本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸及其衍生物的制备方法。
背景技术：
自然界中，四氢异喹啉类生物碱在植物中的分布相当广泛，例如樟科、木兰科、罂粟科、毛茛科、防己科、马兜铃科等。1974年，加拿大科学家kluepfel等从土壤来源的葡萄牙链霉菌(streptomyceslusitanusayb-1206)中首次分离得到四氢异喹啉类化合物naphthyridinomycin(ndm)。随着对植物化学成分研究的深入，人们分离得到了越来越多四氢异喹啉类化合物。迄今为止，已报道该家族60余个成员。
为了丰富四氢异喹啉类化合物的结构多样性，学者们利用许多经典的化学合成方法对其进行修饰和改造，例如pictect-spengler法、pomoanz-fistsch法、bischler-napieralski法和仿生合成法。该家族化合物由于具备独特的化学结构，展现出生物活性多样性，成为了化学家和生物学家长期以来研究的热点之一。随着研究的深入，人们发现了该类化合物越来越多的作用靶点，在抗菌、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗凝血、支气管扩张及影响中枢神经系统等方面都发挥了重要的生物学活性作用，具有巨大的临床医学价值。
1,2,3,4-四氢异喹啉(thiq)作为一种特殊的杂环骨架，存在于许多天然的生物碱中。许多临床药物都以thiq为核心骨架，它们具备各种有效的治疗活性。在过去十年里，人们发现多种有效的抗癌抗生素的核心骨架就是thiq生物碱。其中，最著名的要属trabectedin(ecteinascidin743，
thiq的羧酸类衍生物是一类重要的化合物，羧基取代位为1位或3位。作为构象受到限制的环状α-氨基酸，它们可替代原有蛋白氨基酸，在新型人工肽的设计中起到重要作用。其中，1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸(1-tic)已被广泛应用于药物开发和医学研究。利用1-tic合成的磺胺类羟肟药物能够有效抑制基质金属蛋白酶(mmp)。1-tic还可用于合成促性腺激素释放激素(gnrh)的受体拮抗剂。另一方面，1-tic的部分衍生物天然存在，例如在人脑中得到发现并鉴定的(-)-猪毛菜酚-1-羧酸。这些天然的生物碱物质都具备广泛的治疗效果，例如含有6,7-二甲氧基或6,7-亚甲二氧基的1-tic衍生物，可合成β-淀粉样蛋白前体蛋白切割酶抑制剂，用于阿尔茨海默病的治疗。
其中，(r)-1-tic是修饰肽或其他药理活性化合物的潜在构建基块。(r)-1-tic作为苯基甘氨酸的构象限制类似物，是合成许多生物活性肽的结构基础，例如用于先天免疫保护的抗菌肽(amps)。当它作为苯丙氨酸的结构类似替代物时，可用于合成法尼基转移酶抑制剂，是癌症治疗的新手段。
目前，未见有关合成(r)-1-tic的报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种新的制备(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸及其衍生物的方法。该方法能够显著提高酶的利用率及降低酶/底物使用比率，且反应条件温和、立体选择性强、反应效率高、工艺相对简单等特点，具有工业化应用前景。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种制备如式(i)所示的化合物的方法，
式(i)中，r1、r2独立地选自氢、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基，所述方法包括：以所述式(i)化合物酯的外消旋体为底物，在固定化脂肪酶的催化作用下发生反应，生成所述式(i)化合物，其特征在于：
所述方法采用专用循环流化床反应器进行，所述专用循环流化床反应器包括外循环系统与反应柱，所述固定化脂肪酶设置于所述反应柱中，其中，将所述底物配制成底物母液，使所述底物母液在所述外循环系统与所述反应柱之间循环流通多次，所述反应在所述反应柱中进行，且所述底物母液在所述外循环系统与所述反应柱之间每循环一次进行一次所述反应。
根据本发明的一些优选方面，所述方法还包括：当第一批次底物反应完成后，取出反应后第一批次反应混合液，然后加入第二批次底物继续进行所述反应，当第二批次底物反应完成后，取出反应后第二批次反应混合液，然后加入第三批次底物继续进行所述反应，当第三批次底物反应完成后，取出反应后第三批次反应混合液，然后加入第四批次底物继续进行所述反应，以此类推，制得n批次的反应混合液。
