本发明涉及一种制备用于抑制α-淀粉酶和葡萄糖苷酶活性的抑制剂的方法，属于天然产物化学领域。
背景技术：
：α-淀粉酶/葡萄糖苷酶都参与膳食碳水化合物的分解，增加葡萄糖的吸收，从而引起血糖水平升高。餐后高血糖可能会增加ⅱ型糖尿病和后续并发症的风险。控制由此产生的高血糖的策略之一是抑制碳水化合物水解酶：α-淀粉酶/葡萄糖苷酶。阿卡波糖和一些药物可以有效抑制α-淀粉酶/葡萄糖苷酶活性，但同时也会引起肠胃气胀、腹泻、腹部和肝脏疾病等不良副作用。近年来，绿原酸等天然产物被发现是α-淀粉酶/葡萄糖苷酶抑制剂的一个很有前景的来源。同时因为绿原酸具有抗氧化特性，能够减少与糖尿病并发症相关的氧化损伤，考虑到绿原酸的低毒性或无毒性，它可以作为具有抑制α-淀粉酶/葡萄糖苷酶活性的功能性食品成分进行开发。然而，由于绿原酸多酚羟基的分子结构，存在脂溶性差、生物利用度低、生理环境下不稳定和体内吸收缓慢等问题。基于这些问题，通过保留其活性基团而使其改性的分子修饰，成为近年来绿原酸研究的热点之一。有关改善绿原酸脂溶性分子修饰的方法主要有化学法和酶法。化学法在催化绿原酸酰化反应过程中往往会用到吡啶、三乙胺等有毒难以去除的有机碱，反应区域选择性差，产物转化率低，且抑制活性也不高。技术实现要素：为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明提供了一种高抑制α-淀粉酶/葡萄糖苷酶活性的绿原酸衍生物抑制剂合成方法。此绿原酸衍生物合成方法具有高的区域选择性，较高的转化率，产物分离纯化更为简单。相比较化学法具有显著的优势，符合绿色化学的要求，在功能性食品领域具有很大的应用前景。本发明脂肪酶催化合成反应具有较高的区域选择性，使用不同的酰基供体，能生成同一位点的绿原酸衍生物，使得反应产物单一，能简单有效的制备出目标产物。此外酶促反应还具有反应条件温和、副产物少等优点。酶催化反应在有机介质中可以提高非极性物质的溶解度，加快反应速度，促使反应平衡向生成亲脂性物质的方向移动。且有机溶剂易挥发，容易去除，更有助于绿原酸酰化反应的分离和纯化。但不同有机溶剂对夺取脂肪酶周围所必需水的情况不同，对脂肪酶结构和活性中心位点产生的影响也不同，使得绿原酸酰化反应的转化率和区域选择性受到影响。本发明的第一个目的是提供一种制备α-淀粉酶或葡萄糖苷酶抑制剂的方法，所述方法是将绿原酸与月桂酸乙烯酯在有机溶剂体系中经脂肪酶催化，发生月桂酰化反应，生成绿原酸月桂酰化衍生物，即得α-淀粉酶或葡萄糖苷酶抑制剂。在本发明的一种实施方式中，所述有机溶剂包括如下任意一种或多种：甲基叔丁基醚、2-甲基-2-丁醇；优选甲基叔丁基醚。在本发明的一种实施方式中，所述绿原酸相对有机溶剂的浓度为10-15mg/ml。在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶为脂肪酶lipozymerm。在本发明的一种实施方式中，所述绿原酸与月桂酸乙烯酯在脂肪酶的催化作用下在40-55℃反应。在本发明的一种实施方式中，所述绿原酸与月桂酸乙烯酯的摩尔比为1:5～1:12。在本发明的一种实施方式中，所述脂肪酶的添加量为10-15u/g绿原酸。在本发明的一种实施方式中，所述反应条件下，将绿原酸和月桂酸乙烯酯反应24-72小时；优选72h，绿原酸的转化率达到75％以上。在本发明的一种实施方式中，所述反应是在300-500rpm搅拌条件下进行反应。优选400-500rpm。在本发明的一种实施方式中，所述月桂酰化反应过程为：在本发明的一种实施方式中，所述反应具有很高的区域选择性，产物为4-o-月桂酰化绿原酸。在本发明的一种实施方式中，所述方法还包括：反应结束后，离心、收集上清液，然后去除溶剂、干燥，即得α-淀粉酶或葡萄糖苷酶抑制剂。本发明的有益效果：本发明反应条件温和，反应介质易去除，区域选择性好，反应步骤简单可控，副产物少，产品分离相对简单，反应转化率高(达到75％以上)等优点。活性差异方面，相比较于绿原酸和其他碳链修饰绿原酸衍生物，4-o-月桂酰化绿原酸对α-淀粉酶/葡萄糖苷酶具有更高的抑制活性。从而提供了一种对α-淀粉酶/葡萄糖苷酶具有高抑制活性的绿原酸衍生物合成方法。附图说明图1产物质谱图图2不同溶剂体系对绿原酸转化率的效果比对图。图3不同脂肪酶对绿原酸转化率的效果比对图。图4绿原酸及其衍生物对α-淀粉酶的抑制效果图。图5绿原酸及其衍生物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果图。