本发明涉及利用丟糟发酵生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的方法，属于生物及化学工程技术领域。
背景技术：
6-戊基-2h-吡喃-2-酮(6-pentylpyran-2-one)，分子式为c10h14o2，结构式如下，沸点85℃(333pa)，溶于油脂，不溶于水。
6-戊基-2h-吡喃-2-酮呈蘑菇、蓝干酪、椰香或乳品香气，具有风味化合物和生物活性物的双重特性，是一种极具价值的食品添加剂，但供给却有限。6-戊基-2h-吡喃-2-酮天然存在于部分水果和中草药中，也可以通过化学合成和微生物发酵等方式获得。已报道能够代谢产生6-戊基-2h-吡喃-2-酮的微生物常见为木霉属trichoderma。利用微生物代谢生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮，并加以提取和应用，是解决该化合物供给缺陷的有效途径。
丟糟是传统固态酿造白酒，酒醅蒸酒后丢弃的糟醅，是酿酒的副产物。目前，我国白酒年产量600多万吨，丟糟年产量高达1800多万吨。虽然丟糟中尚残留有不少的营养物质，但由于含40～50％的发酵填充物稻壳，而稻壳主要成分为粗纤维，因此限制了丟糟的回收利用。此外，丟糟含有60％左右的水分，贮存困难，易霉变，常常只能作为废弃物丢掉，既污染环境，又造成了极大的资源浪费。因此，提供丟糟的更多利用途径，提高其应用价值，具有很大的环保效益和经济效益。
技术实现要素：
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供用于生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的发酵培养基。本发明的第二个目的在于提供生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的发酵原料。本发明的第三个目的在于提供6-戊基-2h-吡喃-2-酮的生产方法。本发明的第四个目的在于提供丟糟的新用途。
本发明提供了用于生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的发酵培养基，含有丟糟和粮食，所述的粮食选自高粱、小麦、大米、玉米、糯米中至少一种。
进一步地，丟糟：粮食的重量比为10：(1～10)。
优选地，丟糟：粮食的重量比为10：(1～3)。
进一步地，所述的丟糟为酿造浓香型白酒产生的丟糟。
优选地，酿造所述浓香型白酒的原料主要由高粱、小麦、大米、糯米和玉米组成。
本发明提供了生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的发酵原料，它是将能够代谢产生6-戊基-2h-吡喃-2-酮的木霉属菌trichoderma接种到所述的发酵培养基中得到的。
进一步地，所述的发酵原料由下述方法得到：取丟糟和粮食，加水混合均匀，灭菌，冷却，接入接种了所述木霉属菌的种子培养基，即得。
优选地，所述的灭菌于120℃高压灭菌30min。
进一步地，所述的种子培养基由下述方法制备得到：按丟糟：高粱：水质量比10:10:6混合均匀，灭菌，冷却，取所述木霉属菌的菌丝进行接种，接种量10％，即得。
其中，制备种子培养基所使用的丟糟优选为酿造浓香型白酒产生的丟糟。
进一步优选地，酿造所述浓香型白酒的原料主要由高粱、小麦、大米、糯米和玉米组成。
优选地，所述的灭菌于120℃高压灭菌30min。
优选地，接种所述木霉属菌后于26℃恒温培养5天。
进一步地，所述种子培养基的接入量占发酵原料重量的10％～20％。
进一步地，粮食：水的重量比为10：(6～10)。
进一步地，所述的木霉属菌为绿色木霉trichodermaviride。
优选地，所述的木霉属菌为绿色木霉wly-l-m-01cgmccno.20254。
本发明提供了6-戊基-2h-吡喃-2-酮的生产方法，包括如下步骤：取所述的发酵原料，发酵培养，提取发酵产生的6-戊基-2h-吡喃-2-酮，将粗提物进行纯化，即得。
进一步地，所述发酵培养满足以下至少一项：
培养温度为26～30℃；
培养周期为15～20天。
进一步地，所述提取满足以下至少一项：
提取溶剂为甲醇和/或乙醇；
提取次数为2～3次；
