本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法。
背景技术：
藻源葡聚糖又名副淀粉，是新资源食品纤细裸藻细胞内积累的β-1，3-葡聚糖颗粒。因其具有增强免疫、抑制肿瘤、降低尿酸缓解痛风症状、降低胆固醇等生理功能而被用作多种食品的营养补充剂。纤细裸藻可进行光合自养与利用有机异养为碳源的异养生长。目前纤细裸藻生产企业均是采用光合自养的方式进行培养生产，但存在生产效率低，生物量干重3g/l左右，藻源葡聚糖含量低的问题，约占细胞干重的20％左右。
检索文献发现，纤细裸藻的异养发酵培养基与酸碱ph条件早在上世纪60年代便已有文献报道，比如cramerandmyersmedium使用葡萄糖、琥珀酸、谷氨酸、乙酸做为碳源培养纤细裸藻；1966年hutner，s.h.-《methodsincellphysiology》第八章“culturemediaforeuglenagracilis”中记录的纤细裸藻异养发酵培养基使用苹果酸与葡糖糖等作碳源进行纤细裸藻异养培养；2009年bozidarsantek等在eng.lifesci.发表论文(9，23-28)报道了摇瓶与发酵罐中纤细裸藻异养发酵温度最佳范围为30摄氏度左右，最佳初始ph为3.0左右。2015年franjoi等在bioprocessbiosysteng杂志上发表论文(38，1103-1112)报道葡萄糖与玉米浆为最佳纤细裸藻的发酵碳源。
根据检索，发现以下两篇专利与本发明相关，分别是：
专利(申请号201810190981.9)“一种高密度发酵培养纤细裸藻的方法”，该发明优化了培养条件，采用传统的好氧发酵进行纤细裸藻的发酵培养。该方法采用葡萄糖、酵母提取物、玉米浆、谷氨酸钠或蛋白胨为碳源，碳氮源种类与上述文献报道的碳源无显著差异，培养条件中选用的温度与ph也与文献报道无显著差异；纤细裸藻的好氧发酵也是比较传统的发酵模式。在培养模式上采用的也是本领域比较传统的先种子培养再到发酵放大培养的过程。
专利(201810190982.3)“一种通过流加方法提高摇瓶发酵纤细裸藻产量的方法”，该发明中提出的流加碳氮源的方法为微生物发酵中的常规操作。
与以上两专利相比，本方法中采用未见报道且经济性与生长促进性能更加优良的果葡糖浆，纤细裸藻对其中的果糖成分的利用率与转化率较葡萄糖更高，大大缩短发酵时间的同时大幅度增加生物质产量；氮源除选用玉米浆外，还选用酵母浸粉或豆粕提取物补充玉米浆在维生素含量方面的缺陷；另一创新点为在细胞扩增3～5天后，生长进入稳定期，细胞密度不再提高后，进行单批次补料葡萄糖与乙醇，使用乙醇促进呼吸作用与阻断葡萄糖进入emp途径，使补加的葡萄糖进入葡聚糖合成途径而使细胞内葡聚糖的含量达到90％以上。另一方面，本方法使用食品行业广泛使用的单甘酯等表面活剂剂破碎细胞与去除胞内葡聚糖(副淀粉)颗粒表面的单层质膜，实现藻源葡聚糖的分离与纯化，保证食品安全的前提下实现了葡聚糖的经济提取。最后，本方法建立了藻源葡聚糖颗粒的喷雾干燥条件，可实现β-1，3-葡聚糖的非晶态颗粒的形成。
专利(cn201910558198.8)“一种纤细裸藻的培养方法”，该发明中使用一个含有柠檬酸、无机盐与维生素b6与b12的培养基培养裸藻细胞，达到对数生长期后加入青霉素实现促进藻细胞生长的方法。而本发明中采用果葡糖浆等有机碳源，提供了葡聚糖的经济安全提取纯化方法。
专利(cn107686813a)“一种裸藻高密度培养方法”该发明使用含有酵母粉与蛋白胨以及无机盐与维生素的培养基，在led光源下实现同时进行光合作用与异养生长的兼性营养，实现藻细胞的高密度培养。而本发明为发酵罐中进行的无光纯异养。
专利(cn111334434a)“一种裸藻培养基及其应用”该发明提供了一种无机培养基，实现裸藻的培养与浓缩，但其无机盐种类与文献报道中的盐分种类并无显著不同。而本发明为使用果葡糖浆与豆粕提取物等有机物的异养无光发酵。
