本发明属于微生物技术领域，涉及一种提高裂殖壶菌油脂发酵产量的方法，具体涉及儿茶素在提高裂殖壶菌dha油脂、β胡萝卜素产量中的应用。
背景技术：
二十二碳六烯酸(dha)是一种重要的长链多不饱和脂肪酸(pupa)，属于omega-3不饱和脂肪酸，可作为细胞膜合成的必要成分，不仅对婴儿大脑的生长和功能发育至关重要，而且较其他脂肪酸而言，dha更容易被大脑吸收，可显著改善学习能力。除此之外，dha具有降低血脂、预防和治疗动脉粥样硬化、苯丙酮尿症、偶发性阿尔兹海默症等疾病，因此，dha受到人们的普遍关注。但目前世界上的dha产量出现供不应求且价格昂贵等问题。美国、日本等国家对dha的研发开始较早，积累了大量的研发经验，因而其占据了大量的dha销售市场；而目前在国内对dha的研究开展较晚，因此进一步开发dha油脂的提取量具有重要意义。目前关于dha的研究大多集中在鱼油来源的dha、油脂来源的dha、油脂的提取纯化及应用等方面，dha的传统来源是鱼油，但鱼油产量易受环境季节影响，且从鱼油中提取dha存在易氧化、有鱼腥味、提取的dha不稳定、浓缩困难等缺点，无法满足市场需求。
裂殖壶菌(schizochytrium)是属于真菌门(eumycota)、卵菌纲(oomycetes)水霉目(saprolegniales)、破囊壶菌科(thraustochytriaceae)的一类缺乏叶绿体的海洋真菌，不进行光合作用，生长速率快且富含多不饱和脂肪酸，可通过异氧繁殖生产且不受季节影响，因而一直被视为一种具有实现工业化生产dha潜力的微生物。在裂殖壶菌代谢过程中，乙酰coa是油脂合成的最主要前体物质。首先，葡萄糖通过糖酵解途径生成丙酮酸，随后丙酮酸转化为乙酰coa进入tca循环，tca循环中的柠檬酸从线粒体中穿梭到胞质中，进一步转化为乙酰coa供油脂合成。在这个过程中，丙酮酸不仅可以转化为乙酰coa，还可以通过磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(pepc)的催化下生成草酰乙酸盐，从而减少脂质积累的碳流量。因此，抑制pepc有利于脂质的产生。研究证明使用rnai或crispr技术靶向敲除pepc基因可对脂质产量达到不同程度的提高。但是应用于食品行业的裂殖壶菌无法通过基因工程对副途径进行敲除，因此通过外源添加调控因子手段成为了调控代谢网络的主要手段。
专利文献cn106893749中通过外源添加乳酸(或乙酸)，刺激裂殖壶菌生产透明质酸，使其透明质酸产量提高；专利文献cn104894176中将碘乙酰胺作为调控因子，加入到裂殖壶菌的发酵培养基中，将裂殖壶菌油脂中dpa/dha比例从0.2有效调节至0.39，并使得dpa产量提高69％；专利文献cn108707630中首次将氟啶酮应用于脂肪酸合成调控中，使得裂殖壶菌油脂中的epa含量提高了42.31％；专利文献cn201710548502.1的专利在裂殖壶菌培养基中添加终浓度为100mg/l-3g/l的苯甲酸对位衍生物，油脂产量提高了32.12％此外，专利文献cn107177640b、cn104450809b、cn104593270分别通过添加苯甲酸、芝麻酚、粗甘油以提高裂殖壶菌产油脂的含量。目前，通过添加儿茶素来控制裂殖壶菌dha油脂含量未见报道。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种儿茶素在提高裂殖壶菌dha油脂产量中的应用，该应用是一种能够提高dha油脂发酵产量的方法，简单高效、价格低廉且安全。
技术方案：为了实现上述目的，本发明所述儿茶素在提高裂殖壶菌dha油脂产量中的应用。
其中，所述裂殖壶菌在发酵生产dha油脂的过程中添加儿茶素。
作为优选，所述裂殖壶菌在发酵生产油脂的过程中添加儿茶素提高dha油脂和β胡萝卜素的含量。
本发明所述利用儿茶素培养裂殖壶菌提高dha油脂、β胡萝卜素产量的方法，包括如下步骤：
(1)将菌株接种于种子培养基中进行活化并将得到的活化菌转接于种子培养基以获得一级种子；
(2)将步骤(1)中获得的一级种子接于种子培养基再次培养获得二级种子；
(3)将步骤(2)中获得的二级种子接于种子培养基再次培养获得三级种子；
(4)将步骤(3)中的三级种子转接于含儿茶素的发酵培养基中进行发酵培养获得油脂。
其中，步骤(1)-(3)的种子的培养方法为：将裂殖壶菌或者一级种子或者二级种子接种于种子培养基中，接种量为0.8-1％(v/v)，28-30℃，170-200rpm下培养20-24h。