对于每次提取，提取溶剂体积：待提取原料重量＝(3～5)：1，ml/g；
对于每次提取，提取时间为20～40min；
提取方式为震荡提取或超声提取；
提取温度为10～30℃。
进一步地，所述纯化包括如下步骤：
a、将粗提物以石油醚和/或乙酸乙酯进行液液萃取，浓缩萃取液，得到二次萃提物；
b、将二次萃提物进行正相层析，收集含有6-戊基-2h-吡喃-2-酮的洗脱液，浓缩，得到粗品；
c、将粗品进行反相色谱分离，收集含有6-戊基-2h-吡喃-2-酮的洗脱液，浓缩，即得6-戊基-2h-吡喃-2-酮。
进一步地，所述的正相层析满足以下至少一项：
固定相采用正相硅胶；
优选地，所述的正相硅胶为100～300目；
以石油醚为洗脱试剂。
进一步地，所述的反相色谱分离满足以下至少一项：
采用制备色谱；
固定相为c18柱；
流动相为甲醇和/或乙醇与水的混合溶剂；
采用梯度洗脱，流动相依次为：0～1min：20％v/v甲醇和/或乙醇；1.1～5min：20～100％v/v甲醇和/或乙醇；5.1～15min：100％v/v甲醇和/或乙醇；15.1～17min：20％v/v甲醇和/或乙醇；停止洗脱；
色谱流速为10～20ml/min；
优选地，色谱流速为10ml/min。
进一步地，步骤a、步骤b、步骤c于40～80℃进行浓缩。
其中，以甲醇和/或乙醇作为提取溶剂，提取效率高，同时原料中的糖类、蛋白质等成分不易进入有机溶剂体系，可以实现初步除杂。
其中，以石油醚和/或乙酸乙酯作为液液萃取溶剂，目标物6-戊基-2h-吡喃-2-酮能有效进入有机溶剂中，萃取效率高。同时，乙醇和/或甲醇粗提物中的水分及水溶性成分能够与目标物有效分离，可以进一步实现除杂。
其中，洗脱液收集方式为紫外吸收峰收集，紫外吸收波长为290～310nm。
其中，于40～80℃进行浓缩，既能减少浓缩过程中目标物6-戊基-2h-吡喃-2-酮的损失，又能达到目标物的浓缩目的。
本发明提供了丟糟在制备发酵生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的培养基中的用途。
进一步地，所述的丟糟为酿造浓香型白酒产生的丟糟。
优选地，酿造所述浓香型白酒的原料主要由高粱、小麦、大米、糯米和玉米组成。
进一步地，所述的培养基是能够代谢产生6-戊基-2h-吡喃-2-酮的木霉属菌trichoderma的培养基。
进一步地，所述的木霉属菌为绿色木霉trichodermaviride。
优选地，所述的木霉属菌为绿色木霉wly-l-m-01cgmccno.20254。
本发明提供的6-戊基-2h-吡喃-2-酮的生产方法，主要具有以下优点：
1、本发明创新性地采用酿酒副产物丟糟作为发酵培养基组分。以丟糟为底物，木霉菌能够大量代谢产生6-戊基-2h-吡喃-2-酮，产率高。而且，将丟糟循环利用来生产高价值的6-戊基-2h-吡喃-2-酮，具有很大的经济效益和环保效益。
2、本发明发酵所使用的木霉菌在酿酒生产环境容易得到，能适应酿酒生产环境，能利用酿酒副产物丟糟来大量代谢产生6-戊基-2h-吡喃-2-酮，产率高。
3、本发明6-戊基-2h-吡喃-2-酮的生产方法中所采用的提取工艺简单高效，纯化工艺结合正向层析和反相色谱，能够实现粗品中6-戊基-2h-吡喃-2-酮与杂质的有效分离。
附图说明
图1为实施例1中标准溶液浓度为1000μg/l时6-戊基-2h-吡喃-2-酮的总离子流图及提取离子流图；
图2为实施例1中样品3#的总离子流图及提取离子流图；
图3为实施例1中样品1#的总离子流图及提取离子流图；
图4为实施例1中样品2#的总离子流图及提取离子流图；
图5为对比例1和对比例2中混合培养基组成对产率的影响对比图；
图6为对比例3中发酵周期对产率的影响对比图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例及对比例中使用的丟糟为酿造多粮浓香型白酒产生的丟糟，酿酒原料以高粱、小麦、大米、糯米和玉米为主。
实施例及对比例中使用的绿色木霉trichodermaviridewly-l-m-01由发明人从四川宜宾市五粮液技术中心实验室的酿酒生产环境空气中采集得到，保藏编号为cgmccno.20254，保藏时间为2020年9月2日，保藏中心为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
