本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种连续换液发酵制备柠檬酸的方法。
背景技术：
柠檬酸，亦称枸橼酸，是一种重要的三羧基有机酸产品，目前市售产品主要是无水柠檬酸和一水柠檬酸，主要用于食品和饮料行业的酸味剂、调味剂、防腐剂以及保鲜剂，有“第一食用酸味剂”之称。柠檬酸是黑曲霉溢出代谢(overflowmetabolism)的产物，只能在发酵过程代谢通路不平衡的条件下才能大量积累。
当前，液体深层发酵是当今柠檬酸工业化生产的主流工艺。主要有以下几种发酵方法：
补料发酵。近些年柠檬酸发酵的补料工艺多有报道，但是大部分柠檬酸发酵企业依旧采用稳定的批次发酵工艺，而生产强度更高的补料发酵因工人要求高，目前的报道多为实验室水平。
半连续换液发酵。该方法操作简单，可延长产酸期，提高生产强度，但要求换液操作时间短，一次性彻底换液(更新培养基)，易对菌体活力产生较大影响。
固定发酵。cn107022541a公开了一种黑曲霉的固定化方法，实现了黑曲霉发酵生产柠檬酸的连续发酵，把经过预处理的纤维材料作为固定化介质，将黑曲霉活化后装有固定培养基的发酵容器中培养，使菌株在培养过程中吸附于纤维材料上。另外，通过该方法将菌体重复利用，一次性换液补加新鲜培养基，发酵600h，重复培养8个循环，节省制种周期，但菌丝体固定化处理会增加额外成本和周期。
由此可见，现有的发酵方法存在：补料发酵对工人的要求高，半连续换液发酵换液操作时间短以及更新培养基对菌体活力产生影响，固定发酵成本高周期长的缺陷。
因此，开发简单有效保持菌体活力的连续发酵方式才是当下实现成本可控、保持稳定培养的最直接手段。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有发酵方法存在的上述各种缺陷问题，提供了一种连续换液发酵制备柠檬酸的方法。该方法能够延长发酵周期，以及提高柠檬酸累积速率。
为了实现上述目的，本发明提供了一种连续换液发酵制备柠檬酸的方法，其中，该方法包括：
(i)将发酵罐1中的发酵液经泵2泵送至膜过滤系统3中通过过滤膜进行分离；
(ii)将透过所述过滤膜的发酵清液a收集，并将未透过所述过滤膜的含有菌球的液体b返回至所述发酵罐1中；
(iii)将新鲜发酵培养基连续喂给至所述发酵罐1中，且所述新鲜发酵培养基的喂给速率等于所述发酵清液a的收集速率；以及
(iv)将所述发酵清液a进行提取制备柠檬酸。
通过上述技术方案，本发明通过采用发酵罐-膜过滤系统耦联装置，在采用黑曲霉深层清液发酵生产柠檬酸过程中，通过无菌膜过滤闭路循环系统，使发酵清液透过并排出，同步补加新鲜发酵培养基，实现连续换液培养，且能够在全程无菌状态下进行，降低产物抑制，保持菌体活力，发酵周期延长至84-100h，柠檬酸累积速率达到0.81-1.32g/(l·h)。
附图说明
图1是本发明的发酵罐-膜过滤系统耦联制备柠檬酸的装置以及方法的示意图。
附图标记说明
1、发酵罐2、泵3、膜过滤系统
a、发酵清液b、含有菌球的液体c、发酵培养基
m、搅拌装置
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种连续换液发酵制备柠檬酸的方法，其中，该方法包括：
(i)将发酵罐1中的发酵液经泵2泵送至膜过滤系统3中通过过滤膜进行分离；
(ii)将透过所述过滤膜的发酵清液a收集，并将未透过所述过滤膜的含有菌球的液体b返回至所述发酵罐1中；
(iii)将新鲜发酵培养基连续喂给至所述发酵罐1中，且所述新鲜发酵培养基的喂给速率等于所述发酵清液a的收集速率；以及
(iv)将所述发酵清液a进行提取制备柠檬酸。
根据本发明，所述“连续换液”指的是连续补给新鲜发酵培养基。