具体实施方式实施例1在反应瓶中加入100mg绿原酸、1ml月桂酸乙烯酯和10ml甲基叔丁基醚，脂肪酶的添加量为1.2u，在40℃，400rpm条件下反应，反应72小时后，离心去除固定化酶，旋转蒸发去除溶剂，真空干燥后得到绿原酸衍生物产品，绿原酸转化率分别为76.05％，经质谱、核磁鉴定该产物为4-o-月桂酰化绿原酸。产物质谱谱图如图1，发现了信号峰为535的分子离子峰[m-h]-，与绿原酸分子相差一个月桂酰基(181)。为了确认单酰化产物的取代位点，我们进一步进行了核磁分析。实施例2在反应瓶中加入100mg绿原酸、1.5ml月桂酸乙烯酯和10ml甲基叔丁基醚，脂肪酶的添加量为1.0u，在50℃，400rpm条件下反应，反应72小时后，离心去除固定化酶，旋转蒸发去除溶剂，真空干燥后得到绿原酸衍生物产品，绿原酸转化率分别为82.05％，经质谱、核磁鉴定该产物为4-o-月桂酰化绿原酸。实施例3在反应瓶中加入100mg绿原酸、1.2ml月桂酸乙烯酯和10ml甲基叔丁基醚，脂肪酶的添加量为1.5u，在45℃，400rpm条件下反应，反应72小时后，离心去除固定化酶，旋转蒸发去除溶剂，真空干燥后得到绿原酸衍生物产品，绿原酸转化率分别为85.05％，经质谱、核磁鉴定该产物为4-o-月桂酰化绿原酸。实施例4探究溶剂选择对制备绿原酸衍生物抑制剂的影响参照实施例1，仅将溶剂替换为其他溶剂：在反应瓶中加入100mg绿原酸、1.2ml月桂酸乙烯酯，脂肪酶的添加量为1.2u，分别加入石油醚、正己烷、异辛烷、甲基叔丁基醚、2-甲基-2-丁醇(叔戊醇)、2-甲基-2-丙醇(叔丁醇)、异丙醇、丙酮、乙腈、甲醇、1,4-二氧六环各10ml，在50℃，400rpm条件下反应，考察不同溶剂体系对绿原酸转化率的影响，结果如图1和表1。表1不同溶剂体系下绿原酸的转化率结果溶剂转化率(反应24h)转化率(反应48h)石油醚未反应未反应正己烷未反应未反应异辛烷未反应未反应甲基叔丁基醚18.88％27.22％2-甲基-2-丁醇(叔戊醇)10.24％18.57％2-甲基-2-丙醇(叔丁醇)5.21％5.25％异丙醇未反应未反应丙酮2.57％4.96％乙腈未反应未反应甲醇未反应未反应1,4-二氧六环2.45％4.87％结果发现：在甲基叔丁基醚中反应24h和48h绿原酸的转化率分别为18.88％和27.22％，高于其他溶剂体系，同时考虑到甲基叔丁基醚的毒性低，熔点低，容易去除，因此我们选择甲基叔丁基醚作为反应的溶剂体系。实施例5探究脂肪酶选择对制备绿原酸衍生物抑制剂的影响在反应瓶中加入100mg绿原酸、1.2ml月桂酸乙烯酯和10ml甲基叔丁基醚，脂肪酶的添加量为1.2u，脂肪酶分别为lipaseay“amano”30sd、lipaseay“amano”400sd、lipasedf“amano”15、newlasef、lipaseg“amano”50、lipasemer“amano”、novozym435、lipozymerm和lipozymetlim，在50℃，400rpm条件下反应，考察不同脂肪酶对绿原酸转化率的影响，结果如图2和表2。表2不同脂肪酶催化下绿原酸的转化率结果可见，lipozymerm得到的转化率最高，反应24h和48h的转化率分别为17.84％和24.75％。因此选择lipozymerm作为脂肪酶催化剂。实施例6探究不同酰基供体制得绿原酸衍生物抑制剂的α-淀粉酶的抑制效果影响在反应瓶中加入100mg绿原酸和10ml甲基叔丁基醚，脂肪酶lipozymerm的添加量为1.2u，按照绿原酸与酰基供体的摩尔比为1:10依次加入不同的酰基供体(乙酸乙烯酯、丁酸乙烯酯、己酸乙烯酯、辛酸乙烯酯)，在50℃，400rpm条件下反应72小时，得到乙酰化绿原酸，丁酰化绿原酸，己酰化绿原酸，辛酰化绿原酸。在5ml离心管中加入100μlα-胰淀粉酶，加入不同浓度的绿原酸衍生物样品溶液(100、200、300、400、500μmol/l)100μl，在37℃下加热10min。然后在加入300μl的淀粉溶液(0.5％)，在37℃下反应15min。再加入100μl的dns(二硝基水杨酸)显色剂，并在沸水浴中加热10min，然后立即冷却，终止反应，然后使用缓冲液稀释反应混合物至2ml，使用紫外分光光度计在540nm出测吸光值，同时使用阿卡波糖做阳性对照。