作为优选，步骤(1)-(3)的种子的培养方法为：将裂殖壶菌或者一级种子或者二级种子接种于种子培养基中，接种量为0.8％(v/v)，温度为28℃，转速为200rpm下培养24h。其中，步骤(4)中将步骤(3)中培养到对数期的三级种子接种到含儿茶素的发酵培养基中进行发酵培养，接种量为0.8-1％(v/v)，28-30℃，170-200rpm下培养20-24h。
作为优选，步骤(4)中将步骤(3)中培养到对数期的三级种子接种到含儿茶素的发酵培养基中进行发酵培养，接种量为0.8％(v/v)，温度为28℃，转速为200rpm下培养24h。其中，步骤(1)-(3)的种子培养基包括碳源、氮源、无机盐离子和微量元素。
其中，步骤(4)中的发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐离子、微量元素和儿茶素。
作为优选，所述种子培养基和发酵培养基包括碳源(葡萄糖)、氮源(酵母提取物)、无机盐离子(钠盐、镁盐、钾盐、磷酸盐和钙盐中的的任何一种或多种)和微量元素(mn2 、co2 、mno42 、ni2 和fe2 中的一种或几种)。
其中，步骤(4)发酵培养基中儿茶素的浓度为0.3-3mmol/l。
作为优选，步骤(4)发酵培养基中儿茶素的浓度为1.5mmol/l。
作为优选，在发酵培养基中添加少量儿茶素可以提高裂殖壶菌dha油脂、β胡萝卜素含量，包括如下步骤：
1)将裂殖壶菌接种于种子培养基中以获得活化菌，将活化菌转接于种子培养基获得一级种子；
2)将步骤1)中获得的一级种子接于种子培养基中培养获得二级种子；
3)将步骤2)中获得的二级种子接于种子培养基中培养获得三级种子；
4)将步骤3)中的三级种子转接于含有儿茶素的发酵培养基中进行发酵培养获得油脂，接种量为0.8％(v/v)，28℃，170rpm下培养24h左右；
5)将培养裂殖壶菌的培养基ph调至10-12，加入0.5％的破壁酶(破壁酶占培养基的体积比0.5％)；
6)在50℃下酶解90min至菌体消化完全，结束后镜检观察细胞是否酶解完全；
7)按和步骤4)所得发酵液体积比1：1加入无水乙醇使蛋白沉淀；
8)加入正己烷(分析纯)混匀，静置等待分层，取出上层呈黄色的液体(正己烷和油脂混和物)，注意不要取到沉淀，防止在称重油脂过程中产生误差；
9)用正己烷反复萃取，直至上层清夜为透明状呈无色；
10)将所得液体于40℃下进行旋蒸萃取，旋蒸前对瓶体进行称重,旋蒸至不再有冷凝水滴落；
11)旋蒸后置于烘箱干燥至恒重，称重；
12)对油脂进行甲酯化：①加1ml的氢氧化钾甲醇溶液到1.5ml离心管，加20μl油脂(步骤11恒重后的液体)于其中混匀，然后将其加入至20ml的容量瓶中，再加入2ml氢氧化钾-甲醇溶液于容量瓶中(将1.5ml离心管润洗，将油脂尽可能地吸到容量瓶中)，混匀后65℃水浴17min，冷却至室温；②加2ml三氟化硼乙醚(三氟化硼：乙醚＝3：7)，混匀后65℃水浴7min；③加2ml饱和氯化钾摇匀，加3ml正己烷(色谱级)，静置置分层；④倒入小离心管中取上层正己烷相过微孔膜去杂；⑤密封保存即可上气相色谱。
其中，微生物发酵生产油脂的发酵培养基中儿茶素的浓度为0.3-3mmol/l，最优浓度为1.5mmol/l。
本发明是一种在发酵生产过程中外源添加代谢产物提高油脂产量的方法，具体利用裂殖壶菌发酵生产油脂dha过程中，额外添加少量的儿茶素以提高裂殖壶菌的dha油脂产量以及β胡萝卜素产量。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明通过在裂殖壶菌发酵体系中外源添加特定比例的儿茶素以抑制pepc酶的产生，从而扰动代谢网络减少碳流向脂质的生物合成，可有效提高裂殖壶菌发酵产生dha油脂的含量，其中dha产量提高70％以上，dha占生物量的比(mg/g)提高40％以上，总油脂提高70％以上。此外，其中的β胡萝卜素产量也显著提高接近25.7％。
本发明通过简单的发酵调控，可显著提高微生物中油脂含量，使生产成本降低，具有经济效益。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
实施例1
