本发明涉及转基因植物技术领域，具体而言，涉及一种抗盐基因的筛选方法及其应用。
背景技术：
据统计，全世界盐碱地面积近10亿hm2，约占世界陆地面积的7.6％。土壤盐渍化会造成植被密度减少、牧草产量和质量降低的后果，严重制约农业生产和经济的可持续发展。
紫花苜蓿(medicagosativa)是多年生豆科牧草，具有优质、高产、饲用价值高、适口性好和用途广泛等特点，被世界誉为“牧草之王”。随着国家对草牧业的越来越重视，紫花苜蓿在我国的栽培趋于大面积、集约化、商品化生产，对优质高产高抗的品种需求增大。
近年来，利用转基因技术进行苜蓿抗性方面的研究越来越多，为紫花苜蓿抗逆性的遗传研究提供了更大的便利，加速推动草牧业的发展。但传统的紫花苜蓿遗传转化、扦插生根、抗盐评价平均需要18月，耗时耗工，大大地限制紫花苜蓿抗盐分子育种的研究。
鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种抗盐基因的筛选方法及其应用。
本发明是这样实现的：
第一方面，实施例提供了一种抗盐基因的筛选方法，其包括：基于转基因愈伤组织在不同盐浓度培养基上生长时的生长状态，筛选出抗盐基因；
其中，所述转基因愈伤组织所转化的目的基因为候选基因。
优选地，所述筛选方法还包括：将转基因愈伤组织在不同盐浓度培养基上生长时的生长特征，与非转基因愈伤组织在不同盐浓度培养基上生长时的生长特征进行比较：
若转基因愈伤组织的生长状态优于非转基因愈伤组织的生长状态，则指示该候选基因为抗盐基因；
优选地，所述生长状态包括：愈伤组织的颜色和/或愈伤组织的重量。
优选地，所述不同盐浓度选自0～200mm中的任意浓度。
优选地，所述转基因愈伤组织的植物品种可选自苜蓿中的任意一种。
第二方面，本发明实施例提供了如前述任一实施方式所述的抗盐基因的筛选方法筛选的抗盐基因在培育转基因植物品种中的应用。
优选地，所述抗盐基因包括msist基因，msist基因的碱基序列如seqidno.1所示。
优选地，所述转基因植物为苜蓿。
优选地，所述转基因植物为紫花苜蓿。
第三方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其包括用于检测如前述任一实施方式所述的抗盐基因的筛选方法筛选出来的抗盐基因的试剂。
优选地，所述抗盐基因包括msist基因，msist基因的碱基序列如seqidno.1所示。
第四方面，本发明实施例提供了如前述任一实施方式所述的试剂盒在转基因植物的制备中的应用。
优选地，所述转基因植物为苜蓿。
本发明具有以下有益效果：
本发明实施例提供了一种抗盐基因的筛选方法及其应用。该筛选方法其包括：基于转基因愈伤组织在不同盐浓度培养基上生长时的生长状态，筛选出抗盐基因；其中，所述转基因愈伤组织所转化的目的基因为候选基因。传统的验证需要经过遗传转化、扦插生根、抗盐评价等环节，平均需要18月，而本申请提供的筛选方法仅需要1.5月左右即可筛出抗盐基因，具有快速、准确的有点，且应用前景广阔，能够为植物(如紫花苜蓿)抗盐分子育种提供关键技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1中不同时期愈伤组织的示意图；其中，图1中a、图1中d是共培养第一天，培养基为sh3a；图1中b、图1中e是nacl处理第一天，培养基添加150mmnacl的ms培养基；图1中c、图1中f是nacl处理第十五天，培养基同图1中b，图1中e的阶段，比例尺均为1cm；
图2为本发明实施例1中不同nacl浓度下msckx愈伤鲜重柱状图；
图3为本发明实施例1中不同nacl浓度下msist愈伤鲜重柱状图；
图4为本发明实施例1中nacl浓度为150mm，转基因愈伤与ck愈伤中msckx的表达水平；
图5为本发明实施例1中nacl浓度为150mm，转基因愈伤与ck愈伤中msist的表达水平；
图6为本发明实施例2中传统的紫花苜蓿遗传转化，抗盐评价的示意图；
图7为本发明实施例2中传统筛选方法与实施例1的筛选方法所需时间的比较。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
