本发明涉及植物提取物技术领域，尤其涉及一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法。
背景技术：
壶瓶碎米荠是一种富硒能力极强的十字花科植物，壶瓶碎米荠经过培育含硒量可达1000mg/kg以上，其中有机硒含量约占93.30％，做为补硒保健产品的添加成分具有安全性高、吸收好的特点，有很大的应用空间。
目前壶瓶碎米荠水提喷雾干燥产物为深棕褐色，其应用的范围受到限制，因此，必须该提取物进行脱色。经过活性炭脱色的提取液，颜色状态好，为后续的硒蛋氨酸的提纯提供了有利的条件。终产物硒蛋氨酸经c18反相色谱柱纯化后，产物纯度高，收率好。
技术实现要素：
在本发明提供了一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法。
本发明采用如下技术方案：
本发明的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法的具体步骤如下：
(1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡60-120min，料液比为1:10-50，然后开始加热，在50-90℃下超声提取40-80min，超声频率40hz,待滤液温度降低至40-50℃，然后进行过滤，滤液调节ph至3-8，加入一定比例的乳酸菌进行发酵，发酵时间3h-6h，过滤减压低温干燥，得到壶瓶碎米荠粗蛋白粉末；
(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为5-15:200-800g/ml，加入0.5-2%的活性炭，500-2000r/min速度搅拌10-30分钟，然后过滤调壶瓶碎米荠提取物溶液ph值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置10-15h，然后在2-6℃，5000-7000r/min下离心8-12min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用sephadexg-50、75、100、150凝胶柱层析中的一种或多种和deae-ff阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化所含的初级蛋白。
(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用c18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
步骤(1)中，优选干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过80目筛。
步骤(1)中，优选往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡60min，料液比为1:40。
步骤(1)中，优选在80℃下超声提取60min。
步骤(1)中，优选进行100目过滤，滤液进行减压低温干燥。
步骤(2)中，优选壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为15:350g/ml。
步骤(2)中，用硫酸铵调节壶瓶碎米荠提取物溶液ph值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点(ph＝5.3)，静置10h，然后在3℃，5000r/min下离心8min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白。
步骤(3)中，优选sephadexg-75分级条件为：26mm×780mm层析柱，用缓冲液洗脱，上样浓度200mg/ml，上样体积3ml，泵流速5bv/min，洗脱的溶液用部分收集器分步收集，每管收集2.0ml，将同一组分收集合并，进行透析36h后，浓缩冷冻干燥，将得到的硒含量高的组分作为进一步纯化样品上纤维素deae-ff柱。
步骤(3)中，deae-ff分级条件为：以0-1mol/lnacl梯度洗脱，上样浓度10mg/ml，上样体积3ml，泵流速5bv/min，每管收集1.5ml，将同一组分收集合并，得到蛋白分离组分，透析36h，浓缩冷冻干燥，得到初级硒蛋白。
(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用c18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
本发明的积极效果如下：
(1)终产物硒蛋氨酸纯度高，色泽好。
(2)纯化步骤少，产物抗氧化性好。
(3)提取和纯化过程中，几乎没有环境污染。
附图说明
图1为硒蛋白酶解产物光谱图。
图2为冻干后硒蛋氨酸光谱图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。
实施例1
(1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡80min，料液比为1:23，然后开始加热，在60℃下超声提取40min，超声频率40hz,待滤液温度降低至40℃，然后进行过滤，滤液调节ph至6.5，加入一定比例的乳酸菌进行发酵，发酵时间4.3h，过滤减压低温干燥，得到壶瓶碎米荠粗蛋白粉末；
(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为10:300-g/ml，加入0.5%的活性炭，1300r/min速度搅拌17分钟，然后过滤调壶瓶碎米荠提取物溶液ph值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置13h，然后在4℃，5500r/min下离心10min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用sephadexg-50凝胶柱层析和deae-ff阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化所含的初级蛋白。
(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用c18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
实施例2
(1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡60min，料液比为1:30，然后开始加热，在75℃下超声提取60min，超声频率40hz,待滤液温度降低至45℃，然后进行过滤，滤液调节ph至5.3，加入一定比例的乳酸菌进行发酵，发酵时间4h，过滤减压低温干燥，得到壶瓶碎米荠粗蛋白粉末；