一、上述绿色木霉菌株的筛选方法
采集培养基：乳酸2％，葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯霉素0.01％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
pda琼脂培养基：葡萄糖1％，蛋白胨0.5％，磷酸二氢钾0.1％，硫酸镁0.05％，氯霉素0.01％，琼脂2％，蒸馏水配制，ph自然，121℃高压灭菌20min。
利用重力沉降法，将制备好的采集培养基100ml，于四川宜宾市五粮液技术中心实验室敞口放置6小时，无菌纱布封口后于28℃恒温培养5天，培养基中长出疑是木霉属丝状菌体，接种环挑取菌体于pda琼脂培养基中，编号并划线纯化，重复纯化2～3次，直至平板上的菌落都为同一形态。挑取单菌落制成水浸片，于显微镜下观察菌体细胞形态，环境木霉分离纯化完成，斜面试管保存于4℃冰箱。
二、上述绿色木霉菌株的形态特征及分子鉴定
1、菌落及菌体形态观察
将经活化的木霉属新菌株用接种环划线接种于pda培养基上，28℃培养3d，观察菌落形态特征；挑取菌丝，以乳酸石炭酸棉蓝染色液进行染色制片，于显微镜下观察菌体细胞特征。
菌落形态特征：菌落圆形、呈白色菌丝发散状，中心出现绿色孢子。
菌体细胞特征：可见分生孢子梗，分生孢子梗有隔膜，垂直或锐角对称分枝，产生分生孢子，分生孢子单生或簇生，圆形或卵形。
2、分子鉴定
提取菌株基因组dna，选用its通用引物对正向引物its1：tccgtaggtgaacctgcgg(seqidno:2)、反向引物its4:tcctccgcttattgatatgc(seqidno:3)扩增基因组dna，反应条件为：95℃预变性5min后,进入以下循环：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。经2％琼脂糖凝胶电泳鉴定结果良好。将pcr扩增产物寄送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，将测序结果在ncbi数据库上进行blast序列比对，确定为绿色木霉，并命名为wly-l-m-01。该菌株已于2020年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.20254，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。该菌株的its序列如seqidno:1所示：tttcctccggctattgatatgcttaagttcagcgggtattcctacctgatccgaggtcaacatttcagaagttgggtgttttacggacgtggacgcgccgcgctcccggtgcgagttgtgcaaactactgcgcaggagaggctgcggcgagaccgccactgtatttcggggccgggatcccgtcttaggggctcccgaggtccccaacgccgaccccccggaggggttcgagggttgaaatgacgctcggacaggcatgcccgccagaatactggcgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttgattcattttgaatttttgctcagagctgtaagaaataacgtccgcgaggggactacagaaaagagtttggttggtccctccggcgggcgcctggttccggggctgcgacgcacccggggcgtgaccccgccgaggcaacagtttggtatggttcacattgggtttgggagttgtaaactcggtaatgatccctccgcaggttcaccctacggaaggat。
实施例16-戊基-2h-吡喃-2-酮的生产
称取丟糟750g，置于3l的不锈钢桶中，加入200g高粱粉，200g水，混匀，纱布封口，于120℃灭菌30分钟。灭菌结束后，取出，倒入已灭菌浅盘中冷却至30℃以下，无菌条件下，接入230g种子培养基并混匀，放置于28℃恒温培养，间歇喷洒无菌水并搅拌。种子培养基的制备方法如下：丟糟：高粱：水质量比为10:10:6，按比例混合均匀，120℃高压灭菌30min，冷却后，用接种环挑取绿色木霉平板菌丝接种到种子培养基，接种量10％，26℃恒温培养5天。
