpm低温高速离心获得细胞(18g湿重(湿重))。
步骤2：酮羰基还原酶丙酮粉制备
酮羰基还原酶丙酮粉的制备：将上述发酵培养得到的geotrichumcandidumapg5细胞(18g湿菌体)与冷丙酮(-20℃，150ml)混合，过滤收集细胞。将收集得到的细胞减压干燥5次，获得干细胞(3.8g)，无需进一步纯化即可使用。
实施例5：化合物i的制备
于250ml反应器中，加入40mlmes缓冲液(0.1mm，ph6)，依次溶解600mg酮羰基还原酶丙酮粉，200mg异丙醇脱氢酶酶粉，15mgnadp /nadph。将1g底物化合物ii溶于10ml异丙醇中，再加入反应器中，300rpm搅拌，于25℃下反应24h，得到化合物i。反应结果经hplc检测，转化率75.8％，ee值99.6％。
实施例6：化合物i的制备
于250ml反应器中，加入40mlmes缓冲液(0.1mm，ph6.5)，依次溶解600mg酮羰基还原酶丙酮粉，200mg异丙醇脱氢酶酶粉，15mgnadp /nadph。将1g底物化合物ii溶于10ml异丙醇中，再加入反应器中，300rpm搅拌，于25℃下反应24h，得到化合物i。反应结果经hplc检测，转化率89.8％，ee值99.5％。
实施例7：化合物i的制备
于250ml反应器中，加入40mlpb缓冲液(0.1mm，ph7.0)，依次溶解600mg酮羰基还原酶丙酮粉，200mg异丙醇脱氢酶酶粉，15mgnadp /nadph。将1g底物化合物ii溶于10ml异丙醇中，再加入反应器中，300rpm搅拌，于25℃下反应24h，得到化合物i。反应结果经hplc检测，转化率91.3％，ee值99.6％。
实施例8化合物i的制备
于250ml反应瓶中，加入40mltris-hcl缓冲液(0.1mm，ph8.0)，依次溶解600mg酮羰基还原酶丙酮粉，200mg异丙醇脱氢酶酶粉，15mgnadp /nadph。将1g底物化合物ii溶于10ml异丙醇中，再加入反应器中，300rpm搅拌，于25℃下反应24h，得到化合物i。反应结果经hplc检测，转化率83.3％，ee值99.5％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
1.一种贝美前列素中间体的酶催化合成方法，其特征在于，它包括以下步骤：
(1)在氮气保护下，将草酰氯和二氯甲烷的混合溶液降温至-75～-65℃，加入二甲基亚砜和化合物v搅拌反应1.5～3h后，再加入三乙胺升温至-55～-45℃进行反应，待反应完全后，加入磷酸二氢钠进行淬灭反应，制备化合物iv；
(2)在氮气保护下，将(2-氧代-4-苯基丁基)磷酸二甲酯、氯化锂溶于乙腈中，将得到的混合液降温至-10～0℃，依次加入n,n-二异丙基乙胺和化合物iv进行化学反应，制备化合物iii；
(3)将化合物iii溶于甲醇中，与碳酸钾在20～25℃进行化学反应，制备化合物ii；
(4)以化合物ii为底物，在酮羰基还原酶丙酮粉、辅酶/辅酶循环氢供体nadp /nadph、辅酶循环酶、助溶剂和缓冲液的存在下，于20～30℃生物催化反应生成化合物i，
所述酮羰基还原酶丙酮粉是由geotrichumcandidumapg5菌体经发酵培养，离心收集菌体后，与丙酮在-25～-15℃的条件下混合制成，其中，geotrichumcandidumapg5菌体由菌株菌种库采购，菌种库编号：geotrichumcandidumnbrc5767；
具体合成路线如下：
2.根据权利要求1所述的贝美前列素中间体的酶催化合成方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述化合物v与草酰氯的摩尔比为1:1.1～1.6，优选为1:1.4；化合物v与二甲基亚砜的摩尔比为1:3.5～4.5，优选为1:3.8；化合物v与三乙胺的质量体积比为1:2.0～3.0g/ml，优选为1:2.5g/ml。
3.根据权利要求1所述的贝美前列素中间体的酶催化合成方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述(2-氧代-4-苯基丁基)磷酸二甲酯、氯化锂、n,n-二异丙基乙胺与化合物iv的摩尔比为1:2.0～3.0:1.2～1.8:0.9-1.0，优选为1:2.7:1.5:0.96。
4.根据权利要求1所述的贝美前列素中间体的酶催化合成方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述化合物iii与碳酸钾的摩尔比为1:0.7～1.2，优选为1:0.9。
5.根据权利要求1所述的贝美前列素中间体的酶催化合成方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述化合物ii与酮羰基还原酶丙酮粉的质量比为1:0.1～1，优选为1:0.6。
6.根据权利要求1所述的贝美前列素中间体的酶催化合成方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述助溶剂为异丙醇，甲醇或乙醇，优选为异丙醇；所述化合物ii与助溶剂的质量体积比为1:5～15g/ml，优选为1:10g/ml。
7.根据权利要求1所述的贝美前列素中间体的酶催化合成方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述辅酶循环酶为葡糖脱氢酶或异丙醇脱氢酶；所述酮羰基还原酶丙酮粉与辅酶循环酶为葡糖脱的质量比为2.5～3.5:1，优选为3:1。
8.根据权利要求1所述的贝美前列素中间体的酶催化合成方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述缓冲液为mes缓冲液、pb缓冲液或tris-hcl缓冲液，所述mes缓冲液的浓度为0.1mm，ph为6.0～6.5；所述pb缓冲液的浓度为0.1mm，ph为7.0；所述tris-hcl缓冲液的浓度为0.1mm，ph为8.0。
9.根据权利要求8所述的贝美前列素中间体的酶催化合成方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述酮羰基还原酶丙酮粉与缓冲液的质量体积比为10～20:1mg/ml，优选为15:1mg/ml。
10.根据权利要求1所述的贝美前列素中间体的酶催化合成方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述发酵培养的过程为：将geotrichumcandidumapg5菌体接种于培养基中活化培养，在30℃的条件下以130rpm的速度搅拌培养24h小时；所述培养基含有以下组分：甘油30g/l、酵母提取物10g/l、蛋白胨5g/l、磷酸二氢钾11.18g/l和磷酸氢二钾3.12g/l。
技术总结