本发明属于生物技术领域，特别涉及一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的引物及应用。
背景技术：
心力衰竭是由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引物心脏循环障碍症候群。心力衰竭不是一个独立的疾病，是心脏疾病发展的终末阶段。心力衰竭可分为左心衰竭和右心衰竭，左心衰竭的临床表现主要为肺循环淤血(劳力性呼吸困难、端坐呼吸、阵发性夜间呼吸困难等)和周围灌注不足(乏力、少尿和低血压等)；右心衰竭的临床表现主要为体循环淤血(水肿、胃肠道淤血、肝大以及胸腹水等)。
药物治疗是心力衰竭的基石，对改善患者的症状和预后具有十分重要的意义。心力衰竭的药物治疗可以分为改善症状和改善预后两大类：
1、改善预后：
(1)β受体阻滞剂：代表药物包括美托洛尔和卡维地洛，对于病情稳定的心力衰竭患者，应尽早使用β受体阻滞剂，长期应用可以降低死亡、住院和猝死风险，同时也可以一定程度上减轻症状和改善生活质量。但是应用β受体阻滞剂具有心动过缓、房室传导阻滞、诱发心力衰竭和心功能恶化、引起血管收缩如肢体发冷和间歇性跛行、导致支气管哮喘发作等副作用。
(2)肾素-血管紧张素系统抑制剂：包括血管紧张素转化酶抑制剂如培哚普利、依那普利，该类药物可以抑制血管紧张素转化酶活性，从而抑制肾素-血管紧张素系统活化，对心力衰竭患者具有明显的改善预后的益处；血管紧张素ii受体拮抗剂包括氯沙坦、替米沙坦、厄贝沙坦，该类药物通过阻断血管紧张素ii与其受体的结合而抑制肾素-血管紧张素系统活性，发挥同血管紧张素转化酶抑制剂类似的作用，主要推荐用于不能耐受血管紧张素转化酶抑制剂的患者；血管紧张素受体脑啡肽酶抑制剂包括沙库巴曲/缬沙坦，该类药物具有血管紧张素ii受体拮抗剂和脑啡肽酶抑制剂的双重作用，既可以阻断肾素-血管紧张素系统激活的不利作用，又可以通过调节利钠肽系统发挥保护作用，具有显著的改善预后、减轻心脏重构、改善症状和生活质量等益处。但是上述所有肾素-血管紧张素系统抑制剂均具有低血压、血肌酐升高、高钾血症、血管性水肿等副作用。
(3)醛固酮受体拮抗剂：代表药物为螺内酯，在血管紧张素转化酶抑制剂和血管紧张素ii受体拮抗剂治疗的基础上，加用螺内酯进一步抑制醛固酮在心脏重构中的有害作用，从而降低心力衰竭患者的病死率和再住院率。但是应用螺内酯有电解质异常(包括高钾血症和低钠血症)、抗雄激素样作用或对其他内分泌系统的影响(长期服用本药在男性可致男性乳房发育、阳萎、性功能低)和中枢神经系统表现(长期或大剂量服用本药可发生行走不协调、头痛等)等副作用。
2、改善症状：
(1)洋地黄类药物：代表药物有地高辛，通过产生正性肌力作用，提高心肌收缩力，增强迷走神经活性以减慢心率，在应用了其他药物仍有症状的患者，加用该类药物可以改善症状和提高运动耐量。但是应用洋地黄类药物具有减慢心率和洋地黄中毒(各种心律失常、腹胀、恶心、呕吐和黄视等)风险。
(2)利尿剂：代表药物有呋塞米、托拉塞米，对有液体潴留的患者，均应使用利尿剂，恰当应用利尿剂可以有效缓解心力衰竭引起的呼吸困难和水肿，改善运动耐量，是控制心力衰竭症状最有效的药物之一。但是应用利尿剂有导致低血容量、电解质紊乱、肾功能恶化以及糖脂和尿酸代谢异常的副作用。
精准用药是精准医疗的重要组成部分。遗传药理学和药物基因组学研究已经证实，不同患者携带的基因(如药物转运蛋白基因、药物代谢酶基因、dna修复基因)单核苷酸多态性不同，对药物的反应不同，同一药物对不同患者的疗效、副作用也有很大的差异，因此，从药物疗效及药物副作用的角度出发，进行基因检测指导精准用药，帮助医生筛选出有效的治疗方案，对病人做出最正确的治疗决策，既节省了患者无效的医疗费用，而且提高了治疗效果，减少药物对患者的副作用。
以上几种药物的个体差异与基因多态性密切相关。
传统的基因多态性检测方法如sanger测序，荧光定量pcr等方法，虽然也可能在临床上提供较好的价值，但是如果同时检测多个snp位点，则存在费时、经济成本高、时间成本高等原因，不利在临床上大规模推广使用。
基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)技术可同时检测多个基因多态性位点，具有兼容性强、通量高、精准度高、性价比高的优点，可用于同时检测美托洛尔、卡维地洛、替米沙坦、培哚普利、氯沙坦、依那普利、呋塞米、托拉塞米、厄贝沙坦、螺内酯、地高辛的精准用药相关基因信息。目前尚未有将基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)技术应用于心力衰竭药物抵抗或副作用的精准用药基因检测。
技术实现要素：
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明提供了一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的引物及应用。