取出培养15天的发酵培养基1000g于5l不锈钢桶中，加入3l乙醇，在常温下超声提取40min，过滤，反复提取并过滤三次，滤液于65℃旋转蒸发浓缩，得粗提物600g。
取粗提物，以石油醚1l进行萃取，反复两次，萃取液于30℃旋转蒸发浓缩，得二次萃提物12.5g。
将二次萃提物与100～200目正相硅胶均匀搅拌，200～300目正向硅胶装柱，进行正相柱层析。以石油醚为洗脱试剂，每50ml单独进行一次收集。洗脱液进行液相质谱检测，将确定6-戊基-2h-吡喃-2-酮的洗脱液合并，40℃减压浓缩，干燥，得到粗品s1-17。
将粗品s-17用甲醇稀释，进样制备色谱，进样量为5ml，以c18柱为固定相，甲醇和水的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱。洗脱时流动相组成依次为：0～1min：20％v/v甲醇；1.1～5min：20～100％v/v甲醇(仪器自动实现梯度变化)；5.1～15min：100％v/v甲醇；15.1～17min：20％v/v甲醇；停止洗脱。色谱流速为10ml/min。收集在紫外吸收波长300nm处有吸收峰的段。洗脱液进行液相质谱检测，将确定为6-戊基-2h-吡喃-2-酮的洗脱液合并，55℃减压浓缩，干燥，得到组分z1-9。
所得到的组分z1-9溶解于甲醇中，以6-戊基-2h-吡喃-2-酮标准品作为参比，质谱定量，产品纯度为98％。总共得到纯品1.12g，发酵产率为1276mg/l，提取纯化效率87.77％。
另外，在实施例1纯化过程各阶段进行取样对比，液质检测，样品1#：乙醇粗提物；样品2#：粗品s1-17；样品3#：纯品组分z1-9。标准溶液浓度为1000μg/l时6-戊基-2h-吡喃-2-酮的总离子流图及提取离子流图见图1，样品3#的总离子流图及提取离子流图见图2，样品1#的总离子流图和提取离子流图见图3，样品2#的总离子流图和提取离子流图见图4。图1～图4中横坐标均表示时间/min，纵坐标均表示离子强度。从图中可以看出，样品1#中存在较多的强极性和弱极性杂质；经过正相硅胶柱分离，样品2#中已完全除去强极性杂质和大部分的弱极性杂质；再经过反相制备柱分离，样品3#的谱图中除6-戊基-2h-吡喃-2-酮外，已无其它杂质峰。
实施例26-戊基-2h-吡喃-2-酮的生产
称取丟糟1000g，置于3l的不锈钢桶中，加入100g混合粮粉(高粱、大米、糯米、玉米、小麦)，60g水，混匀，纱布封口，于120℃灭菌30分钟。灭菌结束后，取出，倒入已灭菌浅盘中冷却至30℃以下，无菌条件下，接入220g种子培养基并混匀，放置于26℃恒温培养，间歇喷洒无菌水并搅拌。种子培养基的制备方法如下：丟糟：高粱：水质量比为10:10:6，按比例混合均匀，120℃高压灭菌30min，冷却后，用接种环挑取绿色木霉平板菌丝接种到种子培养基，接种量10％，26℃恒温培养5天。
取出培养20天的发酵培养基1000g于5l不锈钢桶中，加入5l甲醇，在常温下超声提取30min，过滤，反复提取并过滤两次，滤液于55℃旋转蒸发浓缩，得粗提物580g。
取粗提物，以乙酸乙酯1.5l进行萃取，反复三次，萃取液于40℃旋转蒸发浓缩，得二次萃提物18.8g。
将二次萃提物与100～200目正相硅胶均匀搅拌，200～300目正向硅胶装柱，进行正相柱层析。以石油醚为洗脱试剂，每50ml单独进行一次收集。洗脱液进行液相质谱检测，将确定6-戊基-2h-吡喃-2-酮的洗脱液合并，50℃减压浓缩，干燥，得到粗品s2-19。
将粗品s2-19用甲醇稀释，进样制备色谱，进样量为5ml，以c18柱为固定相，乙醇和水的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱。洗脱时流动相组成依次为：0～1min：20％v/v乙醇；1.1～5min：20～100％v/v乙醇(仪器自动实现梯度变化)；5.1～15min：100％v/v乙醇；15.1～17min：20％v/v乙醇；停止洗脱。色谱流速为10ml/min。收集在紫外吸收波长290nm处有吸收峰的段。洗脱液进行液相质谱检测，将确定为6-戊基-2h-吡喃-2-酮的洗脱液合并，60℃减压浓缩，干燥，得到组分z2-8。