根据本发明，在步骤(i)之前，将所述膜过滤系统3以及与所述膜过滤系统3连接的管道预先采用酒精、酸或碱进行冲洗浸泡，经冲洗浸泡后的膜过滤系统3以及与所述膜过滤系统3连通的管道能够与所述发酵罐1形成无菌膜过滤闭路循环系统；其中，当采用酒精进行冲洗浸泡时，所述酒精的浓度为75％以上，并用无菌纯化水冲洗管道至少两次，优选用浓度为75-90％的酒精，为了节约成本，更优选用浓度为75-80％的酒精；其中，当采用碱进行冲洗浸泡时，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾和氨水中的一种或多种，并用无菌纯化水冲洗管道，直至管道内的溶液的ph为中性；另外，所述碱的ph值为12-14；其中，当采用酸进行冲洗浸泡时，所述酸选自柠檬酸、磷酸和醋酸中的一种或多种，优选为柠檬酸，尤其是当采用磷酸和醋酸进行冲洗浸泡时，并用无菌纯化水冲洗管道，直至管道内的溶液的ph为中性，另外，需要特别说明的是，当采用柠檬酸浸泡时无需无菌水冲洗；其中，所述酸的ph值为2-4，优选地，ph为3。在本发明中，所述冲洗的次数没有具体限定，优选的情况下，所述浸泡的时间为4-8h，优选为5-7h，更优选为6h。
根据本发明，所述膜过滤系统3还包括振动装置，在本发明中，所述过滤膜设置在所述振动装置上；其中，所述振动装置没有具体限定，只要能够带动所述的过滤膜产生振动即可，优选情况下，所述振动装置为摇床，所述摇床可以通过商购获得，例如，该摇床购自上海智城分析仪器制造有限公司，型号为zwf-100。
根据本发明，所述振动装置的参数可以为：回旋式振幅为20-50mm，振动速度为150-250r/min；优选地，回旋式振幅为30-40mm，振动速度为180-220r/min；在本发明中，所述振动装置的振动方向与所述过滤膜中过滤流体的流动方向相垂直，能够增大发酵液流体的湍动程度，减轻所述过滤膜污染。
根据本发明，所述过滤膜采用的过滤方式为切向流过滤，即液体流动方向与过滤方向垂直，这样能够减缓过滤膜污染；在本发明中，将所述振动装置与所述过滤膜结合在一起，使得所述过滤膜的过滤方式与常规膜的过滤方式不同，采用常规膜过滤时，其中的流体湍动程度主要由流体流速决定。
根据本发明，所述过滤膜为超滤膜和/或微滤膜，优选情况下，所述过滤膜可以为卷式膜、管式膜和中空纤维膜中的一种或多种，其中，所述卷式膜为卷式超滤膜，所述管式膜为管式陶瓷膜。在本发明中，将所述过滤膜限定为超滤膜和/或微滤膜，能够保障工作运转正常，不能为纳滤膜，否则会发生堵塞现象。另外，在本发明中，根据不同规格的发酵体系，所选用的膜类型和膜面积不同。另外，所述过滤膜的材质可以为有机膜或者无机膜。在本发明中，所述过滤膜的截留分子量限定为1k-100kda，而柠檬酸的分子量为192.14da，这样，柠檬酸等小分子可以任意透过，以便能够更好地截留蛋白质等大分子，富集柠檬酸；其中，在本发明，需要说明的是，da是道尔顿，分子量的单位。在本发明中，所述过滤膜的截留分子量越小，截留的蛋白质和低聚寡糖越多，柠檬酸清液中的杂质越少；另外，在本发明中，柠檬酸清液的透过速率还与阻力有关，阻力越大，柠檬酸清液的透过速率越慢。
在本发明中，需要说明的是，截留分子量(mwco：molecularweightcutoff)，是使用分子量大小表示的超滤膜和/或微滤膜的截留性能，又称切割分子量。
根据本发明，所述过滤膜中过滤流体的压力不高于0.1mpa，优选为0.05-0.1mpa；在本发明中，将所述过滤膜中过滤流体的压力限定为上述范围之内，能够使得所述含有菌球的液体中的菌球的所受的机械损伤小，能够保持菌体相对活力，进而能在一定周期内维持产酸速率，延长产酸期。
根据本发明，相对于5l发酵体系，所述过滤膜的有效过滤面积为0.05-0.7m2。另外，在本发明中，所述卷式膜、管式膜和中空纤维膜均可以通过商购获得，例如，可以购自厦门三达膜环境技术股份有限公司厂家，型号为管式陶瓷膜sppm-c-10，也可以购自天津大川科技发展有限公司，型号为中空纤维超滤膜dc-4k。
