本发明属于发酵工程技术领域，具体为一种水溶性红曲黄色素的发酵调控方法。
背景技术：
红曲色素是天然色素之一，由红曲菌发酵而得。红曲菌液态发酵所得色素大多数是胞内色素，使用有机溶剂提取，在生产过程与应用中均存在安全性问题。非水溶性色素作为食用色素在使用方面具有局限性。水溶性红曲黄色素是胞外水溶性色素，由红曲霉菌深层液体发酵经提取所得，具有天然无毒的特点，其在饮料、食品、粮食深加工等方面均具有广泛的应用前景。现阶段，微生物发酵法与植物提取法是生产天然黄色素的主要方法。我国发酵法生产红曲黄色素至今仍在开发研究阶段，市面上出售的水溶性红曲黄色素为半合成法制成，由发酵法生产的红曲红色素经磺化反应制备，非天然发酵而成。华南理工大学吴教授团队对发酵红曲黄色素研究较深入，胞外水溶性黄色素水平可达250u/ml左右。江南大学许教授团队研究的利用50l自控分酵罐发酵胞内黄色素水平达397u/ml。其它文献资料显示胞外水溶性黄色素发酵水平均偏低。
技术实现要素：
针对上述技术缺陷，本发明提供一种水溶性红曲黄色素的发酵调控方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，步骤如下：①将红曲霉菌种进行试管斜面活化扩大培养，再取孢子与菌丝体洗脱液接入一级种子培养基中，进行种子扩大培养，培养至对数生长期得种子液；②将步骤①的种子液按比例接入二级种子培养基，进行种子扩大培养，培养至对数生长期得二级种子液；③将步骤②所述的二级种子培养液按5-20％(v/v)的比例接入发酵培养基中发酵，溶氧≥20％，发酵2-4天，菌体湿重达到25-30g/l时，发酵温度控制31℃，ph通过20％氨水调控在4.0-4.5；发酵5-7天，发酵温度控制33℃，ph通过20％(wt)氨水调控在3.0-3.5的范围；发酵8-10天，发酵温度控制35℃，ph通过20％(wt)氨水调控在2.5-3.0的范围，发酵过程通过流加补糖液，控制还原糖在40-50g/l。说的发酵8-10天是过程调控点，最终的放罐周期可达13天，即好氧发酵时间为13天。发酵2-4天后，为了稳定菌体生长条件对ph与温度控制在菌体较适生长范围。之后通过梯度调控的方法，使菌体从生长阶段转向生产阶段，分泌产物。溶氧是相对值，在一定的发酵控制条件下，发酵0h校验值为100％，发酵过程微生物耗氧量相对于校验值来确定。
进一步：在上述水溶性红曲黄色素的发酵调控方法中，所述步骤③补糖液为60g/l的碳源水溶液。所述的碳源为淀粉、葡萄糖、麦芽糖、甘油中的至少一种。所述的碳源优选为葡萄糖、麦芽糖中的至少一种。所述步骤①红曲霉菌种为红色红曲霉(monascusruber)cgmccno.10910,或红曲霉菌(monascusanka)gim3.592。所述步骤①试管斜面培养基组成为每100ml斜面培养基中含玉米粉5g，豆浓10ml，kh2po40.5g，mgso40.2g,琼脂2g，饮用水定容100ml，ph自然。
所述步骤①一级种子培养基组成为每100ml培养基中含可溶性淀粉5g,玉米粉2g，豆浓10ml，kh2po40.5g，mgso40.2g,饮用水定容100ml，ph自然。
所述步骤①活化方法为：以冻干菌粉或甘油保存菌液为出发，接种于试管斜面培养基，28℃，培养7-14天；斜面试管种子用10ml无菌水洗脱孢子与菌丝体得到洗脱液，吸5nl纳升洗脱液接入一级种子培养基中，30℃，100rpm培养24-32小时。
所述步骤②的二级种子培养基组成为每100ml种子培养基中含葡萄糖2g,玉米粉5g，豆浓10ml，nano30.5g，kh2po40.5g，mgso40.2g,饮用水定容100ml，ph自然；所述步骤②所述的二级种子培养条件为把步骤①的一级种子液按0.01-0.1％(v/v)的比例接入二级种子培养基中，28-32℃，300rpm培养40-60h，好氧发酵得到对数生长期的种子液。所述步骤③发酵培养基组成为每100ml培养基中含碳源5g,玉米粉0.5g，豆浓1ml，铵盐5g，硝酸盐3g，kh2po40.3g，mgso40.1g,mnso4·h2o5.0mg,饮用水定容100ml，ph自然。