所得到的组分z2-8溶解于甲醇中，以6-戊基-2h-吡喃-2-酮标准品作为参比，质谱定量，化合物纯度为97％。总共得到纯品0.90g，发酵产率为1016mg/l，提取纯化效率88.58％。
对比例1混合培养基中去掉粮食
按照实施例1的方法生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮，区别只在于将最初加入的200g高粱粉替换为同等质量的丟糟，同时由于无需与粮食混匀，不用再加水。经检测，6-戊基-2h-吡喃-2-酮的发酵产率为125mg/l，见图5条件①。
对比例2混合培养基中去掉丟糟
按照实施例1的方法生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮，区别只在于将最初加入的丟糟750g替换为同等质量的高粱粉。经检测，6-戊基-2h-吡喃-2-酮的发酵产率为645mg/l，见图5条件②。
通过比较可以看出，对比例2中由于没有添加丟糟，主要由高粱制成培养基，结果6-戊基-2h-吡喃-2-酮的产率较实施例1大幅降低。对比例1主要以丟糟制成培养基，但由于没有添加粮食原料，6-戊基-2h-吡喃-2-酮的产率也非常低。可见，实施例1以丟糟和粮食原料的混合物作为发酵培养基，微生物的生长代谢情况最好，由此得到了较高的发酵产率。
对比例3发酵条件的优化
按照实施例1的方法配制发酵培养基，区别只在于发酵培养的培养周期不同，分别培养7天、9天、12天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天，检测6-戊基-2h-吡喃-2-酮的发酵产率。以6-戊基-2h-吡喃-2-酮产率为纵坐标，培养天数为横坐标作图，结果见图6。
从图中可以看出，发酵培养15～20天时6-戊基-2h-吡喃-2-酮的发酵产率较高，优于采用其它培养周期所得达到的效果。
需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。
序列表
<110>宜宾五粮液股份有限公司
<120>利用丟糟发酵生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的方法
<130>a201144k
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>615
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tttcctccggctattgatatgcttaagttcagcgggtattcctacctgatccgaggtcaa60
catttcagaagttgggtgttttacggacgtggacgcgccgcgctcccggtgcgagttgtg120
caaactactgcgcaggagaggctgcggcgagaccgccactgtatttcggggccgggatcc180
cgtcttaggggctcccgaggtccccaacgccgaccccccggaggggttcgagggttgaaa240
tgacgctcggacaggcatgcccgccagaatactggcgggcgcaatgtgcgttcaaagatt300
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gatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttgattcattttgaatttttgctcag420
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accctacggaaggat615
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tccgtaggtgaacctgcgg19
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tcctccgcttattgatatgc20
1.用于生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的发酵培养基，其特征是：含有丟糟和粮食，所述的粮食选自高粱、小麦、大米、玉米、糯米中至少一种。