本发明第一个方面提供了一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物，包括引物组1和引物组2，其中：所述引物组1为特异性pcr引物，包括引物对1-19；所述引物组2为单碱基延伸引物，包括单碱基延伸引物1-19。
本发明第二个方面提供了一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的制剂，所述制剂包括试剂一和试剂二；其中：
所述试剂一包括根据本发明第一个方面所述的引物组1中的引物对1-引物对19，以及pcr缓冲液、mgcl2、dntp和dna聚合酶；
所述试剂二包括根据本发明第一个方面所述的引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物19，以及单碱基延伸缓冲液、单碱基延伸酶、单碱基延伸终止mix。
本发明第三个方面提供了本发明第一个方面的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物，或本发明第二个方面的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的制剂在制备用于检测慢性心力衰竭精准用药的产品中的应用。
本发明第四个方面提供了一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的方法，包括如下步骤：
1)用根据本发明第一个方面所述的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物组1中的引物对1-引物对21，以待测样本的基因组dna为模板进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
2)将所述pcr扩增产物进行碱性磷酸酶消化，得到消化产物；
3)将所述消化产物用根据本发明第一个方面所述的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物的引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物19进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物；
4)将所述单碱基延伸反应产物经过纯化后，进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测，得到待测样本中慢性心力衰竭精准用药相关基因的snp位点信息。
使用本发明提供的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物，通过一次检测即可高效的同时完成11种临床常用慢性心力衰竭精准用药的预测，本发明根据采用的snp位点设计的引物特异性高，准确度好；采用本发明提供的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因的snp位点的专用引物和方法，大大减少了检测时间，节约了成本，对于指导11种临床常用慢性心力衰竭的药物的精准用药具有非常高的应用价值，适于推广应用。
附图说明
图1为本发明实施例2中rs1042714位点的检测结果。
图2为本发明实施例2中rs5443位点的检测结果。
图3为本发明实施例2中rs5186位点的检测结果。
图4为本发明实施例2中rs495828位点的检测结果。
图5为本发明实施例2中rs1529927位点的检测结果。
图6为本发明实施例2中rs5063位点的检测结果。
图7为本发明实施例2中rs275651位点的检测结果。
图8为本发明实施例2中rs1042323位点的检测结果。
图9为本发明实施例2中rs1131667位点的检测结果。
图10为本发明实施例2中rs1057910位点的检测结果。
图11为本发明实施例2中rs1799722位点的检测结果。
图12为本发明实施例2中rs17268282位点的检测结果。
图13为本发明实施例2中rs4961位点的检测结果。
图14为本发明实施例2中rs4148323位点的检测结果。
图15为本发明实施例2中rs3890011位点的检测结果。
图16为本发明实施例2中rs1934969位点的检测结果。
图17为本发明实施例2中rs2032582位点的检测结果。
图18为本发明实施例2中rs1799853位点的检测结果。
图19为本发明实施例2中rs1045642位点的检测结果。
图20为本发明对比例1中rs1042323位点使用引物组1的检测结果。
图21为本发明对比例1中rs5443位点使用引物组1的检测结果。
图22为本发明对比例1中rs1042323位点使用引物组2的检测结果。
图23为本发明对比例1中rs1045642位点使用引物组2的检测结果。
图24为本发明对比例2中rs1529927位点的检测结果。
