本发明涉及一种强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，属于微生物发酵生产重要化工物质技术领域。
背景技术：
丁酸是重要的工业原料，广泛应用于食品添加剂、化工产品和医药产品等的生产。目前，丁酸的工业生产主要是以石油、煤炭和天然气等化石资源为基础的正丁醛氧化法合成。然而，化石资源的有限性、不可再生性及使用过程带来环境污染问题，迫使人们寻求与自然和谐的生产方法，以可再生生物质为原料的生物基产品的开发利用技术备受关注。
现有技术中以储量丰富的秸秆为原料，通过微生物发酵生产丁酸。在秸秆生物质中，可被微生物水解和发酵的主要成分是纤维素和半纤维，而它们与木质素等物质互相缠绕形成结构复杂而稳定的多聚体，很难被微生物有效降解和转化。因此，在生物发酵前，通常需要必要的预处理，以破坏木质纤维素的结构，最大可能地暴露纤维素和半纤维。经预处理后的秸秆，还需通过物化或生物方法进行糖化处理，以获取可发酵性糖，如葡萄糖、纤维二糖和木糖等。然而，高昂的糖化成本远远抵消了农作物秸秆的原料成本优势。为避免糖化处理带来的成本问题和工艺的复杂性，利用混合菌群的协同代谢作用，对纤维素和半纤维进行水解和发酵的研究受到广泛重视。与纯菌种发酵相比，混合菌群发酵可以借助种类不同微生物的协同代谢作用，显著提高底物的利用率，不仅工艺简单，而且不需要单独的糖化处理，可显著降低发酵秸秆产丁酸的成本。此外，混合菌群发酵系统还具有运行稳定，抗杂菌污染的优势，易于管理和运行。然而，现有混合菌群发酵过程还存在着发酵副产物较多、目标产物转化率低、底物利用率低等问题。因此，提供一种强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的方法是十分必要的。
技术实现要素：
本发明为了解决现有混合菌群发酵过程还存在着发酵副产物较多、目标产物转化率低、底物利用率低等问题，提供强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法。
本发明的技术方案：
一种强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，该方法包括以下步骤：
(1)将厌氧发酵培养基加入双室h型反应器的阴极室，然后将厌氧混合菌群接种液接种至厌氧发酵培养基中，在37℃条件下，在120r/min的转速下搅拌培养；
(2)在步骤(1)开始培养的同时，将双室h型反应器的三个电极与恒电位连接，启动双室h型反应器；
(3)每间隔24h从阴极室取样，测定发酵液中挥发酸组分，直至发酵液中的挥发酸组分不再继续变化，发酵过程结束。
进一步地，厌氧发酵培养基包括底物秸秆、酵母粉、蛋白胨、caco3和nacl。
更进一步地，1l所述的厌氧发酵培养基中含有底物秸秆含量为20g，酵母粉含量为1g，蛋白胨含量为5g，caco3含量为2g，nacl含量为5g。
更进一步地，底物秸秆的制备方法为：取自然风干后的水稻秸秆切割成1mm，将切割后的秸秆置于质量百分含量为1％的naoh溶液中，在50℃条件下静置72h，过滤去除液体，收集固相物，将固相物用自来水清洗至ph为中性，进行烘干，获得底物秸秆。
更进一步地，秸秆与naoh溶液的质量体积比为1g：15ml。
进一步地，双室h型反应器以钛丝固定石墨毡作为阴极和阳极，ag/agcl电极为参比电极；阳极室中加载与阴极室加载物等体积的k4(fe(cn)6)溶液作为电子供体。
更进一步地，k4(fe(cn)6)溶液浓度为200mmol/l。
进一步地，双室h型反应器施加的恒电位为-0.2～-1.2v。
进一步地，厌氧混合菌群接种量与厌氧发酵培养基的体积比为5:100。
进一步地，厌氧混合菌群包含纤维素降解菌和半纤维素降解菌，厌氧混合菌群接种液富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物，具体操作过程为：采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，将初始菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养，厌氧培养条件为：在35℃下培养14天；
所述的种子培养基是以pcs培养基为基础，以预处理过的秸秆为原料，具体配置过程为：在1l培养基中加入10g预处理过的秸秆、5g蛋白胨、1g酵母粉、5gnacl、2gcaco3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10min，密封，115℃灭菌20min；