2.如权利要求1所述的发酵培养基，其特征是：丟糟：粮食的重量比为10：(1～10)；优选地，丟糟：粮食的重量比为10：(1～3)。
3.如权利要求1或2所述的发酵培养基，其特征是：所述的丟糟为酿造浓香型白酒产生的丟糟；优选地，酿造所述浓香型白酒的原料主要由高粱、小麦、大米、糯米和玉米组成。
4.生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的发酵原料，其特征是：它是将能够代谢产生6-戊基-2h-吡喃-2-酮的木霉属菌trichoderma接种到权利要求1～3任意一项所述的发酵培养基中得到的。
5.如权利要求4所述的发酵原料，其特征是：由下述方法得到：取丟糟和粮食，加水混合均匀，灭菌，冷却，接入接种了所述木霉属菌的种子培养基，即得。
6.如权利要求5所述的发酵原料，其特征是：所述的种子培养基由下述方法制备得到：按丟糟：高粱：水质量比10:10:6混合均匀，灭菌，冷却，取所述木霉属菌的菌丝进行接种，接种量10％，即得；优选地，接种所述木霉属菌后于26℃恒温培养5天。
7.如权利要求5所述的发酵原料，其特征是：所述种子培养基的接入量占发酵原料重量的10％～20％。
8.如权利要求5所述的发酵原料，其特征是：粮食：水的重量比为10：(6～10)。
9.如权利要求4～6任意一项所述的发酵原料，其特征是：所述的木霉属菌为绿色木霉trichodermaviride；优选地，所述的木霉属菌为绿色木霉wly-l-m-01cgmccno.20254。
10.6-戊基-2h-吡喃-2-酮的生产方法，其特征是：包括如下步骤：取权利要求4～9任意一项所述的发酵原料，发酵培养，提取发酵产生的6-戊基-2h-吡喃-2-酮，将粗提物进行纯化，即得。
11.如权利要求10所述的生产方法，其特征是：所述发酵培养满足以下至少一项：
培养温度为26～30℃；
培养周期为15～20天。
12.如权利要求10所述的生产方法，其特征是：所述提取满足以下至少一项：
提取溶剂为甲醇和/或乙醇；
提取次数为2～3次；
对于每次提取，提取溶剂体积：待提取原料重量＝(3～5)：1，ml/g；
对于每次提取，提取时间为20～40min；
提取方式为震荡提取或超声提取；
提取温度为10～30℃。
13.如权利要求10所述的生产方法，其特征是：所述纯化包括如下步骤：
a、将粗提物以石油醚和/或乙酸乙酯进行液液萃取，浓缩萃取液，得到二次萃提物；
b、将二次萃提物进行正相层析，收集含有6-戊基-2h-吡喃-2-酮的洗脱液，浓缩，得到粗品；
c、将粗品进行反相色谱分离，收集含有6-戊基-2h-吡喃-2-酮的洗脱液，浓缩，即得6-戊基-2h-吡喃-2-酮。
14.如权利要求13所述的生产方法，其特征是：所述的正相层析满足以下至少一项：
固定相采用正相硅胶；
优选地，所述的正相硅胶为100～300目；
以石油醚为洗脱试剂。
15.如权利要求13所述的生产方法，其特征是：所述的反相色谱分离满足以下至少一项：
采用制备色谱；
固定相为c18柱；
流动相为甲醇和/或乙醇与水的混合溶剂；
采用梯度洗脱，流动相依次为：0～1min：20％v/v甲醇和/或乙醇；1.1～5min：20～100％v/v甲醇和/或乙醇；5.1～15min：100％v/v甲醇和/或乙醇；15.1～17min：20％v/v甲醇和/或乙醇；停止洗脱；
色谱流速为10～20ml/min；
优选地，色谱流速为10ml/min。
16.如权利要求13所述的生产方法，其特征是：步骤a、步骤b、步骤c于40～80℃进行浓缩。
17.丟糟在制备发酵生产6-戊基-2h-吡喃-2-酮的培养基中的用途。
18.如权利要求17所述的用途，其特征是：所述的丟糟为酿造浓香型白酒产生的丟糟；优选地，酿造所述浓香型白酒的原料主要由高粱、小麦、大米、糯米和玉米组成。
19.如权利要求17所述的用途，其特征是：所述的培养基是能够代谢产生6-戊基-2h-吡喃-2-酮的木霉属菌trichoderma的培养基。
20.如权利要求19所述的用途，其特征是：所述的木霉属菌为绿色木霉trichodermaviride；优选地，所述的木霉属菌为绿色木霉wly-l-m-01cgmccno.20254。
技术总结