图25为本发明对比例2中的rs1057910位点的检测结果。
具体实施方式
为使本发明的技术方案、目的和优点更加清楚，下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明第一个方面提供了一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物，包括引物组1和引物组2；其中：
所述引物组1为特异性pcr引物，包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、引物对14、引物对15、引物对16、引物对17、引物对18、引物对19；
所述引物对1由序列1所示的单链dna分子和序列2所示的单链dna分子组成；
所述引物对2由序列3所示的单链dna分子和序列4所示的单链dna分子组成；
所述引物对3由序列5所示的单链dna分子和序列6所示的单链dna分子组成；
所述引物对4由序列7所示的单链dna分子和序列8所示的单链dna分子组成；
所述引物对5由序列9所示的单链dna分子和序列10所示的单链dna分子组成；
所述引物对6由序列11所示的单链dna分子和序列12所示的单链dna分子组成；
所述引物对7由序列13所示的单链dna分子和序列14所示的单链dna分子组成；
所述引物对8由序列15所示的单链dna分子和序列16所示的单链dna分子组成；
所述引物对9由序列17所示的单链dna分子和序列18所示的单链dna分子组成；
所述引物对10由序列19所示的单链dna分子和序列20所示的单链dna分子组成；
所述引物对11由序列21所示的单链dna分子和序列22所示的单链dna分子组成；
所述引物对12由序列23所示的单链dna分子和序列24所示的单链dna分子组成；
所述引物对13由序列25所示的单链dna分子和序列26所示的单链dna分子组成；
所述引物对14由序列27所示的单链dna分子和序列28所示的单链dna分子组成；
所述引物对15由序列29所示的单链dna分子和序列30所示的单链dna分子组成；
所述引物对16由序列31所示的单链dna分子和序列32所示的单链dna分子组成；
所述引物对17由序列33所示的单链dna分子和序列34所示的单链dna分子组成；
所述引物对18由序列35所示的单链dna分子和序列36所示的单链dna分子组成；
所述引物对19由序列37所示的单链dna分子和序列38所示的单链dna分子组成。
所述引物组2为单碱基延伸引物(uep)，由一系列分子量梯度递增、碱基数也梯度递增的单碱基引物组成，分别为单碱基延伸引物1、单碱基延伸引物2、单碱基延伸引物3、单碱基延伸引物4、单碱基延伸引物5、单碱基延伸引物6、单碱基延伸引物7、单碱基延伸引物8、单碱基延伸引物9、单碱基延伸引物10、单碱基延伸引物11、单碱基延伸引物12、单碱基延伸引物13、单碱基延伸引物14、单碱基延伸引物15、单碱基延伸引物16、单碱基延伸引物17、单碱基延伸引物18、单碱基延伸引物19。该系列每条引物只做一个碱基的延伸，19条延伸产物的分子量梯度递增、碱基数也梯度递增。
所述单碱基延伸引物1为序列39所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物2为序列40所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物3为序列41所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物4为序列42所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物5为序列43所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物6为序列44所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物7为序列45所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物8为序列46所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物9为序列47所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物10为序列48所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物11为序列49所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物12为序列50所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物13为序列51所