本发明属于生物制药工艺领域，具体涉及一种腺苷的发酵制备工艺。
背景技术：
腺苷又称腺嘌呤核苷，化学名为6-氨基-9-β-d-呋喃核糖嘌呤，其化学结构式为
腺苷是人体细胞中具有重要生理功能的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸而参与心肌的能量代谢，同时还参与扩张动脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其他系统和组织均有生理作用。此外，腺苷还是用于合成三磷酸腺苷（atp）、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。国内市场需求量很大，具有十分广阔的发展前景。生物发酵法制备腺苷相对于化学合成法来说，具有绿色环保，工艺路线简单，节约成本，效率高等优势。
技术实现要素：
一株高产菌株bacillussubtilis-117腺苷的构建，设计sgrna序列（seqidno.1）,将所设计的序列与质粒pjoe8999进行全合成，并温转入bacillussubtiliatcc21616细胞。配置tsa培养基，配方如下：酪蛋白胰酶消化物15g/l，大豆粉木瓜蛋白酶消化物5g/l，氯化钠5g/l，琼脂15g/l。121℃灭菌20min，降温后过滤加入100mg/l卡那霉素，制备平板，并进行平板划线，挑选出阳性菌落送检测序后确认无误后获得bacillussubtilis-11。将所获得的菌株通过紫外诱变，挑选出高产菌株bacillussubtilis-117。
bacillussubtilis-117发酵制备工艺，它包括如下步骤：（1）发酵提取：将大孔树脂加入培养基中一起灭菌，进行发酵培养，细胞合成腺苷后，在发酵液中被大孔树脂吸附在其中。发酵结束后，用100目的筛网过滤发酵液，收集大孔树脂。（2）除杂：先用纯水洗去树脂表面残留的发酵液，然后将树脂装入层析柱，先用10%~20%乙醇洗脱除杂。（3）洗脱：用40%~70%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩。（4）脱色：加入浓缩液质量1%~2%的活性炭进行脱色，脱色温度70~80℃，脱色时间15~30min。（5）结晶分离：脱色液继续浓缩至腺苷含量为100g/l~150g/l，温度降至0~5℃，保冷4~6h，使得腺苷结晶析出，然后过滤分离，得到含量和纯度均在95%以上的腺苷成品。
具体实施方式
实施例1
一、发酵
1.菌种培养
（1）种子培养基：葡萄糖15g/l，酵母浸粉6g/l，胰蛋白胨12g/l，氯化钠12g/l；
（2）用一次性无菌接种针沾取甘油菌接入含有100ml已灭菌的种子培养基中，33℃，220rpm摇床培养16h，制备种子液；
2.发酵培养
（1）发酵培养基：蔗糖50g/l，硫酸铵6g/l，酵母膏8g/l，谷氨酸钠5g/l，七水硫酸镁3g/l，磷酸二氢钾1g/l，一水硫酸锰100mg/l，七水硫酸亚铁50mg/l，豆油10ml/l，sp850大孔吸附树脂20g/l，ph为6.8；
（2）将种子液以10%接种量转接入含300ml的发酵培养基中，33℃，220rpm摇床培养48h，得发酵液；
二、提取
1.收集树脂：用100目滤网过滤发酵液，收集大孔吸附树脂，用纯水冲洗树脂表面，去除残留在树脂表面的发酵液；
2.洗脱除杂：将收集到的树脂装入层析柱中，先用10%乙醇洗脱除杂，洗脱体积为树脂柱体积的3倍；
3.收集洗脱液：再用60%乙醇洗脱，洗脱液体积为5倍的树脂柱体积，收集洗脱液；
三、精制
1.浓缩：将收集到的洗脱液真空旋蒸浓缩，旋蒸温度60℃；
2.脱色：加入浓缩液质量1%的活性炭进行脱色，脱色温度70℃，脱色时间30min；
3.结晶分离：脱色液继续浓缩至腺苷含量为100g/l~150g/l，温度降至4℃，保冷6h，使得腺苷结晶析出，然后过滤分离，得到纯度为96.5%的腺苷成品。
实施例2
一、发酵
1.菌种培养
（1）种子培养基：葡萄糖15g/l，酵母浸粉6g/l，胰蛋白胨12g/l，氯化钠12g/l；
（2）用一次性无菌接种针沾取甘油菌接入含有100ml已灭菌的种子培养基中，33℃，220rpm摇床培养16h，制备种子液；
2.发酵培养
（1）发酵培养基：蔗糖50g/l，硫酸铵6g/l，酵母膏8g/l，谷氨酸钠5g/l，七水硫酸镁3g/l，磷酸二氢钾1g/l，一水硫酸锰100mg/l，七水硫酸亚铁50mg/l，豆油10ml/l，sp850大孔吸附树脂20g/l，ph为6.8；
（2）将种子液以10%接种量转接入含300ml的发酵培养基中，33℃，220rpm摇床培养48h，得发酵液；
二、提取
1.收集树脂：用100目滤网过滤发酵液，收集大孔吸附树脂，用纯水冲洗树脂表面，去除残留在树脂表面的发酵液；