名词定义
本文中的“转基因植物”的英文为transgenicplant，是指将外源基因(目的基因)转入植物的细胞或组织中获得的具有新的遗传形状的植物。
本文中的“载体”可以指目的基因的运输工具，它能将分离克隆得到的目的基因导入植物细胞并使其整合到寄主染色体中得意表达。
技术方案
首先，发明实施例提供了一种抗盐基因的筛选方法，其包括：基于转基因愈伤组织在不同盐浓度培养基上生长时的生长状态，筛选出抗盐基因；
其中，所述转基因愈伤组织所转化的目的基因为候选基因。
需要说明的是，上述“转基因愈伤组织”可以指植物外植体经农杆菌侵染后产生的愈伤组织，其中，农杆菌中插入了目的基因。
传统筛选抗盐基因的方法需要经过对植物进行遗传转化，生成转基因植物，扦插扩繁后进行抗盐评价，筛选过程总共需要约18月的时间。本发明的筛选方法，通过观察转基因愈伤组织在不同盐浓度下生长的状态，以完成抗盐基因的筛选，与传统筛选方法相比，具有快速高效、重复性强且真实可靠等优点，对培育更优的抗盐品种有着重要的理论研究价值以及广阔的实际应用前景。
优选地，所述筛选方法还包括：将转基因愈伤组织在不同盐浓度培养基上生长时的生长特征，与非转基因愈伤组织在不同盐浓度培养基上生长时的生长特征进行比较：若转基因愈伤组织的生长状态优于非转基因愈伤组织的生长状态，则指示该候选基因为抗盐基因。
需要说明的是，“非转基因愈伤组织”可以指导入有空载体的愈伤组织，即植物外植体经农杆菌侵染后产生的愈伤组织，其中，农杆菌中未插入目的基因。
优选地，所述生长状态包括：愈伤组织的颜色和/或愈伤组织的重量。具体地，可以根据愈伤组织的颜色来判断其生长状态的好坏：若愈伤组织的颜色更绿(黄绿色也可)，即其的生长状态更优；若愈伤组织的鲜重更重，即其生长状态更优。若转基因愈伤组织的生长状态与非转基因植物的生长状态无差别，则指示该候选基因并非该植物的抗盐基因。
所述不同盐浓度选自0～200mm中的任意浓度。在一些实施例中，盐浓度可以包括：0mm、20mm、40mm、60mm、80mm、100mm、120mm、140mm、160mm、180mm和200mm中的任意浓度。优选地，所述不同盐浓度选自100～200mm中的任意浓度。
优选地，所述转基因植物为苜蓿，优选为紫花苜蓿。
优选地，所述筛选方法还包括转基因愈伤组织的制备。
优选地，所述筛选方法还包括目的基因的获取。
本发明实施例还提供了如前述任一实施方式所述的抗盐基因的筛选方法筛选的抗盐基因在培育转基因植物品种中的应用。
上述筛选方法能快速有效地从候选基因中筛选出植物的抗盐基因，然后将筛选出的抗盐基因导入植物的细胞，进行转基因植物的制备。
优选地，所述抗盐基因包括msist基因(increasedsalttolerance，ist)，msist基因的碱基序列如seqidno.1所示。
具体地，msist基因的碱基序列如下：
atgagaggtatggatattattaaggttcagaaaggtgggtctgcaaaggaaaatgagacagggttaagaaaaggtccttggacattagaagaggacaccattctagttgattacattacaatacacggtgaaggtcactggaatacccttgcatcttctgcaggtttgaggagaagtggtaaaagttgcagattaaggtggctaaactacttgcgtcccgatgtacgccgcgggaatatcacagttcaagaacagatattgattcttgacctccactctcgctggggcaataggtggtcgaaaattgcacaacatcttccgggaagaacagacaatgaaataaaaaactattggagaacaagagtgatcaagcaagcaaaacagctcaagtgtgatgtcaacagcaaacaattcagagacgttttacgtcacgtttggatgccccgattgctcgaacaaattcagcccgcacaacaattccccgacacgaataatccaaacggatcaaatatccttcttcaacaaaacacattgcaaagttcagtttcaggaatcagtggtgtttcctcggactcttcatcagtagaattccaagttgcttcaaattcggacaaaaataattctttggagcttttaggccatgaaggttcaaaaccatggtcaagtttcaacaaccaggtttcagaacaggggaagagtactggtgcttgtgatggtgactcgttggagagtatgtggaacgatgagaacatgtggtttttgcaacaactttacgaagatgttgaaataaaatacaatttacttgcgtga。
优选地，所述转基因植物为苜蓿。
优选地，所述转基因植物为紫花苜蓿。
本发明实施例还提供了一种试剂盒，其包括用于检测如前述任意实施方式所述的抗盐基因的筛选方法筛选出来的抗盐基因的试剂。
在一些可选的实施方式中，试剂可以选自引物、探针和基因芯片中的至少一种。
优选地，所述抗盐基因包括msist基因。msist基因的碱基序列如seqidno.1所示。
本发明实施例还提供了一种如前述任意实施方式所述的试剂盒在转基因植物的制备中的应用。
优选地，所述转基因植物为苜蓿。
优选地，转基因植物为紫花苜蓿。
需要说明的是，在上述任意实施例或实施方式中，对转基因植物的制备方法不作任何限制，可以选用现有的基因工程技术获得。
基因工程技术可以指重组dna技术，指在体外将不同来源的dna进行剪切和重组，形成杂合dna或嵌合dna分子，然后将其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特性，产生新的基因产物。
进一步地，转基因的方法包括直接导入法和间接导入法。
直接导入法，指采用物理或者化学方法直接将外源目的基因导入植物细胞的方法。
其中，物理法包括基因枪法、电击法、超声法、显微注射法和激光微束法。
化学法包括peg法和脂质法等。
间接导入法，也可以称为载体介导法，包括农杆菌介导法和病毒介导法。
实施例1
本实施例提供了一种抗盐基因的快速筛选方法，其包括以下步骤。
(1)抗盐候选基因的克隆：本实施例选择msckx和msist基因作为候选基因。具体地，msist基因的碱基序列如seqidno.1所示。
分离并克隆紫花苜蓿msckx和msist基因。
(2)转基因植物的制备
采用基因工程的技术将候选的抗盐基因(目的基因)导入转基因植物(紫花苜蓿)的细胞中，具体采用农杆菌介导的方法进行紫花苜蓿的遗传转化。需要说明的是，本实施例中目的基因选用msckx基因和msist基因。
2.1、外植体准备：采集健康的紫花苜蓿sy4d三叶，采集部位是枝条由上至下完全展开的第2～3片。无菌水加入0.1％的吐温和75％的酒精，清洗1min，用无菌水清洗3次后再用30％的漂白水消毒8分钟。消毒后用无菌水清洗3次，每次不少于1min。
2.2、菌液准备：将平板上的单个菌落接种到含有2μl利福平和适用于所用载体的抗生素的4mllb培养基中。在培养箱/振荡器中以200rpm的速度在28℃下孵育过夜。第二天下午，将1ml的过夜培养菌液接种到30ml的lb中，并加入所有所需的抗生素。继续在培养箱中以200rpm摇动培养，确保od600nm不超过1.0。
2.3、侵染液准备：菌液分装，4℃下4500g离心10min，倒上清，用sh3a液体培养基重悬，调整od600为0.2～0.3之间，作为侵染液。
2.4、转化：向消毒后的叶片中加入侵染液。然后用聚碳酸酯干燥器抽真空10min。接着用放入超声波清洗器清洗5min，再次放入聚碳酸酯干燥器中，抽真空10min。
超净台下，将侵染完成的叶片铺在无菌滤纸上干燥,叶片表面无液体即可。
将叶片转至sh3a共培养基上，将其放在黑暗中于24℃的培养箱中放置24～30h，请参照附图1中a和图1中d。
2.5、继代培养：将外植体转移到sh3a选择培养基中，每15d更换培养基，共培养30d。
(3)不同盐浓度的培养基培养：
将继代培养的愈伤组织分为3个组，置于梯度为nacl0mm，nacl150mm，nacl200mm，共三个梯度。