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物14为序列52所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物15为序列53所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物16为序列54所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物17为序列55所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物18为序列56所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物19为序列57所示的单链dna分子；
上述引物组1中的引物对1-引物对19中的各条引物(序列1-38所示的单链dna分子)为等摩尔比混合，构成扩增引物mix。
上述引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物19(序列39-57所示的单链dna分子)为等摩尔比混合，构成单碱基延伸引物mix。
其中，所述snp位点包括：rs1042714、rs5443、rs5186、rs495828、rs1529927、rs5063、rs275651、rs1042323、rs1131667、rs1057910、rs1799722、rs17268282、rs4961、rs4148323、rs3890011、rs1934969、rs2032582、rs1799853、rs1045642。
本发明的第一个方面提供的专用引物从以下两个方面确保引物的特异性及正确性：
1、单碱基延伸引物与第一次pcr扩增产物特异性结合，保证了第一次pcr引物及产物的特异性；
2、引物设计结果自动生成单碱基延伸反应后的产物分子量，如果pcr引物或单碱基延伸引物或反应产物的分子量与正确的分子量不符合，则后续实验失败，因此，进一步保证了结果的可靠性和正确性，防止假阳性出现。
本发明第二个方面提供了一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的制剂，所述制剂包括试剂一和试剂二；其中：
所述试剂一包括根据本发明的第一个方面所述的引物组1中的引物对1-引物对19，以及pcr缓冲液、mgcl2、dntp和dna聚合酶。
所述试剂二包括根据本发明的第一个方面所述的引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物19，以及单碱基延伸缓冲液、单碱基延伸酶、单碱基延伸终止mix。
其中，所述snp位点如上所述。
所述试剂一中，所述引物对1-引物对19中的38条引物在所述试剂一中的浓度均为0.5μm。所述pcr缓冲液可以商购获得，pcr缓冲液中的成分为常用的pcr缓冲组分。所述mgcl2在所述试剂一中的浓度为2mm。所述dntp在试剂一中的浓度为0.5mm。所述dna聚合酶可以为hotstartaqdna聚合酶，且在试剂一中的浓度为0.2u/μl。
所述试剂二中，所述单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物19在试剂二中的浓度均为0.5μm。所述单碱基延伸缓冲液、单碱基延伸酶、单碱基延伸终止mix均可以商购获得，例如均可以为购自agenabioscience的商品。
在本发明的第二个方面提供的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的制剂中，试剂一和试剂二联合使用，即组成多重巢式pcr反应体系。
本发明第三个方面提供了根据本发明第一个方面提供的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物，或本发明第二个方面的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的制剂在制备用于检测慢性心力衰竭精准用药产品中的应用。
本发明的第四个方面提供了一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的方法，该方法包括如下步骤：
1)用上述的引物组1中的引物对1-引物对21，以待测样本的基因组dna为模板进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
2)将所述pcr扩增产物进行碱性磷酸酶消化，得到消化产物；
3)将所述消化产物用引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物19进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物；