2.洗脱除杂：将收集到的树脂装入层析柱中，先用20%乙醇洗脱除杂，洗脱体积为树脂柱体积的2倍；
3.收集洗脱液：再用60%乙醇洗脱，洗脱液体积为5倍的树脂柱体积，收集洗脱液；
三、精制
1.浓缩：将收集到的洗脱液真空旋蒸浓缩，旋蒸温度60℃；
2.脱色：加入浓缩液质量2%的活性炭进行脱色，脱色温度80℃，脱色时间15min；
3.结晶分离：脱色液继续浓缩至腺苷含量为100g/l~150g/l，温度降至4℃，保冷6h，使得腺苷结晶析出，然后过滤分离，得到纯度为97.7%的腺苷成品。
实施例3
一、发酵
1.菌种培养
（1）种子培养基：葡萄糖15g/l，酵母浸粉6g/l，胰蛋白胨12g/l，氯化钠12g/l；
（2）用一次性无菌接种针沾取甘油菌接入含有100ml已灭菌的种子培养基中，33℃，220rpm摇床培养16h，制备种子液；
2.发酵培养
（1）发酵培养基：蔗糖50g/l，硫酸铵6g/l，酵母膏8g/l，谷氨酸钠5g/l，七水硫酸镁3g/l，磷酸二氢钾1g/l，一水硫酸锰100mg/l，七水硫酸亚铁50mg/l，豆油10ml/l，sp850大孔吸附树脂20g/l，ph为6.8；
（2）将种子液以10%接种量转接入含300ml的发酵培养基中，33℃，220rpm摇床培养48h，得发酵液；
二、提取
1.收集树脂：用100目滤网过滤发酵液，收集大孔吸附树脂，用纯水冲洗树脂表面，去除残留在树脂表面的发酵液；
2.洗脱除杂：将收集到的树脂装入层析柱中，先用20%乙醇洗脱除杂，洗脱体积为树脂柱体积的3倍；
3.收集洗脱液：再用70%乙醇洗脱，洗脱液体积为5倍的树脂柱体积，收集洗脱液；
三、精制
1.浓缩：将收集到的洗脱液真空旋蒸浓缩，旋蒸温度60℃；
2.脱色：加入浓缩液质量2%的活性炭进行脱色，脱色温度80℃，脱色时间20min；
3.结晶分离：脱色液继续浓缩至腺苷含量为100g/l~150g/l，温度降至4℃，保冷6h，使得腺苷结晶析出，然后过滤分离，得到纯度为96.2%的腺苷成品。
序列表
<110>江苏阿尔法药业有限公司
<120>一种腺苷的发酵菌株及其制备工艺优化
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
aaagtaaattttcaaaaga19
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
caatccgatgaaaaaaagc19
1.一种腺苷的发酵制备工艺，其特征在于，所述的腺苷由高产菌株bacillussubtilis-117发酵制备;发酵制备工艺包括如下步骤：（1）细胞先在种子培养基培养后，转接发酵培养基，发酵培养，诱导细胞合成腺苷；（2）发酵制备完成后，用大孔吸附树脂进行吸附，吸附腺苷；（3）大孔吸附树脂用除杂洗脱剂进行洗脱，再用洗脱腺苷溶剂进行洗脱，收集含腺苷的洗脱腺苷溶剂；（4）洗脱腺苷溶剂进行浓缩；（5）加入活性炭，升温脱色；（6）将脱色液继续进行浓缩，后降温结晶，分离提纯，得到腺苷成品。
2.根据权利要求1所述的腺苷的发酵制备工艺，其特征在于：所述的发酵培养所用的种子培养基配方为：葡萄糖15g/l，酵母浸粉6g/l，胰蛋白胨12g/l，氯化钠12g/l。
3.根据权利要求1所述的腺苷的发酵制备工艺，其特征在于：所述的发酵培养所用的发酵培养基配方为：蔗糖50g/l，硫酸铵6g/l，酵母膏8g/l，谷氨酸钠5g/l，七水硫酸镁3g/l，磷酸二氢钾1g/l，一水硫酸锰100mg/l，七水硫酸亚铁50mg/l，豆油10ml/l，sp850大孔吸附树脂20g/l，ph为6.8。
4.根据权利要求1所述的腺苷的发酵制备工艺，其特征在于：所述的大孔吸附树脂为sp850型大孔吸附树脂，将大孔吸附树脂添加在培养基中，在发酵过程中，边合成边吸附。
5.根据权利要求1所述的腺苷的发酵制备工艺，其特征在于：所述的除杂洗脱剂为5%~20%的乙醇溶液，洗脱体积为2~3倍的大孔吸附树脂体积。
6.根据权利要求1所述的腺苷的发酵制备工艺，其特征在于：所述的洗脱腺苷溶剂为40%~70%乙醇，洗脱体积为3~5倍的大孔吸附树脂体积。
7.根据权利要求1所述的腺苷的发酵制备工艺，其特征在于：所述的浓缩工艺为真空旋蒸浓缩，真空压力为-0.08mpa~-0.1mpa，旋蒸温度为60~80℃。
8.根据权利要求1所述的腺苷的发酵制备工艺，其特征在于：所述的活性炭的量为浓缩液质量的1%~2%，脱色温度70~80℃，脱色时间15~30min。
9.根据权利要求1所述的腺苷的发酵制备工艺，其特征在于：所述的结晶分离工艺为将脱色液继续浓缩至腺苷含量100g/l~150g/l，温度降至0~5℃，保冷4~6h，使得腺苷结晶析出，然后过滤分离，得到腺苷成品。
技术总结