根据本发明，n大于等于5；优选地n大于等于10；更优选地，n大于等于15；进一步优选地，n大于等于20。
根据本发明的一些具体方面，n为10～40，优选为15-35，进一步优选为20-30。
根据本发明的一些优选且具体的方面，所述底物母液自下而上流经所述反应柱，如此可有利于将固定化脂肪酶保持在流化状态。
根据本发明的一些优选方面，所述反应柱包括沿上下方向延伸且中空的反应管、包覆在所述反应管外部的夹套(可以用于保持反应管内的反应温度)，还选择性地包括可伸缩且用于控制所述反应管内部液体体积的活塞，所述反应管与所述外循环系统连通。
根据本发明的一些优选方面，所述反应管的上下两端分别设置有用于阻止所述固定化脂肪酶流出所述反应柱的过滤膜。
根据本发明的一些优选方面，所述外循环系统包括用于容纳所述底物母液的底物容器、以及用于控制所述底物容器温度的控温设备，还选择性地包括对所述底物母液进行搅拌的搅拌装置，所述底物容器与所述反应柱连通。
根据本发明的一个具体方面，所述控温设备为恒温水浴器，所述底物容器设置在所述恒温水浴器中，所述搅拌装置为磁力搅拌器，在所述底物容器中放置磁子即可实现对内部所述底物母液的搅拌。
根据本发明的一个具体方面，所述专用循环流化床反应器还包括用于驱动所述底物母液在所述外循环系统与所述反应柱之间循环流通的驱动机构，所述驱动机构包括但不限于蠕动泵。
根据本发明的一些优选方面，所述底物母液中，所述式(i)化合物的外消旋体或式(i)化合物的盐的外消旋体的浓度为5-11g/l，更优选为9.5-10.5g/l。
根据本发明的一些优选方面，所述固定化脂肪酶占所述底物母液的浓度为3.0-3.5g/l，更优选为3.15-3.45g/l。
根据本发明的一些优选方面，所述底物母液在所述循环流化床反应器中的流速为0.40-0.45m/s，更优选为0.41-0.43m/s。
根据本发明的一些优选方面，控制所述反应的温度为25-35℃，更优选为28-33℃，进一步优选为29-32℃。
根据本发明的一些优选方面，控制所述反应在预设ph值下进行，所述预设ph值为7.8-8.2。
根据本发明的一些优选方面，所述固定化脂肪酶为选自苏州同力生物医药有限公司的脂肪酶qllip-9、苏州同力生物医药有限公司的novozyme435、漂莱特有限公司的immo8285、漂莱特有限公司的immoplus、漂莱特有限公司的d5544和尚科生物医药(上海)有限公司的sz-ple-100(cal-b)-immo中的一种或多种的组合。
根据本发明的一个具体且优选的方面，所述固定化脂肪酶至少包括苏州同力生物医药有限公司的脂肪酶qllip-9。
根据本发明的一些具体方面，式(i)中，r1、r2独立地选自氢、甲基、乙基、异丙基、甲氧基或乙氧基。
根据本发明的一些具体且优选的方面，所述的式(i)化合物酯为羧酸酯。根据本发明的一个具体方面，所述式(i)化合物酯为(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸酯或(r)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸酯。
根据本发明的一些优选且具体的方面，所述的式(i)所示的化合物为(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸或(r)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸。
根据本发明的一些具体且优选的方面，所述底物溶液包含所述底物，以及ph缓冲剂和/或ph调节剂。
根据本发明的一个具体且优选的方面，所述ph缓冲剂为磷酸盐，将其溶于水可以配制成磷酸盐缓冲溶液。
根据本发明的一些优选方面，所述的ph调节剂优选为氨水、碱金属氢氧化物或其水溶液。
根据本发明的一个具体且优选方面，所述的ph调节剂为20wt％～35wt％氨水。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下有益效果：
本发明创新地使式(i)化合物酯的外消旋体在特定的循环流化床反应器中、在固定化脂肪酶的催化作用下发生反应拆分为式(i)化合物，不仅能够同时兼具高转化率(可达99％以上)且高e.e.p值(可达96％)，而且还使得固定化脂肪酶的利用率得以显著提高(重复利用率可以达到20甚至30次以上，且无需人工分离)，同时酶/底物使用比率显著降低，从而极大地节约了酶使用成本(成本可降低30倍甚至35倍以上)，有利于工业化的应用。
附图说明
图1为本发明采用的专用循环流化床反应器的结构示意图；其中，1、恒温水浴器；2、磁力搅拌器；3、蠕动泵；4、反应柱；