本发明中，ph自然是指ph值不需要专门的酸碱调控，顺其自然的意思。好氧发酵是指菌体生长需要氧的发酵。
与现有技术相比，本方法通过发酵过程发酵条件的有效调控，根据红曲霉发酵过程的代谢生长特点，梯度改变发酵ph和温度，采用人为手段控制菌体在低ph及高无机氮环境下代谢以黄色素为主的天然色素。通过温度的，刺激菌体增强黄色素基因表达量，强化黄色素的分泌强度。在两者有效的结合调控，经好氧发酵，及流加有利于形成产物的补料入发酵液中，得到高产水溶性黄色素。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下操作中，未做详细说明的，均可按照分子生物学实验手册进行。
实施例1
①种子液制备：把红色红曲霉(monascusruber)cgmccno.10910,或红曲霉菌(monascusanka)gim3.592的冻干粉或甘油保存液接种于试管斜面培养基(每100ml斜面培养基中含玉米粉5g，豆浓10ml，kh2po40.5g，mgso40.2g,琼脂2g，饮用水定容100ml，ph自然。)，28℃，培养7-14天。斜面试管种子用10ml无菌水洗脱孢子与菌丝体，吸5nl接入一级种子培养基(每100ml培养基中含可溶性淀粉5g,玉米粉2g，豆浓10ml，kh2po40.5g，mgso40.2g,饮用水定容100ml，ph自然。)，30℃，100rpm培养24-32小时。一级种子液接0.01-0.1％(v/v)的比例接入二级种子培养基(每100ml种子培养基中含葡萄糖2g,玉米粉5g，豆浓10ml，nano30.5g，kh2po40.5g，mgso40.2g,饮用水定容100ml，ph自然。)，28-32℃，300rpm培养40-60h，好氧发酵得到对数生长期的种子液。
②发酵：二级种子培养液按5-20％的比例接入发酵培养基(每100ml培养基中含可溶性淀5g,玉米粉0.5g，豆浓1ml，铵盐5g，硝酸盐3g，kh2po40.3g，mgso40.1g,mnso4·h2o5.0mg,饮用水定容100ml，ph自然。)，发酵调控为：300-600rpm，通风比0.1-0.3，溶氧≥20％。发酵2-4天，菌体湿重达到25-30g/l时，发酵温度控制31℃，ph通过20％(wt)氨水调控在4.0-4.5的范围；发酵5-7天，发酵温度控制33℃，ph通过20％(wt)氨水调控在3.0-3.5的范围；发酵8-10天，发酵温度控制35℃，ph通过20％(wt)氨水调控在2.5-3.0的范围。发酵过程还原糖通过流加补糖液(60％葡萄糖液)控制在4-5％。
③水溶性红曲黄色素检测：放罐发酵液离心，10000rpm，10min，得出上清液，用纯水稀释1000倍，于紫外分光光度计测定特征波长350nm处的吸光值为0.500，计算得出水溶性红曲黄色素为500u/ml。
实施例2
①种子液制备：同实施例1步骤①。
②发酵：操作同实施例1步骤②，区别在于碳源由可溶性淀粉改为5％葡萄糖。补糖液改用50％麦芽糖溶液。
③水溶性红曲黄色素检测：同实施例1步骤③。于紫外分光光度计测定特征波长350nm处的吸光值为0.509，结果显示水溶性红曲黄色素为509u/ml。
实施例3：
①种子液制备：同实施例1步骤①。
②发酵：操作同实施例1步骤②，区别在于碳源由可溶性淀粉改为5％麦芽糖。补糖液改用60％葡萄糖液。
③水溶性红曲黄色素检测：检测方法同实施例1步骤③。于紫外分光光度计测定特征波长350nm处的吸光值为0.481，结果显示水溶性红曲黄色素为481u/ml。
显然，本发明实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明实施方式的限定。在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