根据本发明，所述新鲜发酵培养基的喂给管道的末端设置于所述发酵罐1的液面以上；所述泵2的吸入管道的末端设置于所述发酵罐1的液面以下，优选地，所述泵2的吸入管道的末端设置于所述发酵罐1的底部空气分布器与底层搅拌桨的中间区域，更优选设置于底部空气分布器与底层搅拌桨的中间区域的1/4至3/4处，最优选设置于底部空气分布器与底层搅拌桨的中间区域的1/2处，以确保新鲜发酵培养基在所述发酵罐1内停留时间最大，如图1所示。另外，在图1中，空气分布器没有标出。
根据本发明，所述发酵清液的膜面透过速率为0.005-5.0m/s，以及所述发酵清液的酸度为5-15g/dl，在本发明中，体积流速(m3/s)等于膜面透过速率(m/s)×膜面积(m2)；优选情况下，相对于5l发酵体系，所述发酵清液a的收集速率为1-10ml/min，酸度为8-12g/dl；在本发明中，所述发酵清液a即为富含柠檬酸的发酵清液。在本发明中，需要说明的是，所述发酵清液a即为经所述分离后透过所述膜过滤系统3的液体。
根据本发明，所述含有菌球的液体b的参数包括：菌球的平均粒径为100-200μm，另外，菌球松散度适中，无明显断菌丝。在本发明中，需要说明的是，所述含有菌球的液体b即为经所述分离后的浓缩的液体。
根据本发明，所述泵2为齿轮泵或者离心泵，采用泵驱动循环，其中，相对于5l发酵罐，所述发酵液经泵2泵送至膜过滤系统3中的体积流速为300-750ml/min，酸度为5-15g/dl，优选情况下，相对于5l发酵罐，所述发酵液经泵2泵送至膜过滤系统3中的体积流速为450-600ml/min，酸度为8-12g/dl。在本发明中，所述泵2可以通过商购获得，例如，可以购自保定兰格恒流泵有限公司，型号为wt3000-1ja。
根据本发明，所述发酵液可以通过下述方法制备得到：
(i-1)将孢子悬浮液预先经种子活化制成发酵种子液后置于所述发酵罐1中；
(i-2)将淀粉液化糖化后的产物与玉米浆、磷酸盐接触配制新鲜发酵培养基；
(i-3)将所述新鲜发酵培养基灭菌冷却后喂给至所述发酵罐1中，与所述发酵种子液接触进行发酵。
根据本发明，在步骤(i-1)中，转种过程均为无菌操作。另外，种子活化在种子罐中进行。
根据本发明，在步骤(i-3)中，所述发酵的条件可以包括：通气量为0.5-1.5vvm，搅拌转速为500-1000r/min，发酵时间为24-32h；优选情况下，通气量为0.8-1.2vvm，搅拌转速为600-900r/min，发酵时间为26-30h。另外，在本发明中，发酵罐中的通气量一般以vvm计，即，每分钟通气量与罐体实际料液体积的比值，volume/culturevolume/min(通气比)。
根据本发明，所述发酵种子液与所述新鲜发酵培养基的用量的体积比为1：(4-19)，优选为1：(9-14)，更优选为1:10。
根据本发明，新鲜麸曲经重悬制成孢子悬浮液，并经过1l种子罐活化过夜，制成发酵种子液。
根据本发明，将淀粉原料经液化、糖化后制得清液，然后加入玉米浆和磷酸盐配成发酵培养基，其中，以发酵培养基的总重量为基准，总糖含量可以为12-18重量％，优选为18重量％，玉米浆添加量为1-2重量％，优选为1/60(即，1.667重量％)；使得碳氮比为80：1，总磷含量控制在200-400ppm，优选为400ppm，发酵培养基灭菌冷却后按接种量10％接入所述发酵种子液，在所限定的通气量和搅拌条件下，适应期大约12h，发酵24-32h为快速产酸期，相应的单位时间产酸速率达到0.3-0.4g/(dl·h)。
根据本发明，本发明通过采用发酵罐-膜过滤系统耦联装置，在采用黑曲霉深层清液发酵生产柠檬酸过程中，通过无菌膜过滤闭路循环系统，优选情况下，膜过滤系统处于轴向振动状态，使发酵清液透过并排出，同步补加新鲜发酵培养基，实现连续换液培养，且能够在全程无菌状态下进行，降低产物抑制，保持菌体活力，延长产酸期。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，柠檬酸累积速率通过酸碱中和滴定方法测得；淀粉和玉米浆原料为吉林中粮榆树生化能源玉米淀粉厂牌号为食用玉米淀粉的市售品。