4)将所述单碱基延伸反应产物经过纯化后，进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测，得到待测样本中慢性心力衰竭用药抗药性相关基因的snp位点信息。
其中，步骤1)中，所述pcr扩增的程序为：先94℃2min预变性；再94℃20s、56℃30s、72℃60s进行45个循环；再72℃3min；最后4℃保存。
步骤2)中，所述碱性磷酸酶消化的条件为：37℃、40min，85℃、5min，4℃保存。
步骤3)中，所述单碱基延伸反应的程序为：94℃30s；先94℃5s，再52℃5s、80℃5s、5个循环，共进行40个循环；再72℃3min；最后4℃保存。
步骤4)中，所述纯化可以为树脂纯化。
其中，所述snp位点为rs1042714(对应引物对1和单链延伸引物1)、rs5443(对应引物对2和单链延伸引物2)、rs5186(对应引物对3和单链延伸引物3)、rs495828(对应引物对4和单链延伸引物4)、rs1529927(对应引物对5和单链延伸引物5)、rs5063(对应引物对6和单链延伸引物6)、rs275651(对应引物对7和单链延伸引物7)、rs1042323(对应引物对8和单链延伸引物8)、rs1131667(对应引物对9和单链延伸引物9)、rs1057910(对应引物对10和单链延伸引物10)、rs1799722(对应引物对11和单链延伸引物11)、rs17268282(对应引物对12和单链延伸引物12)、rs4961(对应引物对13和单链延伸引物13)、rs4148323(对应引物对14和单链延伸引物14)、rs3890011(对应引物对15和单链延伸引物15)、rs1934969(对应引物对16和单链延伸引物16)、rs2032582(对应引物对17和单链延伸引物17)、rs1799853(对应引物对18和单链延伸引物18)、rs1045642(对应引物对19和单链延伸引物19)。
采用本发明提供的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物、相关制剂和用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的方法能高效一次性地同时完成11种临床常用慢性心力衰竭治疗药物精准用药的检测，对于指导慢性心力衰竭患者精准用药及因过度用药引起的毒副作用，具有非常高的应用价值，适于推广应用。
下述实施例中所使用的各种试剂、材料等，若无特别说明，均为可以从商业渠道获得的产品；下述实施例中所使用的各种测试、检测方法若无特别说明，均为本领域中的常规测试、检测方法，均可以从教科书、工具书或学术期刊中获得。
实施例1
本实施例用来说明本发明提供的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物。
根据心衰治疗常用的11种药物：美托洛尔、卡维地洛、替米沙坦、培哚普利、氯沙坦、依那普利、呋塞米、托拉塞米、厄贝沙坦、螺内酯、地高辛的精准用药相关的snp位点：rs1042714、rs5443、rs5186、rs495828、rs1529927、rs5063、rs275651、rs1042323、rs1131667、rs1057910、rs1799722、rs17268282、rs4961、rs4148323、rs3890011、rs1934969、rs2032582、rs1799853、rs1045642，设计特异性pcr引物及单碱基延伸引物，组成多重巢式pcr反应体系，以采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)技术(massarray平台)实现对上述用于慢性心力衰竭的11种药物的精准用药预警检测。
特异性pcr引物和uep引物包括：
序列1，即rs1042714pcr引物1：5′-acgttggatgcttcttgctggcacccaatg-3′。
序列2，即rs1042714pcr引物2：5′-acgttggatgatgagagacatgacgatgcc-3′。
序列3，即rs5443pcr引物1：5′-acgttggatgtcgtagccagcgaatagtag-3′。
序列4，即rs5443pcr引物2：5′-acgttggatgtctcccacgagagcatcatc-3′。
序列5，即rs5186pcr引物1：5′-acgttggatgcggttcagtccacataatgc-3′。
序列6，即rs5186pcr引物2：5′-acgttggatgattcctctgcagcacttcac-3′。
序列7，即rs495828pcr引物1：5′-acgttggatgcaggtgtcatggagaaatgg-3′。
序列8，即rs495828pcr引物2：5′-acgttggatgacctgtaactgttgcaaggg-3′。
序列9，即rs1529927pcr引物1：5′-acgttggatgttggactcccactccatgc-3′。