图2为实施例1中测得的各批次反应液中转化率和e.e.p值；
图3为实施例1中经过20批次重复利用后的固定化酶qllip-9与未经使用的新固定化酶qllip-9各自具有的比酶活；
图4为实施例5中测得的5个批次反应混合液中转化率以及e.e.p值。
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明；应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的范围限制；实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
下述实施例中，如无特殊说明，所有的原料均来自于商购或者通过本领域的常规方法制备而得。下述中，(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸简称(r)-1-tic；外消旋底物1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸酯(简称(±)-1)购自苏州同力生物医药有限公司，qllip-9购自苏州同力生物医药有限公司。下述中，采用高效液相色谱仪fulifl2200对目的产物(r)-1-tic进行检测分析，采用的手性分析柱为chiralpakzwix(-)(0.40cmφ×15cm×3μm)；hplc检测条件：流动相为甲醇：乙腈＝6:4(含50mm甲酸和25mm二乙胺)；流速为0.4ml·min-1；检测波长为220nm；柱温为30℃。
实施例1(r)-1-tic的制备与分离
(r)-1-tic的制备：
底物母液的配制：用0.1m的水相醋酸铵缓冲液(ph＝8.0)配制10g/l的(±)-1的底物母液并用30％氨水调节溶液的初始ph值至8.0。
称取0.9gqllip-9。
如图1所示，本例提供一种专用循环流化床反应器，包括外循环系统、反应柱4、蠕动泵3；
其中，外循环系统包括用于容纳底物母液的底物容器、用于控制底物容器温度的控温装置、以及对底物母液进行搅拌的搅拌装置，底物容器与反应柱连通；具体地，控温装置为恒温水浴器1，搅拌装置为磁力搅拌器2，在底物容器中放置磁子即可实现对内部底物母液的搅拌；
反应柱4包括沿上下方向延伸且中空的反应管、包覆在反应管外部的夹套(可以用于保持反应管内的反应温度)，以及可伸缩的且用于控制反应管内部液体体积的活塞，反应管与外循环系统连通；具体地，本例中，采用的反应管的内径为10mm，高度为30cm，反应管的上下两端分别设置有用于阻止qllip-9流出所述反应柱的过滤膜；
蠕动泵3用于驱动底物母液在外循环系统(本例中具体是底物容器)与反应柱4(本例中具体是反应管)之间循环流通；
进一步地，称取270ml底物母液加入底物容器中(在磁力搅拌器2的作用下持续搅拌)，于30℃保温，同时在反应管内加入qllip-9(0.9g，相对于底物母液的浓度约为3.33g/l)，打开蠕动泵3，将底物容器中的底物母液自下而上地导入反应管中，控制底物母液流经反应管的流速为0.42m/s，然后从反应管顶部流出后回到底物容器中，如此循环，每循环一次即进行一次反应(反应原理：(±)-1在qllip-9催化作用下发生反应，生成式(i)化合物(r)-1-tic)，反应12h，反应结束后，从底物容器中取出反应后的反应混合液，记为第一批次反应混合液；
然后向底物容器中加入第二批次底物继续进行所述反应，当第二批次底物反应完成后，取出反应后第二批次反应混合液，然后加入第三批次底物继续进行所述反应，当第三批次底物反应完成后，取出反应后第三批次反应混合液，然后加入第四批次底物继续进行所述反应，以此类推，制得20批次的反应混合液。
各批次反应混合液的处理：
向各批次反应混合液中分别加入一定量的1m盐酸溶液，混合均匀后作为样品溶液，然后将包含0.5ml反应液的样品溶液全部转移至25ml容量瓶，用流动相定容、稀释。充分摇匀后取一定量稀释液，经微孔有机滤膜过滤后进样，利用高效液相色谱进行检测1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸两种构型的含量，检测结果参见图2，均显示转化率约大于等于99％(转化率＝[(初始外消旋底物的浓度(g/l)-残余的底物浓度(g/l))/初始外消旋底物的浓度(g/l)]×100％)，e.e.p约为95.9％[e.e.p＝(r酸产物量-s酸产物量)÷(r酸产物量 s酸产物量)×100％]，表明本发明制备方法能够极大地提升酶的利用率，显著降低酶的使用成本。
(r)-1-tic的分离提纯：