(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为13:500g/ml，加入1.5%的活性炭，900r/min速度搅拌15分钟，然后过滤调壶瓶碎米荠提取物溶液ph值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置12h，然后在3℃，6500r/min下离心9min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用sephadexg-75凝胶柱层析和deae-ff阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化所含的初级蛋白。
(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用c18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
实施例3
(1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡100min，料液比为1:16，然后开始加热，在75℃下超声提取55min，超声频率40hz,待滤液温度降低至45℃，然后进行过滤，滤液调节ph至5.2，加入一定比例的乳酸菌进行发酵，发酵时间4h，过滤减压低温干燥，得到壶瓶碎米荠粗蛋白粉末；
(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为11:650g/ml，加入0.8%的活性炭，900r/min速度搅拌25分钟，然后过滤调壶瓶碎米荠提取物溶液ph值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置13h，然后在4℃，5900r/min下离心11min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用sephadexg-150凝胶柱层析中的一种或多种和deae-ff阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化所含的初级蛋白。
(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用c18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
1.一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：所述方法的具体步骤如下：
(1)壶瓶碎米荠提取物的制备：
将干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过筛，然后往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡60-120min，料液比为1:10-50，然后开始加热，在50-90℃下超声提取40-80min，超声频率40hz,待滤液温度降低至40-50℃，然后进行过滤，滤液调节ph至3-8，加入一定比例的乳酸菌进行发酵，发酵时间3h-6h，过滤减压低温干燥，得到壶瓶碎米荠粗蛋白粉末；
(2)壶瓶碎米荠提取物的脱色：
将步骤(1)制备的壶瓶碎米荠提取物粉末溶于蒸馏水中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为5-15:200-800g/ml，加入0.5-2%的活性炭，500-2000r/min速度搅拌10-30分钟，然后过滤调壶瓶碎米荠提取物溶液ph值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置10-15h，然后在2-6℃，5000-7000r/min下离心8-12min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白；
(3)壶瓶碎米荠粗蛋白的分级纯化：
将步骤(2)获得的脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，使用sephadexg-50、75、100、150凝胶柱层析中的一种或多种和deae-ff阴离子交换柱层析，经分级纯化得到本发明的壶瓶碎米荠纯化所含的初级蛋白。
2.(4)壶瓶碎米荠粗蛋白的水解：
将步骤(3)获得的初级蛋白，加入中性蛋白酶水解，利用c18反相色谱柱，进行精制获得硒蛋氨酸。
3.(5)壶瓶碎米荠的硒蛋氨酸分离与纯化：
将步骤(4)获得的硒蛋氨酸，进行水洗和冻干，即获得高纯度硒蛋氨酸。
4.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，干燥的壶瓶碎米荠进行粉碎过20-80目筛。
5.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，往壶瓶碎米荠粉末中加入清水浸泡60-120min，料液比为1:10-50。
6.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，在50-90℃下超声提取40-80min。
7.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，进行100目过滤，滤液进行减压低温干燥。
8.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，壶瓶碎米荠提取物粉末与蒸馏水的重量体积比为5-15:200-800g/ml。
9.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，用氯化铵调节壶瓶碎米荠提取物溶液ph值至壶瓶碎米荠蛋白的等电点，静置10-15h，然后在2-6℃，5000-7000r/min下离心8-12min，收集沉淀并真空冷冻干燥，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白，得到脱色后的壶瓶碎米荠粗蛋白。
10.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，sephadexg-50、75、100、150凝胶柱层析中的一种或多种，分级条件为：26mm×780mm层析柱，用缓冲液洗脱，上样浓度200mg/ml，上样体积2-5ml，泵流速5bv/min，洗脱的溶液用部分收集器分步收集，每管收集2.0ml，将同一组分收集合并，进行透析24-48h后，浓缩冷冻干燥，将得到的硒含量高的组分作为进一步纯化样品上纤维素deae-ff柱。
11.如权利要求1所述的一种从壶瓶碎米荠中提取、分离纯化硒蛋氨酸的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，deae-ff分级条件为：以0-1mol/lnacl梯度洗脱，上样浓度10mg/ml，上样体积2-5ml，泵流速5bv/min，每管收集1.5ml，将同一组分收集合并，得到蛋白分离组分，透析24-48h，浓缩冷冻干燥，得到初级硒蛋白。
技术总结