序列10，即rs1529927pcr引物2：5′-acgttggatgtggaccccattaacgacatc-3′。
序列11，即rs5063pcr引物1：5′-acgttggatgtttactggcattccagctcc-3′。
序列12，即rs5063pcr引物2：5′-acgttggatgtgaaatccatcaggtctgcg-3′。
序列13，即rs275651pcr引物1：5′-acgttggatgggttgatgccagaaagcaag-3′。
序列14，即rs275651pcr引物2：5′-acgttggatgaaactacagtcaccctactc-3′。
序列15，即rs1042323pcr引物1：5′-acgttggatgactccttaacttcagggagc-3′。
序列16，即rs1042323pcr引物2：5′-acgttggatgacatcccataacattccaac-3′。
序列17，即rs1131667pcr引物1：5′-acgttggatgagtaagcacagaacagaggg-3′。
序列18，即rs1131667pcr引物2：5′-acgttggatggagggagagacagagaaaag-3′。
序列19，即rs1057910pcr引物1：5′-acgttggatgctacacagatgctgtggtgc-3′。
序列20，即rs1057910pcr引物2：5′-acgttggatgtgtcacaggtcactgcatgg-3′。
序列21，即rs1799722pcr引物1：5′-acgttggatgagtgcagagctcagctgga-3′。
序列22，即rs1799722pcr引物2：5′-acgttggatgaacagctcatctttcaaggg-3′。
序列23，即rs17268282pcr引物1：5′-acgttggatggccatagataaaatttctggg-3′。
序列24，即rs17268282pcr引物2：5′-acgttggatgctacaggaccccaatgactt-3′。
序列25，即rs4961pcr引物1：5′-acgttggatggacaagatggctgaactctg-3′。
序列26，即rs4961pcr引物2：5′-acgttggatgtagtcttcgacttgggactg-3′。
序列27，即rs4148323pcr引物1：5′-acgttggatgcacatcctccctttggaatg-3′。
序列28，即rs4148323pcr引物2：5′-acgttggatgctgacgcctcgttgtacatc-3′。
序列29，即rs3890011pcr引物1：5′-acgttggatgccaccccatgcaaatgattg-3′。
序列30，即rs3890011pcr引物2：5′-acgttggatgccataaatggagaggaggac-3′。
序列31，即rs1934969pcr引物1：5′-acgttggatgattcatgcatgcacccatcc-3′。
序列32，即rs1934969pcr引物2：5′-acgttggatgactgtctctgtaactggcac-3′。
序列33，即rs2032582pcr引物1：5′-acgttggatgagtaagcagtagggagtaac-3′。
序列34，即rs2032582pcr引物2：5′-acgttggatggtctggacaagcactgaaag-3′。
序列35，即rs1799853pcr引物1：5′-acgttggatgtcaactcctccacaaggcag-3′。
序列36，即rs1799853pcr引物2：5′-acgttggatgatgacgctgcggaattttgg-3′。
序列37，即rs1045642pcr引物1：5′-acgttggatgaaggcatgtatgttggcctc-3′。
序列38，即rs1045642pcr引物2：5′-acgttggatgttgcctatggagacaacagc-3′。
序列39，即rs1042714单碱基延伸引物：5′-ccacacctcgtcccttt-3′。
序列40，即rs5443单碱基延伸引物：5′-atctgcggcatcacgtc-3′。
序列41，即rs5186单碱基延伸引物：5′-cttcactaccaaatgagc-3′。
序列42，即rs495828单碱基延伸引物：5′-tgttgcaagggaggtaaa-3′。
序列43，即rs1529927单碱基延伸引物：5′-aacgacatccgcatcattg-3′。
序列44，即rs5063单碱基延伸引物：5′-catcaggtctgcgttggaca-3′。
序列45，即rs275651单碱基延伸引物：5′-cagtcaccctactcacctatc-3′。
序列46，即rs1042323单碱基延伸引物：5′-ccaacatttagaaattcactc-3′。