所述的初始菌群筛选过程为：分别从牛粪、沼气渣、猪粪堆肥、水沟底泥、玉米地土壤、灌木丛土壤、腐木以及腐叶中采集样品，将采集的样品分别置于以秸秆为碳源的富集培养基中进行富集培养，在富集培养几种添加一片滤纸条作为指示物，以滤纸条完全崩解为标准，进行连续传代培养5个月，然后将获得的培养物等比例混合，然后以秸秆为碳源的富集培养基作为传代培养基，传代培养3个月，获得厌氧混合菌群接种液；
所述的以秸秆为碳源的富集培养制备方法为：在1l培养基中加入10g预处理过的秸秆、5g蛋白胨、1g酵母粉、5gnacl、2gcaco3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10min，密封，115℃灭菌20min；
所述的预处理过的秸秆的处理过程为：将水稻秸秆切割成10-15cm；将切割后的秸秆置于质量百分含量为1％的naoh溶液中，在50℃条件下静置72h，过滤去除液体，收集固相物，将固相物用自来水清洗至ph为中性，进行挤干，置于4℃中保存备用，其中，水稻秸秆与naoh溶液的质量体积比为1g：15ml。
本发明具有以下有益效果：本发明在阴极电发酵系统中以混合菌群进行秸秆的丁酸发酵，通过引入电极，可以控制和优化发酵环境，改变细胞原有的nad(p) /nad(p)h的平衡，影响微生物的发酵过程，以获得具有更高纯度的产品，并利于微生物细胞的生长和生物量积累实现碳链的延长，实现可持续的丁酸制备。该方法具有如下优点：
(1)通过混合菌群中多种功能菌属的互利协作来完成秸秆中纤维素成分、半纤维素成分综合利用，不需要外源酶制剂的添加，能够显著降低丁酸生产过程中的成本。
(2)采用的混合菌群为严格厌氧菌群，在接种和运行条件下，不需要严格的无菌条件，在氮气保护条件下即可进行发酵接种，因此在发酵过程中易于运行维护。
(3)阴极电发酵中产生的电流可以作为潜在的外源电子供应，供给还原力的合成，这种途径比微生物利用传统发酵底物(可发酵糖)通过代谢产生的电子更具可持续性，在不需要额外添加外源电子传递介体的条件下即可实现对发酵系统进行电化学手段干预，在促进水稻秸秆的丁酸转化过程中建立了持续、有效的发酵调控系统，进一步提高混合菌群发酵产丁酸的效能，降低了系统运行的成本的同时可以达到促进预处理水稻秸秆的降解和丁酸的生成的目的，对于加快可持续生物质的丁酸转化具有重要意义。
(4)阴极电发酵本身的能耗较低，仅需极小的电流刺激或电势施加即可起到显著的效果，对于调控厌氧发酵过程具有很好的应用潜力。
(5)本发明的方法通过一定电势的施加，通过将外部电流引入到发酵体系中，能够显著优化微生物之间的协作过程，促进秸秆的降解及发酵产酸过程，使发酵获得的丁酸产量和产率有明显的提高。在批式发酵中，本发明使发酵底物更多的转化为丁酸合成途径，表现为最终的丁酸产量及产率的提高。较无施加电势的系统相比，阴极电发酵系统对于丁酸转化具有的明显促进作用，发酵结束后其目标产物丁酸的选择性(丁酸占总挥发酸的质量百分比)从44.74％升高到了52.76％，丁酸产量和产率分别提高了17.37％和28.13％。发酵前后的细菌群落结构分析表明，混合菌群中的优势丁酸发酵细菌为菌属clostridium的ⅳ簇和ⅹⅳa簇，其总丰度为20.05％。阴极电发酵系统中电势的施加能显著改变混合菌群中的群落结构。发酵后，阴极电发酵系统可将群落中的ⅳ簇和ⅹⅳa簇的总丰度大幅提高到33.61％，进而显著提高了混合菌群的丁酸发酵效能。
(6)并且本发明提供的方法，发酵底物更多的流向丁酸合成的代谢途径，减少了副产物如丙酸、戊酸等挥发酸的生成，明显提高了丁酸产量和产率。由此可知，阴极电发酵系统是强化混合菌群发酵秸秆产丁酸效能的有效手段，在低电势、微电流和无外源电子传递介体的条件下，即可较大幅度地提高混合菌群发酵秸秆产丁酸的效能，具有很好的技术经济性。
附图说明
图1为本发明的双室h型反应器的结构示意图；
图2为实施例1的发酵指标变化；
图3为对比例1的发酵指标变化；
图4为实施例1(cef)和对比例1(oc)发酵后的菌群结构差异性对比图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。
实施例1：
在阴极电发酵系统(cef)内进行厌氧混合菌群发酵秸秆产丁酸过程。具体操作过程如下：
(1)以双室h型反应器为发酵反应器，其中秸秆丁酸发酵在阴极室进行，阳极室内盛有等体积的浓度为200mmol/l的亚铁氰化钾溶液作为电发酵系统中的电子供体。以直径为3mm的钛丝固定等体积的石墨毡作阴极和阳极，固定于钛丝上的阴极和阳极穿过极室顶部的橡胶塞完成固定。阳极参比电极为ag/agcl(196mvvsshe),通过阴极室侧边取样口将其固定并将电极前端置于发酵液面下2cm左右深度，如图1所示。
(2)将配置好的厌氧发酵培养基加入阴极室，然后按照5％(v/v)的比例将厌氧混合菌群种子液接种至新鲜的厌氧发酵培养基中，置于37℃、120r/min的转速下培养。