本发明使用的菌种为裂殖壶菌atcc-20888(购买自美国模式菌种收集中心(americantypeculturecollection,atcc)为野生型裂殖壶菌，甘油管中保存。本发明也可以使用其他任何野生型的的裂殖壶菌效果一致。
种子培养基：d-葡萄糖40g/l、酵母膏2g/l、谷氨酸钠10g/l、mgcl23g/l、cacl2·2h2o1g/l、kh2po44g/l、kcl2g/l、nacl15g/l、mgso4·7h2o5g/l、fecl30.1g/l。
发酵培养基：d-葡萄糖40g/l、酵母膏2g/l、谷氨酸钠10g/l、mgcl23g/l、(nh4)2so46g/l、kh2po44g/l、kcl2g/l、nacl15g/l、mgso4·7h2o5g/l、fecl30.1g/l、儿茶素1.5mmol/l。
利用儿茶素培养裂殖壶菌提高油脂产量的方法，包括如下步骤：
1、将保存的裂殖壶菌接入30ml种子培养基中，接种量体积比1％；，于28℃，170rpm培养24h左右得一级种子；取一级种子所在种子培养基中的500μl于50ml种子培养基中，于28℃，170rpm培养24h左右得二级种子；取二级种子所在培养基中的2.5ml于250ml种子培养基中，于28℃，170rpm培养得到对数期的三级种子液。
2、将培养到对数期的三级种子液，按接种量为1％(v/v)接种到发酵培养基；在28℃170rpm条件下摇瓶培养24h，在发酵培养基中添加0.3-3mmol/l的儿茶素，最优浓度为1.5mmol/l。经过测定结果：油脂产量由8.4g/l升高至12g/l。
3、将培养裂殖壶菌的培养基ph调至10，加入0.5％的破壁酶；
4、在50℃下酶解90min，转速无特定要求，结束后镜检观察细胞是否酶解完全；
5、按发酵液体积比1：1加入无水乙醇使蛋白沉淀；
6、加入正己烷(分析纯)混匀，静置等待分层，取出上层呈黄色的液体(正己烷和油脂混和物)，注意不要取到沉淀，防止在称重油脂过程中产生误差；
7、用正己烷反复萃取，直至上层清夜为透明状呈无色；
8、将所得液体于40℃下进行旋蒸萃取，旋蒸前对瓶体进行称重,旋蒸至不再有冷凝水滴落；
9、旋蒸后置于烘箱干燥至恒重，称重；
10、对油脂进行甲酯化：①加1ml的氢氧化钾甲醇溶液到1.5ml离心管，加20μl油脂(步骤11恒重后的液体)于其中混匀，然后将其加入至20ml的容量瓶中，再加入2ml氢氧化钾-甲醇溶液于容量瓶中(将1.5ml离心管润洗，将油脂尽可能地吸到容量瓶中)，混匀后65℃水浴17min，冷却至室温；②加2ml三氟化硼乙醚(三氟化硼：乙醚＝3：7)，混匀后65℃水浴7min；③加2ml饱和氯化钾摇匀，加3ml正己烷(色谱级)，静置分层；
11、将分层之后的上层液体倒入小离心管中过微孔膜去杂质，制样后用气相色谱进行检验，计算油脂与dha的含量。气相色谱检验方法：参照陈丽珠的《流加培养裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸检验方法》中检测二十二碳六烯酸检测方法的色谱条件：选取毛细管色谱柱(60mx0.32nmx15um)。采用程序升温：初始温度200℃,保持2min,然后按10℃/min升到240℃,保持40min.柱圧200kpa,迸祥口温度250℃,柆測器温度280℃.用内标法定量，内标为二十烷酸。
12、生物量的测定：取1ml步骤2刚发酵完成的发酵液，4000r/min离心5min，舍弃上清液，加入质量分数2％的nacl溶液1ml洗涤一次，再用1ml的蒸馏水洗涤一次，在105℃下干燥至恒重，最后称量计算。
(9)β-胡萝卜素含量检测：取5ml步骤2刚发酵完成的发酵液，离心后加入等体积的甲醇进行数次浸泡提取，合并甲醇提取液，经旋转真空蒸发器除去甲醇，加入ccl4将浓缩物溶解，过0.22μm有机滤膜，备用。采用高效液相色谱法测定β-胡萝卜素的含量。色谱柱：amethystc18-hcolumn(4.6x150mm，5μm)色谱柱，检测波长4750nm，柱温为室温，流动相流速是1.0ml/min，采用梯度洗脱，制备β-胡萝卜素标准样品，得到标准曲线方程。洗脱程序如下：
其他指标的测定均采用现有技术中的常规方法。
实施例2
采用实施例1的方法，在发酵培养基中添加的儿茶素按照一定浓度梯度(0.3mmol/l、1mmol/l、1.2mol/l、1.5mol/l、1.8mol/l、2mol/l、3mol/l)进行添加，发酵至24h时停止，并进行各项指标检测。结果见表1.