专利(cn106867909a)“一种纤细裸藻的培养方法”该发明使用葡萄糖与酵母粉作为碳氮源与无机盐作为培养基质，通过放料后补充营养基质实现藻细胞高密度培养，所述培养基为文献中常见培养基。而本发明使用未见报道与使用的果葡糖浆、酵母浸粉等作为营养基质采用间断补料与乙醇诱导的方式扩增高葡聚糖含量的藻细胞，使用食用表面活性剂分离提取多糖。
技术实现要素：
本发明内容是为了解决现有的藻源葡聚糖生产中存在的发酵效率低，培养基质价格高与发酵周期长导致的生产成本过高的问题，以及分离提取方法缺失的问题，而提供了一种藻源葡聚糖发酵生产的方法。
一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，按以下步骤进行：
一、配制果葡糖浆种子液并接种纤细裸藻。
二、接种浓度为每毫升种子培养液含104～105个纤细裸藻细胞，25～32摄氏度培养3～5天，通气使溶氧do值保持在10％以上，制备成每毫升含纤细裸藻细胞1×107以上的种子液。
三、配制果葡糖浆培养液。
四、按10～15％接种种子液，通气使溶氧do值保持在10％以上，25～32摄氏度培养1天后补料，继续培养3～4天制备成每毫升含纤细裸藻细胞2×107以上的一次发酵液。
五、分批间断补料好氧发酵，获得二次发酵液。
六、β-1，3-葡聚糖浆分离提取纯化。
七、β-1，3-葡聚糖浆的二次纯化。
八、重复第七步。
九、喷雾干燥。
步骤一中果葡糖浆种子液的配制：每升种子培养液含果葡糖浆30～50g，玉米浆粉4～10g，酵母粉或酵母浸粉或豆粕提取物中的一种或多种的混合2～5g，维生素b10.1～0.8mg，维生素b120.1～1μg/l，加入磷酸调节ph至3.0。果葡糖浆采用115摄氏度灭菌15min；玉米浆粉与酵母粉或酵母浸粉或豆粕提取物中的一种或多种的混合采用121摄氏度灭菌20min，采用0.22μm无菌膜过滤对维生素b1与维生素b12除菌。
步骤三中果葡糖浆培养液的配制：每升培养液含果葡糖浆30～50g，玉米浆粉4～10g，酵母粉或酵母浸粉或豆粕提取物中的一种或多种的混合2～5g，维生素b10.1～0.8mg，维生素b120.1～1μg/l，加入磷酸调节ph至3.0。
步骤四中所述培养1天后补料：培养一天后向每升培养液中加入果葡糖浆20～30g，玉米浆粉4～10g，酵母粉或酵母浸粉或豆粕提取物中的一种或多种的混合2～5g，维生素b10.1～0.8mg，维生素b120.1～1μg/l，加入盐酸调节ph至3.0。
果葡糖浆种子液与培养液中的果葡糖浆为干物质含量大于70％的f42型和/或f55型和/或f60型和/或果糖含量不低于40％的果糖与葡萄糖的混合物。
步骤五中所述的分批间断补料好氧发酵为一次发酵液中补加5～10g的葡萄糖与2～10ml的乙醇，后继续培养15-24h；通气使溶氧do值保持在10％以上；25～32摄氏度培养。
步骤六中所述的β-1，3-葡聚糖浆分离提取纯化：为将步骤五中获得的二次发酵液经过离心机离心浓缩，获得藻细胞浓缩液，向每升浓缩液加入0.01～5g的表面活性剂，50～100转速下搅拌消解1～5小时，后离心收集，获得一次β-1，3-葡聚糖浆。表面活性剂为但不限于单甘酯、蔗糖酯、吐温、去氧胆酸钠、聚甘油酯、司盘。
步骤七中所述的β-1，3-葡聚糖浆的二次纯化方法为向离心收集的β-1，3-葡聚糖浆里加入二倍体积的清水，50～100转速下搅拌5min，后离心收集，获得二次β-1，3-葡聚糖浆。
步骤九中所述的喷雾干燥方法为向步骤八获得的三次β-1，3-葡聚糖浆加入清水至β-1，3-葡聚糖浆浓度至150～200g/l，喷雾干燥机进风温度160-250℃，蠕动泵转速30～60r/min，预加热温度控制在80～100℃。
具体实施方式
下面结合具体实施案例对本发明做进一步详细描述，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
实施步骤如下：
一、配制果葡糖浆种子液并接种纤细裸藻。