厌氧发酵培养基中包含有20g/l预处理秸秆、1g/l酵母粉、5g/l蛋白胨、2g/l的caco3、5g/l的nacl。培养基通过曝氮气除氧后不需进行灭菌即可接种并开始发酵。
厌氧混合菌群厌氧混合菌群包含纤维素降解菌和半纤维素降解菌，厌氧混合菌群接种液富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物，具体操作过程为：采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，将初始菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养，厌氧培养条件为：在35℃下培养14天；
种子培养基是以pcs培养基为基础，以预处理过的秸秆为原料，具体配置过程为：在1l培养基中加入10g预处理过的秸秆、5g蛋白胨、1g酵母粉、5gnacl、2gcaco3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10min，密封，115℃灭菌20min；
初始菌群筛选过程为：分别从牛粪、沼气渣、猪粪堆肥、水沟底泥、玉米地土壤、灌木丛土壤、腐木以及腐叶中采集样品，将采集的样品分别置于以秸秆为碳源的富集培养基中进行富集培养，在富集培养几种添加一片滤纸条作为指示物，以滤纸条完全崩解为标准，进行连续传代培养5个月，然后将获得的培养物等比例混合，然后以秸秆为碳源的富集培养基作为传代培养基，传代培养3个月，获得厌氧混合菌群接种液；
以秸秆为碳源的富集培养制备方法为：在1l培养基中加入10g预处理过的秸秆、5g蛋白胨、1g酵母粉、5gnacl、2gcaco3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10min，密封，115℃灭菌20min；
预处理过的秸秆的处理过程为：将水稻秸秆切割成10-15cm；将切割后的秸秆置于质量百分含量为1％的naoh溶液中，在50℃条件下静置72h，过滤去除液体，收集固相物，将固相物用自来水清洗至ph为中性，进行挤干，置于4℃中保存备用，其中，水稻秸秆与naoh溶液的质量体积比为1g：15ml。
(3)在步骤(2)开始培养的同时，将双室h型反应器的三个电极与恒电位连接，设置工作电极的施加电势为-0.8v(vsag/agcl)后，启动双室h型反应器。
(4)电发酵期间，每24h从系统中取样，测定关键发酵指标，结果如图2所示。
(5)整个发酵过程持续7天后，发酵液中的挥发酸组分不再继续变化，发酵过程结束。
对比例1：
在无施加电势的系统(oc)内进行厌氧混合菌群发酵秸秆产丁酸过程。除了不施加工作电极电势以外，其余操作与实施例1相同，关键发酵指标的测试结果如图3所示。
对比实施例1和对比例1的关键发酵指标测试结果，即对比图2和图3可知，发酵结束后，较无施加电势的oc系统相比，cef系统对于丁酸转化具有的明显促进作用，发酵结束后其目标产物丁酸的选择性(丁酸占总挥发酸的质量百分比)从44.74％升高到了52.76％，丁酸产量和产率从4.72g/l和0.32g/g提高到5.54g/l和0.41g/g，分别提高了17.37％和28.13％。
此外，oc系统在发酵结束时得到10.12g/l的总挥发酸，与之相比，cef系统得到11.08g/l的总挥发酸。而乙酸生成方面，cef系统得到的2.98g/l略高于oc系统的2.04g/l，乙酸作为逆β氧化途径合成丁酸途径的前驱物质，更多的乙酸意味着可能有更多的丁酸生成。
另一个比较明显的差异是，在cef系统仅有0.22g/l的丙酸生成，而与之对照的oc组的丙酸则为1.42g/l，说明cef系统的应用能够减少副产物的生成、优化产物结构，提高目标物质的产量和产率。
且在发酵结束时，cef系统最终得到0.56l/l的氢气产量，与oc系统的0.48l/l相比提高了16.67％。
对实施例1和对比例1发酵结束后的菌群结构进行检测，差异性对比如图4所示。
厌氧混合菌群参与的发酵过程中，包含的主要菌属微生物有纤维素降解菌、半纤维(木聚糖)降解菌、丁酸发酵菌属、乙醇发酵菌属、中长链脂肪酸(戊酸、己酸)合成菌属等。通过对比cef系统和oc系统在发酵结束时主要菌属的变化，可以看出在cef系统中，主要菌属与oc系统相比有明显的变化。厌氧混合菌群中的优势丁酸发酵细菌为菌属clostridium的ⅳ簇和ⅹⅳa簇，在oc系统中，其总丰度为20.05％。而cef系统的应用能显著改变发酵系统中厌氧混合菌群的群落结构，可将细菌群落中的ⅳ簇和ⅹⅳa簇的总丰度大幅提高到33.61％，进而显著提高了厌氧混合菌群的丁酸发酵效能。