表1
如表1所示，在添加的不同浓度的外源儿茶素之后，细胞的生物量有所增加，加入1.5mm的儿茶素裂殖壶菌的油脂含量最高，可有效提高裂殖壶菌发酵产生dha油脂的含量，其中dha产量提高70％以上，dha占生物量的比(mg/g)提高40％以上，总油脂提高70％以上。此外，其中的β胡萝卜素产量也有相应的也显著提高。本发明中儿茶素添加量十分重要，含量过低和过高均效果不好，微量的变化会导致各项指标的显著降低。
1.儿茶素在提高裂殖壶菌dha油脂产量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述裂殖壶菌在发酵生产油脂的过程中添加儿茶素。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述裂殖壶菌在发酵生产油脂的过程中添加儿茶素提高dha油脂和β胡萝卜素的含量。
4.一种利用儿茶素培养裂殖壶菌提高dha油脂、β胡萝卜素产量的方法，其特征在在于，包括如下步骤：
(1)将菌株接种于种子培养基中进行活化并将得到的活化菌转接于种子培养基以获得一级种子；
(2)将步骤(1)中获得的一级种子接于种子培养基再次培养获得二级种子；
(3)将步骤(2)中获得的二级种子接于种子培养基再次培养获得三级种子；
(4)将步骤(3)中的三级种子转接于含儿茶素的发酵培养基中进行发酵培养获得dha油脂、β胡萝卜素。
5.根据权利要求4所述的儿茶素培养裂殖壶菌提高油脂产量的方法，其特征在于，步骤(1)-(3)的种子的培养方法为：将裂殖壶菌或者一级种子或者二级种子接种于种子培养基中，接种量为0.8-1％(v/v)，温度为28-30℃，转速为170-200rpm下培养20-24h。
6.根据权利要求4所述的儿茶素培养裂殖壶菌提高dha油脂、β胡萝卜素产量的方法，其特征在于，步骤(4)中将步骤(3)中培养到对数期的三级种子接种到含儿茶素的发酵培养基中进行发酵培养，接种量为0.8-1％(v/v)，温度为28-30℃，转速为170-200rpm下培养20-24h。
7.根据权利要求4所述的儿茶素培养裂殖壶菌提高dha油脂、β胡萝卜素产量的方法，其特征在于，步骤(1)-(3)的种子培养基包括碳源、氮源、无机盐离子和微量元素。
8.根据权利要求4所述的儿茶素培养裂殖壶菌提高dha油脂、β胡萝卜素产量的方法，其特征在于，步骤(4)中的发酵培养基包括碳源、氮源、无机盐离子、微量元素和儿茶素。
9.根据权利要求4所述的儿茶素培养裂殖壶菌提高dha油脂、β胡萝卜素产量的方法，其特征在于，步骤(4)发酵培养基中儿茶素的浓度为0.3-3mmol/l。
10.根据权利要求4所述的儿茶素培养裂殖壶菌提高dha油脂、β胡萝卜素产量的方法，其特征在于，步骤(4)发酵培养基中儿茶素的浓度优选为1.5mmol/l。
技术总结