配制3l果葡糖浆种子液，按以下配比：f60型果葡糖浆(干物质含量77％)150g，玉米浆粉15g，酵母浸粉10g，维生素b10.3mg，维生素b120.3μg，加入磷酸调节ph至3.0。
采用115摄氏度15min对1.5l含有150g果葡糖浆的溶液灭菌；采用121摄氏度20min对1.5l含有15g玉米浆粉与10g酵母浸粉的溶液灭菌；采用0.22μm无菌膜对1ml含有0.3mg维生素b1与0.3μg维生素b12的溶液过滤除菌；最后将灭菌后的1.5l果葡糖浆，灭菌后的1.5l玉米浆粉与酵母浸粉溶液，过滤除菌后的维生素b1与维生素b12溶液混合，后转入5l发酵罐中，加入磷酸调节ph至3.0。
二、接种浓度为每毫升种子培养液含104～105个纤细裸藻白化株细胞，25～28摄氏度培养4天，通气使溶氧do值保持在30～35％，制备成每毫升含纤细裸藻细胞1.2×107的种子液。
三、配制30l果葡糖浆培养液。
配制30l果葡糖浆种子液，按以下配比：f60型果葡糖浆(干物质含量77％)1500g，玉米浆粉150g，酵母浸粉100g，维生素b13mg，维生素b123μg，加入磷酸调节ph至3.0。
灭菌处理方法为：采用115摄氏度15min对15l含有1500g果葡糖浆的溶液灭菌；采用121摄氏度20min对15l含有150g玉米浆粉与100g酵母浸粉的溶液灭菌；采用0.22μm无菌膜对10ml含有3mg维生素b1与3μg维生素b12的溶液过滤除菌；最后将灭菌后的15l果葡糖浆溶液，灭菌后的15l玉米浆粉与酵母浸粉溶液，过滤除菌后的维生素b1与维生素b12溶液混合，后转入50l发酵罐中，加入磷酸调节ph至3.0。
四、按10％接种，即将3l果葡糖浆种子液接种到30l果葡糖浆培养液中，通气使溶氧do值保持在30～35％，25～28摄氏度培养1天后补加如下成分：经过灭菌处理后的1500g果葡糖浆，经过灭菌处理的1l含有150g玉米浆粉与100g酵母浸粉的混合液，无菌膜过滤除菌后的10ml含有3mg维生素b1与3μg维生素b12的溶液；加入盐酸调节ph至3.0，通气使溶氧do值保持在30～35％，28摄氏度下继续培养3天制备成每毫升含纤细裸藻细胞3.3×107的一次发酵液。
灭菌处理方法为：1500g果葡糖浆的溶液经过115摄氏度15min灭菌；1l含有150g玉米浆粉与100g酵母浸粉的混合液经过121摄氏度20min灭菌。10ml含有3mg维生素b1与3μg维生素b12的溶液经过0.22μm无菌膜过滤除菌。
五、向一次发酵液组中补加1l经过灭菌处理后的含450g葡萄糖的溶液与150ml乙醇，通气使溶氧do值保持在20～30％；温度25～28摄氏度下继续培养24h。获得二次发酵液。
灭菌处理方法为：补料罐中1l含有450g葡萄糖的溶液经过121摄氏度20min灭菌。
六、将步骤五中获得的二次发酵液经过碟片离心机3000g离心浓缩，获得藻细胞浓缩液，向每升浓缩液加入2g的单甘酯，100转速下搅拌消解1～5小时后，3000g离心浓缩，获得一次β-1，3-葡聚糖浆。
七、向离心收集的一次β-1，3-葡聚糖浆里加入二倍体积的清水，50转速下搅拌5min后，3000g离心浓缩，获得二次β-1，3-葡聚糖浆。
八、重复步骤七一次，获得三次β-1，3-葡聚糖浆。
九、向三次β-1，3-葡聚糖浆中加入清水至β-1，3-葡聚糖浆浓度至150g/l，喷雾干燥机进风温度180℃，蠕动泵转速50r/min，预加热温度控制在80℃，进行喷雾干燥，获得648gβ-1，3-葡聚糖干粉，纯度99.2％。
实施例2
步骤二接种浓度为每毫升种子培养液含104～105个纤细裸藻野生绿色藻株细胞；步骤二中采用铝箔纸覆盖于5l发酵罐表面使发酵罐内部无外部光线进入，步骤三、四、五中使用的50l发酵罐为罐体内部无外部光线进入的不锈钢罐；其他与实施例1同。第九步获得483g葡聚糖藻粉，纯度99.1％
实施例3
一、配制果葡糖浆种子液并接种纤细裸藻。