1.一种强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将厌氧发酵培养基加入双室h型反应器的阴极室，然后将厌氧混合菌群接种液接种至厌氧发酵培养基中，在37℃条件下，在120r/min的转速下搅拌培养；
(2)在步骤(1)开始培养的同时，将双室h型反应器的三个电极与恒电位连接，启动双室h型反应器；
(3)每间隔24h从阴极室取样，测定发酵液中挥发酸组分，直至发酵液中的挥发酸组分不再继续变化，发酵过程结束。
2.根据权利要求1所述的强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，其特征在于，所述的厌氧发酵培养基包括底物秸秆、酵母粉、蛋白胨、caco3和nacl。
3.根据权利要求2所述的强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，其特征在于，1l所述的厌氧发酵培养基中含有底物秸秆含量为20g，酵母粉含量为1g，蛋白胨含量为5g，caco3含量为2g，nacl含量为5g。
4.根据权利要求3所述的强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，其特征在于，所述的底物秸秆的制备方法为：取自然风干后的水稻秸秆切割成1mm长度，将切割后的水稻秸秆置于质量百分含量为1％的naoh溶液中，在50℃条件下静置72h，过滤去除液体，收集固相物，将固相物用自来水清洗至ph为中性，进行烘干，获得底物秸秆。
5.根据权利要求4所述的强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，其特征在于，所述的秸秆与naoh溶液的质量体积比为1g：15ml。
6.根据权利要求1所述的强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，其特征在于，所述的双室h型反应器以钛丝固定石墨毡作为阴极和阳极，ag/agcl电极为参比电极；阳极室中加载与阴极室加载物等体积的k4(fe(cn)6)溶液作为电子供体。
7.根据权利要求6所述的强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，其特征在于，所述的k4(fe(cn)6)溶液浓度为200mmol/l。
8.根据权利要求1所述的强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，其特征在于，所述的双室h型反应器施加的恒电位为-0.2～-1.2v。
9.根据权利要求1所述的强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，其特征在于，厌氧混合菌群接种量与厌氧发酵培养基的体积比为5:100。
10.根据权利要求1所述的强化厌氧混合菌群发酵秸秆制备丁酸的阴极电发酵方法，其特征在于，所述的厌氧混合菌群包含纤维素降解菌和半纤维素降解菌，厌氧混合菌群接种液富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物，具体操作过程为：采用富集自牛粪、猪粪堆肥、玉米地土壤和腐木的混合物为初始菌群，将初始菌群接种于种子培养基，静置进行厌氧培养，厌氧培养条件为：在35℃下培养14天，获得厌氧混合菌群接种液；
所述的种子培养基是以pcs培养基为基础，以预处理过的秸秆为原料，具体配置过程为：在1l培养基中加入10g预处理过的秸秆、5g蛋白胨、1g酵母粉、5gnacl、2gcaco3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10min，密封，115℃灭菌20min；
所述的初始菌群筛选过程为：分别从牛粪、沼气渣、猪粪堆肥、水沟底泥、玉米地土壤、灌木丛土壤、腐木以及腐叶中采集样品，将采集的样品分别置于以秸秆为碳源的富集培养基中进行富集培养，在富集培养几种添加一片滤纸条作为指示物，以滤纸条完全崩解为标准，进行连续传代培养5个月，然后将获得的培养物等比例混合，然后以秸秆为碳源的富集培养基作为传代培养基，传代培养3个月，获得初始菌群；
所述的以秸秆为碳源的富集培养制备方法为：在1l培养基中加入10g预处理过的秸秆、5g蛋白胨、1g酵母粉、5gnacl、2gcaco3和0.5g半胱氨酸；通入氮气10min，密封，115℃灭菌20min；
所述的预处理过的秸秆的处理过程为：将水稻秸秆切割成10-15cm；将切割后的秸秆置于质量百分含量为1％的naoh溶液中，在50℃条件下静置72h，过滤去除液体，收集固相物，将固相物用自来水清洗至ph为中性，进行挤干，置于4℃中保存备用，其中，水稻秸秆与naoh溶液的质量体积比为1g：15ml。
技术总结