实施例1
本实施例在于说明采用图1所示的装置以及本发明的方法制备柠檬酸。
如图1所示的发酵罐-膜过滤系统耦联装置。
(i)在5l发酵罐1中发酵培养黑曲霉：新鲜麸曲经重悬制成孢子悬浮液，并经过1l种子罐活化过夜，制成发酵种子液，然后将该发酵种子液置于所述发酵罐1中。淀粉原料经液化、糖化后制得清液，以发酵培养基的总重量为基准，总糖含量为18％，然后与1.667重量％的玉米浆和磷酸盐配成新鲜发酵培养基，使得碳氮比为80:1，总磷含量为400ppm，所述新鲜发酵培养基灭菌冷却后按接种量10重量％接入所述发酵种子液(即，所述发酵种子液与所述新鲜发酵培养基的用量的体积比为1：9)，通气量1vvm，搅拌转速1000r/min，适应期大约12h，发酵32h为快速产酸期，相应的单位时间产酸速率达到0.4g/dl，32h开启无菌膜过滤闭路循环系统；
(ii)将膜过滤系统3以及与其连接管道预先用1g/l柠檬酸溶液(ph＝3)冲洗浸泡至少6h，然后，将发酵罐1中的发酵液经泵2泵送至膜过滤系统3中；其中，过滤膜为截留分子量为4kda的中空纤维膜，有效过滤面积1.0m2；其中，固定在回旋式振幅26mm、振动速度200r/min的摇床表面，所述摇床的振动方向与所述过滤膜中过滤流体的流动方向相垂直；所述发酵培养基的喂给管道的末端位于所述发酵罐1的液面以上设置；所述泵2的吸入管道的末端位于所述发酵罐1的底部空气分布器与底层搅拌桨的中间区域的1/2处设置；其中，齿轮泵驱动发酵液流动，最大流速750ml/min，发酵液酸度8.9g/dl，所述过滤膜中过滤流体的压力为0.1mpa，透过过滤膜的富含柠檬酸的发酵清液a的流速为0.3ml/min，清液中酸度为5.3g/dl，以及将含有菌球的液体b返回至所述发酵罐1中；
(iii)将新鲜发酵培养基连续喂给至所述发酵罐1中，且所述新鲜发酵培养基的喂给速率等于所述发酵清液a的收集速率；即，相对于5l发酵体系，所述发酵清液a的收集速率为10ml/min，酸度为8g/dl；以及
(iv)将所述发酵清液a提纯制备柠檬酸。
结果：发酵周期延长至96h，柠檬酸累积速率达到1.11g/(l·h)。
实施例2
本实施例在于说明采用图1所示的装置以及本发明的方法制备柠檬酸。
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：过滤膜为截留分子量为介于10k-40kda之间的管式陶瓷膜，陶瓷膜配有冷却控温夹套，有效过滤面积0.5m2；其中，固定在回旋式振幅22mm、振动速度150r/min的调速振荡设备表面。
结果：发酵周期延长至96h，柠檬酸累积速率达到1.03g/(l·h)。
实施例3
本实施例在于说明采用图1所示的装置以及本发明的方法制备柠檬酸。
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：过滤膜为截留分子量为介于6k-20kda之间的中空纤维膜，有效过滤面积1.0m2；其中，固定在回旋式振幅30mm、振动速度250r/min的摇床表面。
结果：发酵周期延长至100h，柠檬酸累积速率达到1.32g/(l·h)。
实施例4
本实施例在于说明采用图1所示的装置以及本发明的方法制备柠檬酸。
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：过滤膜为截留分子量为介于60k-100kda之间的管式陶瓷膜，陶瓷膜配有冷却控温夹套，有效过滤面积0.3m2。
结果：发酵周期延长至84h，柠檬酸累积速率达到0.92g/(l·h)。
实施例5
本实施例在于说明采用图1所示的装置以及本发明的方法制备柠檬酸。
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：过滤膜为截留分子量为介于1k-10kda之间的卷式超滤膜，有效过滤面积0.24m2。