配制30l果葡糖浆种子液，按以下配比：f60型果葡糖浆(干物质含量77％)1500g，玉米浆粉150g，酵母浸粉1000g，维生素b13mg，维生素b123μg，加入磷酸调节ph至3.0。
采用115摄氏度15min对15l含有1500g果葡糖浆的溶液灭菌；采用121摄氏度20min对15l含有150g玉米浆粉与100g豆粕提取物的溶液灭菌；采用0.22μm无菌膜对1ml含有3mg维生素b1与3μg维生素b12的溶液过滤除菌；最后将灭菌后的15l果葡糖浆，灭菌后的15l玉米浆粉与酵母浸粉溶液，过滤除菌后的维生素b1与维生素b12溶液混合，后转入50l发酵罐中，加入磷酸调节ph至3.0。
二、接种浓度为每毫升种子培养液含104～105个纤细裸藻白化株细胞，25～32摄氏度培养4天，通气使溶氧do值保持在30～35％，制备成每毫升含纤细裸藻细胞1.3×107的种子液。
三、配制300l果葡糖浆培养液。
配制30l果葡糖浆种子液，按以下配比：f60型果葡糖浆(干物质含量77％)15kg，玉米浆粉1500g，酵母浸粉1000g，维生素b130mg，维生素b1230μg，加入磷酸调节ph至3.0。
灭菌处理方法为：于补料罐中采用115摄氏度15min对150l含有15kg果葡糖浆的溶液灭菌；于补料罐中采用121摄氏度20min对150l含有1500g玉米浆粉与1000g酵母浸粉的溶液灭菌；采用0.22μm无菌膜对10ml含有30mg维生素b1与30μg维生素b12的溶液过滤除菌；最后将灭菌后的150l果葡糖浆溶液，灭菌后的15l玉米浆粉与酵母浸粉溶液，过滤除菌后的维生素b1与维生素b12溶液混合，分别转入500l发酵罐中，加入磷酸调节ph至3.0。
四、按10％接种，即将30l果葡糖浆种子液接种到300l果葡糖浆培养液中，通气使溶氧do值保持在30～35％，28摄氏度培养1天后补加如下成分：经过灭菌处理后的15kg果葡糖浆，经过灭菌处理的10l含有1500g玉米浆粉与1000g酵母浸粉的混合液，无菌膜过滤除菌后的10ml含有30mg维生素b1与30μg维生素b12的溶液；加入盐酸调节ph至3.0，通气使溶氧do值保持在30～35％，28摄氏度下继续培养3天制备成每毫升含纤细裸藻细胞4.1×107的一次发酵液。
灭菌处理方法为：于补料罐中15kg果葡糖浆的溶液经过115摄氏度15min灭菌；于补料罐中10l含有150g玉米浆粉与100g酵母浸粉的混合液经过121摄氏度20min灭菌。10ml含有30mg维生素b1与30μg维生素b12的溶液经过0.22μm无菌膜过滤除菌。
五、向一次发酵液组中补加1l经过灭菌处理后的含4.5kg葡萄糖的溶液与1.5l乙醇，通气使溶氧do值保持在25～30％；温度28摄氏度下继续培养24h。获得二次发酵液。
灭菌处理方法为：补料罐中6l含有4.5kg葡萄糖的溶液经过121摄氏度20min灭菌。
六、将步骤五中获得的二次发酵液经过碟片离心机3000g离心浓缩，获得藻细胞浓缩液，向每升浓缩液加入2g的单甘酯，100转速下搅拌消解1～5小时后，3000g离心浓缩，获得一次β-1，3-葡聚糖浆。
七、向离心收集的一次β-1，3-葡聚糖浆里加入二倍体积的清水，50转速下搅拌5min后，3000g离心浓缩，获得二次β-1，3-葡聚糖浆。
八、重复步骤七一次，获得三次β-1，3-葡聚糖浆。
九、向三次β-1，3-葡聚糖浆中加入清水至β-1，3-葡聚糖浆浓度至150g/l，喷雾干燥机进风温度150℃，蠕动泵转速50r/min，预加热温度控制在80℃，进行喷雾干燥，获得8.21kgβ-1，3-葡聚糖干粉，纯度99.1％。
1.一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，其特征在于它按以下步骤进行：
一、配制果葡糖浆种子液并接种纤细裸藻。
二、接种浓度为每毫升种子培养液含104～105个纤细裸藻细胞，25～32摄氏度下培养3～5天，通气使溶氧do值保持在10％以上，制备成每毫升含纤细裸藻细胞1×107以上的种子液。