2.1、愈伤组织的表型观察：将获得的转基因愈伤组织置于不同盐浓度的培养基培养第一天，与非转基因愈伤组织(未导入目的基因的非转基因愈伤组织，ck，对照)的颜色和生长状态，无明显变化(图1中b)；当生长十五天，nacl浓度为0mm培养基上转基因和ck愈伤状态一致，均为黄绿色。而150mm，200mm培养基上msckx和msist转基因愈伤组织的颜色为黄绿色，生长状态良好，而非转基因愈伤组织变为褐色(图1中c，图1中f)。
2.2、称量鲜重：当培养十五天时,不同nacl浓度培养基的愈伤随机选取3块进行称重。nacl浓度为150mm时，msckx愈伤组织(转基因愈伤组织)重量显著高于对照。msist愈伤组织(转基因愈伤组织)在nacl浓度为150mm，200mm时显著重于对照。请参照附图2和图3。
2.3、基因表达水平测定：不同nacl浓度培养基上，ck和转基因愈伤中基因表达量的测定。
请参照图4和图5，当培养十五天时，nacl浓度为150mm时，msckx和msist的愈伤组织的颜色为黄绿色，生长状态良好，且愈伤组织显著重于非转基因愈伤组织，因此，选择150mm的愈伤进行表达量的测定。msckx的表达量比ck高7倍，msist的表达量是ck的13倍。
实施例2
采用实施例1提供的方法进行抗盐基因的筛选，设置1组对比例1。其中，对比例1采用传统的紫花苜蓿遗传转化、抗盐评价的方法，具体包括：遗传转化、扦插生根和抗盐评价的步骤，通过在不同盐浓度下转基因植物的形状来筛选抗盐候选基因，盐浓度的选择与实施例1相同，参照图6。
图6中，a～d为愈伤生长阶段；e为抗盐评价时nacl处理前植物生长状态图；f为nacl处理后植物生长状态图。
对两种筛选方法的筛选时间进行比较，比较结果请参照图7。由图7可知，本发明的筛选方法仅需要1.5个月的时间，相对于传统的紫花苜蓿遗传转化、抗盐评价所需时间，有显著的下降。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
sequencelisting
<110>兰州大学
<120>一种抗盐基因的筛选方法及其应用
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1.一种抗盐基因的筛选方法，其特征在于，其包括：基于转基因愈伤组织在不同盐浓度培养基上生长时的生长状态，筛选出抗盐基因；
其中，所述转基因愈伤组织所转化的目的基因为候选基因。
2.根据权利要求1所述的抗盐基因的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法还包括：将转基因愈伤组织在不同盐浓度培养基上生长时的生长特征，与非转基因愈伤组织在不同盐浓度培养基上生长时的生长特征进行比较：
若转基因愈伤组织的生长状态优于非转基因愈伤组织的生长状态，则指示该候选基因为抗盐基因；
优选地，所述生长状态包括：愈伤组织的颜色和/或愈伤组织的重量。
3.根据权利要求1所述的抗盐基因的筛选方法，其特征在于，所述不同盐浓度选自0～200mm的任意浓度。
4.根据权利要求1～3任一项所述的抗盐基因的筛选方法，其特征在于，所述转基因愈伤组织的植物品种可选自苜蓿的任意一种。
5.如权利要求1～4任一项所述的抗盐基因的筛选方法筛选的抗盐基因在培育转基因植物品种中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗盐基因包括msist基因，msist基因的碱基序列如seqidno.1所示；
优选地，所述转基因植物为苜蓿；
优选地，所述转基因植物为紫花苜蓿。
7.一种试剂盒，其特征在于，其包括用于检测如权利要求1～4任一项所述的抗盐基因的筛选方法筛选出来的抗盐基因的试剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述抗盐基因包括msist基因，msist基因的碱基序列如seqidno.1所示。
9.如权利要求7或8所述的试剂盒在转基因植物的制备中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述转基因植物为苜蓿。
技术总结