1.一种水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，步骤如下：
①将红曲霉菌种进行试管斜面活化扩大培养，再取孢子与菌丝体洗脱液接入一级种子培养基中，进行种子扩大培养，培养至对数生长期得种子液；
②将步骤①的种子液按比例接入二级种子培养基，进行种子扩大培养，培养至对数生长期得二级种子液；
③将步骤②所述的二级种子培养液按5-20％(v/v)的比例接入发酵培养基中发酵，溶氧≥20％，发酵2-4天，菌体湿重达到25-30g/l时，发酵温度控制31℃，ph通过20％氨水调控在4.0-4.5；发酵5-7天，发酵温度控制33℃，ph通过20％(wt)氨水调控在3.0-3.5的范围；发酵8-10天，发酵温度控制35℃，ph通过20％(wt)氨水调控在2.5-3.0的范围，发酵过程通过流加补糖液，控制还原糖在40-50g/l。
2.根据权利要求1所述的水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，其特征在于：所述步骤③补糖液为60g/l的碳源水溶液。
3.根据权利要求2所述的水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，其特征在于：所述的碳源为淀粉、葡萄糖、麦芽糖、甘油中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，其特征在于：所述的碳源优选为葡萄糖、麦芽糖中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，其特征在于：所述步骤①红曲霉菌种为红色红曲霉(monascusruber)cgmccno.10910,或红曲霉菌(monascusanka)gim3.592。
6.根据权利要求1所述的水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，其特征在于：所述步骤①试管斜面培养基组成为每100ml斜面培养基中含玉米粉5g，豆浓10ml，kh2po40.5g，mgso40.2g,琼脂2g，饮用水定容100ml，ph自然；
所述步骤①一级种子培养基组成为每100ml培养基中含可溶性淀粉5g,玉米粉2g，豆浓10ml，kh2po40.5g，mgso40.2g,饮用水定容100ml，ph自然。
7.根据权利要求1所述的水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，其特征在于：所述步骤①活化方法为：以冻干菌粉或甘油保存菌液为出发，接种于试管斜面培养基，28℃，培养7-14天；斜面试管种子用10ml无菌水洗脱孢子与菌丝体得到洗脱液，吸5nl洗脱液接入一级种子培养基中，30℃，100rpm培养24-32小时。
8.根据权利要求1所述的水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，其特征在于：所述步骤②的二级种子培养基组成为每100ml种子培养基中含葡萄糖2g,玉米粉5g，豆浓10ml，nano30.5g，kh2po40.5g，mgso40.2g,饮用水定容100ml，ph自然。
9.根据权利要求1所述的水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，其特征在于：所述步骤②所述的二级种子培养条件为把步骤①的一级种子液按体积比0.01-0.1％的比例接入二级种子培养基中，28-32℃，300rpm培养40-60h，好氧发酵得到对数生长期的种子液。
10.根据权利要求1所述的水溶性红曲黄色素的发酵调控方法，其特征在于：所述步骤③发酵培养基组成为每100ml培养基中含碳源5g,玉米粉0.5g，豆浓1ml，铵盐5g，硝酸盐3g，kh2po40.3g，mgso40.1g,mnso4·h2o5.0mg,饮用水定容100ml，ph自然。
技术总结