结果：发酵周期延长至84h，柠檬酸累积速率达到1.21g/(l·h)。
实施例6
本实施例在于说明采用图1所示的装置以及本发明的方法制备柠檬酸。
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：将膜过滤系统3以及与其连接管道预先用0.1mol/l氢氧化钠冲洗浸泡6h，并用无菌纯化水冲洗至ph中性。
结果：发酵周期延长至90h，柠檬酸累积速率达到1.04g/(l·h)。
实施例7
本实施例在于说明采用图1所示的发酵罐-膜过滤系统耦联装置以及本发明的方法制备柠檬酸。
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：所述发酵种子液与所述新鲜发酵培养基的用量的体积比为1：19。
结果：发酵周期延长至96h，柠檬酸累积速率达到0.97g/(l·h)。
实施例8
本实施例在于说明采用图1所示的装置以及本发明的方法制备柠檬酸。
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于所述泵2的吸入管道的末端位于所述发酵罐1的底部空气分布器与底层搅拌桨的中间区域的1/4处设置；以及所述发酵培养基的喂给管道的末端距离所述发酵罐1的液位以上的1/4处设置。
结果：发酵周期延长至84h，柠檬酸累积速率达到0.81g/(l·h)。
实施例9
本实施例在于说明采用图1所示的装置以及本发明的方法制备柠檬酸。
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：所述发酵清液的收集速率为5ml/min，酸度为10g/dl。
结果：发酵周期延长至84h，柠檬酸累积速率达到0.88g/(l·h)。
实施例10
本实施例在于说明采用图1所示的装置以及本发明的方法制备柠檬酸。
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：将膜过滤系统3以及与其连接管道预先用75％酒精冲洗浸泡至少6h，并用无菌纯化水冲洗两次。
结果：发酵周期延长至90h，柠檬酸累积速率达到1.12g/(l·h)。
对比例1
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：没有采用本发明的图1所示的发酵罐-膜过滤系统耦联装置，而是采用现有技术中常规的板框过滤机。
结果：结果无法实现菌球的有效循环，结果发酵时间为60h，柠檬酸累积速率达到0.1g/(l·h)。
对比例2
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：所述过滤膜中过滤流体的压力为0.5mpa。
结果：因环境压力变化，菌球形成不均匀，菌球断菌丝较多，结果发酵时间为60h，柠檬酸累积速率达到0.52g/(l·h)。
对比例3
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：所述摇床的振动方向与所述过滤膜中过滤流体的流动方向平行设置。
结果：因菌球附着导致膜污染加重，产物透过性变差，结果发酵时间为60h，柠檬酸累积速率达到0.57g/(l·h)。
对比例4
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：所述新鲜发酵培养基的喂给速率不等于所述发酵清液的收集速率，即，所述新鲜发酵培养基的喂给速率高于所述发酵清液的收集速率。
结果：因限制性营养物质浓度过高，结果发酵时间为60h，柠檬酸累积速率达到0.67g/(l·h)。
对比例5
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：没有采用柠檬酸对膜过滤系统3以及与其连接管道预先冲洗浸泡。
结果：因外部循环管道未作无菌处理，引起乳酸菌等耐酸杂菌生长，乳酸含量偏高，结果发酵时间为60h，柠檬酸累积速率达到0.62g/(l·h)。