抑制率％＝(a空白－(a样品－a背景))×100％/a空白其中：a空白：α-淀粉酶 淀粉 dns显色剂；a样品：α-淀粉酶 不同浓度的样品 淀粉 dns显色剂；a背景：α-淀粉酶 不同浓度的样品 淀粉。具体抑制活性结果件表3、表4和图3。表3不同酰基供体所得抑制剂对α-淀粉酶的活性抑制结果(12.5mmol/l)表4不同酰基供体所得抑制剂对α-淀粉酶的ic50结果结果显示：选用月桂酰化绿原酸对α-淀粉酶的抑制效果优于绿原酸和其他绿原酸衍生物，其ic50值从大到小依次为：绿原酸>乙酰化绿原酸>丁酰化绿原酸>己酰化绿原酸>辛酰化绿原酸>阿卡波糖>月桂酰化绿原酸。实施例7探究不同酰基供体制得绿原酸衍生物抑制剂的α-葡萄糖苷酶的抑制效果影响在离心管中加入α-葡萄糖苷酶溶液100μl(0.25u/ml)和不同浓度的绿原酸衍生物溶液(100、200、300、400、500μmol/l)100μl，混合均匀，然后加入底物对硝基苯-α-d-葡萄糖苷(pnpg，100μl)，在37℃下反应30min，然后添加1mol/l的na2co3溶液(100μl)终止反应，稀释一定倍数后，在405nm处测定吸光度。同时使用阿卡波糖做阳性对照。抑制率％＝(a空白－(a样品－a背景))×100％/a空白其中：a空白：α-葡萄糖苷酶 底物pnpg；a样品：α-葡萄糖苷酶 不同浓度的样品 底物pnpg；a背景：α-葡萄糖苷酶 不同浓度的样品。具体抑制活性结果件表5、表6和图4。表5不同酰基供体所得抑制剂对α-葡萄糖苷酶的活性抑制结果(12.5mmol/l)表6不同酰基供体所得抑制剂对α-葡萄糖苷酶的ic50结果结果显示：选用月桂酰化绿原酸对α-葡萄糖苷酶的抑制效果优于绿原酸和其他绿原酸衍生物，其ic50值从大到小依次为：乙酰化绿原酸>丁酰化绿原酸>己酰化绿原酸>绿原酸>阿卡波糖>辛酰化绿原酸>月桂酰化绿原酸。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种制备α-淀粉酶或葡萄糖苷酶抑制剂的方法，其特征在于，所述方法是将绿原酸与月桂酸乙烯酯在有机溶剂体系中经脂肪酶催化，发生月桂酰化反应，生成绿原酸月桂酰化衍生物，即得α-淀粉酶或葡萄糖苷酶抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述月桂酰化反应的反应式为：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶为脂肪酶lipozymerm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述绿原酸与月桂酸乙烯酯的摩尔比为1:5～1:12。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪酶的添加量为10-15u/g绿原酸。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为甲基叔丁基醚、2-甲基-2-丁醇一种或者两种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述绿原酸相对有机溶剂的浓度为10-15mg/ml。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的反应温度为40-55℃。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应的反应时间为24-72h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应是在300-500rpm搅拌条件下进行。
技术总结本发明公开了一种制备用于抑制α‑淀粉酶和葡萄糖苷酶活性的抑制剂的方法，属于天然产物化学领域。本发明的方法在特定溶剂体系中，将绿原酸与月桂酸乙烯酯在脂肪酶催化作用下，进行月桂酰化反应，反应结束后离心去除固定化脂肪酶，收集上清液经过浓缩、真空干燥后，得到具有高抑制α‑淀粉酶/葡萄糖苷酶活性抑制剂绿原酸衍生物4‑O‑月桂酰化绿原酸本发明的方法条件温和，反应转化率高，区域选择性好，产物容易分离，所得抑制剂相较于绿原酸和其他碳链修饰绿原酸衍生物具有更高的抑制活性。
技术研发人员：朱松;王闪;李玥
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：2020.12.04
技术公布日：2021.03.12