三、配制果葡糖浆培养液。
四、按10～15％接种种子液，通气使溶氧do值保持在10％以上，25～32摄氏度下培养1天后补料，继续培养3～4天制备成每毫升含纤细裸藻细胞2×107以上的一次发酵液。
五、分批间断补料好氧发酵，获得二次发酵液。
六、β-1，3-葡聚糖浆分离提取纯化。
七、β-1，3-葡聚糖浆的二次纯化。
八、重复步骤七一次，获得三次β-1，3-葡聚糖浆。
九、喷雾干燥。
2.如权利要求1所述的一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，其特征在于步骤一中果葡糖浆种子液的配制：每升种子培养液含果葡糖浆20～30g，玉米浆粉4～10g，酵母粉或酵母浸粉或豆粕提取物中的一种或多种的混合2～5g，维生素b10.1～0.8mg，维生素b120.1～1μg/l，加入磷酸调节ph至3.0。
3.如权利要求1所述的一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，其特征在于步骤三中果葡糖浆培养液的配制：每升种子培养液含果葡糖浆20～30g，玉米浆粉4～10g，酵母粉或酵母浸粉或豆粕提取物中的一种或多种的混合2～5g，维生素b10.1～0.8mg，维生素b120.1～1μg/l，加入磷酸调节ph至3.0。
4.如权利要求1所述的一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，其特征在于步骤四中所述培养1天后补料：培养一天后向每升培养液中加入果葡糖浆20～30g，玉米浆粉4～10g，酵母粉或酵母浸粉或豆粕提取物中的一种或多种的混合2～5g，维生素b10.1～0.8mg，维生素b120.1～1μg/l，加入盐酸调节ph至3.0。
5.如权利要求1所述的一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，其特征在于步骤一中果葡糖浆培养液中的果葡糖浆为干物质含量大于70％的f42型和/或f55型和/或f60型和/或果糖含量不低于40％的果糖与葡萄糖的混合物。
6.如权利要求1所述的一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，其特征在于步骤五中所述的分批间断补料好氧发酵为一次发酵液中补加5～10g的葡萄糖与2～10ml的乙醇，后继续培养15-24h；通气使溶氧do值保持在10％以上；25～32摄氏度下培养。
7.如权利要求1所述的一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，其特征在于步骤六中所述的β-1，3-葡聚糖浆分离提取纯化：为将步骤五中获得的二次发酵液经过离心机离心浓缩，获得藻细胞浓缩液，向每升浓缩液加入0.01～5g的表面活性剂，50～100转速下搅拌消解1～5小时，后离心收集，获得一次β-1，3-葡聚糖浆。
8.如权利要求1所述的一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，其特征在于权利要求7中所述的表面活性剂为但不限于单甘酯、蔗糖酯、吐温、去氧胆酸钠、聚甘油酯、司盘。
9.如权利要求1所述的一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，其特征在于步骤七中所述的β-1，3-葡聚糖浆的二次纯化：为向离心收集的β-1，3-葡聚糖浆里加入二倍体积的清水，50～100转速下搅拌5min，后离心收集，获得二次β-1，3-葡聚糖浆。
10.如权利要求1所述的一种藻源β-1，3-葡聚糖发酵生产方法，其特征在于步骤九中所述的喷雾干燥：为向步骤八获得的三次β-1，3-葡聚糖浆加入清水至β-1，3-葡聚糖浆浓度至150～200g/l，喷雾干燥机进风温度160-250℃，蠕动泵转速30～60r/min，预加热温度控制在80～100℃。
技术总结