对比例6
按照与实施例1相同的方法制备柠檬酸，所不同之处在于：采用纳滤膜。
结果：因纳滤膜的孔隙小，易于堵塞，不能正常工作。
通过实施例1-10和对比例1-6的结果可以看出，本发明通过采用发酵罐-膜过滤系统耦联装置，在采用黑曲霉深层清液发酵生产柠檬酸过程中，通过无菌膜过滤闭路循环系统，使发酵清液透过并排出，同步补加新鲜发酵培养基，实现连续换液培养，且能够在全程无菌状态下进行，发酵周期能够延长至84-100h(正常发酵时间为60-72h)，柠檬酸累积速率达到0.81-1.32g/(l·h)。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
1.一种连续换液发酵制备柠檬酸的方法，其特征在于，该方法包括：
(i)将发酵罐(1)中的发酵液经泵(2)泵送至膜过滤系统(3)中通过过滤膜进行分离；
(ii)将透过所述过滤膜的发酵清液(a)收集，并将未透过所述过滤膜的含有菌球的液体(b)返回至所述发酵罐(1)中；
(iii)将新鲜发酵培养基连续喂给至所述发酵罐(1)中，且所述新鲜发酵培养基的喂给速率等于所述发酵清液(a)的收集速率；以及
(iv)将所述发酵清液(a)进行提取制备柠檬酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(i)之前，将所述膜过滤系统(3)以及与所述膜过滤系统(3)所连通的管道采用酒精、酸或碱进行冲洗浸泡。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述膜过滤系统(3)还包括振动装置，且所述膜过滤系统(3)采用的过滤方式为切向流过滤；
优选地，所述过滤膜为超滤膜和/或微滤膜；
优选地，所述过滤膜为卷式膜、管式膜和中空纤维膜中的一种或多种；
优选地，所述过滤膜的截留分子量为1k-100kda；
优选地，所述过滤膜中过滤流体的压力不高于0.1mpa。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述振动装置的参数为：回旋式振幅为20-50mm，振动速度为150-250r/min；
优选地，所述振动装置的振动方向与所述发酵液的流动方向相垂直。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述新鲜发酵培养基的喂给管道的末端设置于所述发酵罐(1)的液面以上；所述泵(2)的吸入管道的末端设置于所述发酵罐(1)的液面以下。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述发酵清液的膜面透过速率为0.005-5m/s，以及所述发酵清液的酸度为5-15g/dl。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述菌球的平均粒径为100-200μm。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于5l发酵罐，所述发酵液经泵(2)泵送至膜过滤系统(3)中的体积流速为300-750ml/min，酸度为5-15g/dl。
9.根据权利要求1或8所述的方法，其中，所述发酵液通过下述方法制备得到：
(i-1)将孢子悬浮液预先经种子活化制成发酵种子液后，置于所述发酵罐(1)中；
(i-2)将淀粉液化糖化的产物与玉米浆、磷酸盐接触配制新鲜发酵培养基；
(i-3)将所述新鲜发酵培养基灭菌冷却后喂给至所述发酵罐(1)中，与所述发酵种子液接触进行发酵。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，在步骤(i-3)中，所述发酵的条件包括：通气量为0.5-1.5vvm，搅拌转速为500-1000r/min，发酵时间为24-32h；优选地，所述发酵种子液与所述新鲜发酵培养基的用量的体积比为1：(4-19)。
技术总结