反应结束后，将第一批次反应混合液趁热过滤，得到澄清的反应液。反应液于60℃下旋蒸浓缩，析出大量晶体后充分抽滤，分离得到产物滤饼。将滤饼置于50℃烘干，最终得到干燥的(r)-1-tic晶体，分离收率约为80％，纯度大于99％。
同时对上述经过20批次重复利用的固定化酶qllip-9进行回收，通过真空冷冻处理得到干燥的回收酶，计算得到含水率约为72％。如图3所示，比较回收酶和未经过催化反应的新酶的比酶活差异，新酶的相对比酶活为100％，结果表明经过20批次的重复利用和真空冷冻干燥处理的qllip-9的相对比酶活仍能保持为98.86％，证明了该酶具有优秀的操作稳定性，重复利用的次数能够达到20次以上，显著降低酶的使用成本。
实施例2(r)-1-tic的制备与分离
(r)-1-tic的制备基本同实施例1，其区别仅在于：称取90ml底物母液，在反应管内加入0.3gqllip-9，反应混合液处理后利用高效液相色谱进行检测1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸两种构型的含量，转化率约大于等于99％(转化率＝[(初始外消旋底物的浓度(g/l)-残余的底物浓度(g/l))/初始外消旋底物的浓度(g/l)]×100％)，e.e.p约为94.3％[e.e.p＝(r酸产物量-s酸产物量)÷(r酸产物量 s酸产物量)×100％]。
(r)-1-tic的分离提纯方法同实施例1，处理后获得干燥的(r)-1-tic晶体，纯度大于99％。
实施例3(r)-1-tic的制备与分离
(r)-1-tic的制备基本同实施例1，其区别仅在于：称取180ml底物母液，在反应管内加入0.6gqllip-9，反应混合液处理后利用高效液相色谱进行检测1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸两种构型的含量，转化率约大于等于99％(转化率＝[(初始外消旋底物的浓度(g/l)-残余的底物浓度(g/l))/初始外消旋底物的浓度(g/l)]×100％)，e.e.p约为95.2％[e.e.p＝(r酸产物量-s酸产物量)÷(r酸产物量 s酸产物量)×100％]。
(r)-1-tic的分离提纯方法同实施例1，处理后获得干燥的(r)-1-tic晶体，纯度大于99％。
实施例4(r)-1-tic的制备与分离
(r)-1-tic的制备基本同实施例1，其区别仅在于：称取360ml底物母液，在反应管内加入1.2gqllip-9，反应混合液处理后利用高效液相色谱进行检测1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸两种构型的含量，转化率约大于等于99％(转化率＝[(初始外消旋底物的浓度(g/l)-残余的底物浓度(g/l))/初始外消旋底物的浓度(g/l)]×100％)，e.e.p约为96.0％[e.e.p＝(r酸产物量-s酸产物量)÷(r酸产物量 s酸产物量)×100％]。
(r)-1-tic的分离提纯方法同实施例1，处理后获得干燥的(r)-1-tic晶体，纯度大于99％。
实施例5(r)-1-tic的制备与分离
(r)-1-tic的制备基本同实施例1，其区别仅在于：称取4l底物母液，在反应管内加入13.4gqllip-9，在反应过程中利用高效液相色谱进行检测1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸两种构型的含量，具体如下：
本例中重复了5个批次的反应混合液，具体结果参见图4，可以得知5个批次获得的反应混合液中转化率以及e.e.p基本一致，不仅获得了较好的转化率以及e.e.p值，且表明qllip-9在多次重复利用后，其催化水平依旧稳定，显著地降低了酶的使用成本。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
1.一种制备如式(i)所示的化合物的方法，
式(i)中，r1、r2独立地选自氢、c1-c6烷基、c1-c6烷氧基，所述方法包括：以所述式(i)化合物酯的外消旋体为底物，在固定化脂肪酶的催化作用下发生反应，生成所述式(i)化合物，其特征在于：
所述方法采用专用循环流化床反应器进行，所述专用循环流化床反应器包括外循环系统与反应柱，所述固定化脂肪酶设置于所述反应柱中，其中，将所述底物配制成底物母液，使所述底物母液在所述外循环系统与所述反应柱之间循环流通多次，所述反应在所述反应柱中进行，且所述底物母液在所述外循环系统与所述反应柱之间每循环一次即进行一次所述反应。
2.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述方法还包括：当第一批次底物反应完成后，取出反应后第一批次反应混合液，然后加入第二批次底物继续进行所述反应，当第二批次底物反应完成后，取出反应后第二批次反应混合液，然后加入第三批次底物继续进行所述反应，当第三批次底物反应完成后，取出反应后第三批次反应混合液，然后加入第四批次底物继续进行所述反应，以此类推，制得n批次的反应混合液。
3.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，n大于等于5；优选地n大于等于10；更优选地，n大于等于20；进一步优选地，n大于等于20。
4.根据权利要求3所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，n为10～40，优选为15-35，进一步优选为20-30。
5.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述底物母液自下而上流经所述反应柱。
6.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述反应柱包括沿上下方向延伸且中空的反应管、包覆在所述反应管外部的夹套，还选择性地包括可伸缩且用于控制所述反应管内部液体体积的活塞，所述反应管与所述外循环系统连通。
7.根据权利要求6所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述反应管的上下两端分别设置有用于阻止所述固定化脂肪酶流出所述反应柱的过滤膜。
8.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述外循环系统包括用于容纳所述底物母液的底物容器、以及用于控制所述底物容器温度的控温设备，还选择性地包括对所述底物母液进行搅拌的搅拌装置，所述底物容器与所述反应柱连通。
9.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述底物母液中，所述式(i)化合物的外消旋体或式(i)化合物的盐的外消旋体的浓度为5-11g/l，优选为9.5-10.5g/l。
10.根据权利要求9所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述固定化脂肪酶占所述底物母液的浓度为3.0-3.5g/l，优选为3.15-3.45g/l。
11.根据权利要求9或10所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述底物母液在所述循环流化床反应器中的流速为0.40-0.45m/s，优选为0.41-0.43m/s。
12.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，控制所述反应的温度为25-35℃，优选为28-33℃，更优选为29-32℃。
13.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，控制所述反应在预设ph值下进行，所述预设ph值为7.8-8.2。
14.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述固定化脂肪酶为选自苏州同力生物医药有限公司的脂肪酶qllip-9、苏州同力生物医药有限公司的novozyme435、漂莱特有限公司的immo8285、漂莱特有限公司的immoplus、漂莱特有限公司的d5544和尚科生物医药(上海)有限公司的sz-ple-100(cal-b)-immo中的一种或多种的组合。
15.根据权利要求14所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述固定化脂肪酶至少包括苏州同力生物医药有限公司的脂肪酶qllip-9。
16.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，式(i)中，r1、r2独立地选自氢、甲基、乙基、异丙基、甲氧基或乙氧基，所述的式(i)化合物酯为羧酸酯。
17.根据权利要求16所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述的式(i)所示的化合物为(r)-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸或(r)-6,7-二甲氧基-1,2,3,4-四氢异喹啉-1-羧酸。
18.根据权利要求1所述的制备如式(i)所示的化合物的方法，其特征在于，所述底物溶液包含所述底物，以及ph缓冲剂和/或ph调节剂。
技术总结