序列47，即rs1131667单碱基延伸引物：5′-gagagacagagaaaagaaaaac-3′。
序列48，即rs1057910单碱基延伸引物：5′-aggctggtggggagaaggtcaa-3′。
序列49，即rs1799722单碱基延伸引物：5′-gctcatctttcaagggctgggta-3′。
序列50，即rs17268282单碱基延伸引物：5′-aggcataattaacctggaaaacag-3′。
序列51，即rs4961单碱基延伸引物：5′-gacttgggactgcttccattctgcc-3′。
序列52，即rs4148323单碱基延伸引物：5′-tgacgcctcgttgtacatcagagac-3′。
序列53，即rs3890011单碱基延伸引物：5′-acctgtggtgcaggttggaaacaga-3′。
序列54，即rs1934969单碱基延伸引物：5′-acagcatatgcaataactgttcagtg-3′。
序列55，即rs2032582单碱基延伸引物：5′-ctgaaagataagaaagaactagaaggt-3′。
序列56，即rs1799853单碱基延伸引物：5′-gggatggggaagaggagcattgaggac-3′。
序列57，即rs1045642单碱基延伸引物：5′-cccctcgggtggtgtcacaggaagagat-3′。
实施例2
本实施例用来说明本发明提供的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因的snp位点的方法。
1、模板dna提取。提取384例外周血基因组dna，浓度统一稀释至20-30ng/μl。
2、pcr反应。在5μlpcr96孔板中配制反应体系：
模板dna1μl，扩增引物mix1μl，pcr缓冲液(含15mmmg2 )0.5μl，mgcl2(25mm)0.4μl，dntp(25mm)0.1μl，hotstartaq(5u/μl)0.2μl，用mbg(molecularbiologygrade分子生物学等级)水补齐到5μl。用封口膜将384孔板密封。
pcr扩增引物mix由序列1-38所示的引物(序列表中的序列1-序列38)和水组成，其中，每条引物的浓度为0.5μm。
上述pcr反应程序设置如下：
3、碱性磷酸酶处理(sap消化反应)。在上述第2步得到的pcr反应产物中加入如下组分，获得sap消化反应体系：
sapbuffer0.17μl，sapenzyme0.30μl，mbg水1.53μl。
将上述sap消化反应体系按照如下消化反应程序，进行sap消化反应，获得消化反应产物：37℃，40min；85℃，5min；4℃，∞。
4、单碱基延伸反应。在上述步骤3得到的消化反应产物中加入如下组分，获得单碱基延伸反应体系：单碱基延伸缓冲液iplexbufferplus(agenabioscience，ref:01431，lot:0000021844)0.2μl，单碱基延伸酶iplexenzyme(agenabioscience，ref:01432lot:0000021845)0.041μl，单碱基延伸终止mixiplexterminator(agenabioscience，ref:01430lot:0000021435)0.2μl，mbg水0.619μl，单碱基延伸引物mix0.940μl。
上述单碱基延伸引物mix由上述的19条特异性引物(序列表中的序列39-序列57)和水组成，其中每条引物的浓度均为0.5μm。
将上述单碱基延伸反应体系，按照如下反应程序，进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物。
单碱基延伸反应程序：
5、树脂纯化。将上述步骤4得到的单碱基延伸反应产物进行树脂纯化，具体如下：
1)将上述步骤4得到的装有单碱基延伸产物的384反应板3000rpm离心2min，每孔加16μlmbg水，用封口膜将反应板封好，3000rpm瞬时离心。
2)取一张干净的a4纸，将树脂板(规格为6mg)置于其上，用小勺取适量树脂(agenabioscience，产品ref:08040lot:0000022403)置于树脂板上，用塑料盖板反复左右推平树脂，压实，使每孔树脂含量均匀。
3)将离心后的384反应板倒置在已经铺好树脂的树脂板上，两块板的孔一一对应。翻转两个板，使树脂板在上，384反应板在下。均匀轻轻敲打树脂板背面，使树脂落入装有单碱基延伸产物的384反应板中。
4)用封口膜将装有单碱基延伸产物和树脂的384反应板密封，摇床低速垂直旋转30min，使树脂与反应物充分接触。
5)将反应完成后的384反应板3000rpm离心5min使树脂沉入管底，上清即为纯化产物。
6、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)检测：
将上述步骤5得到的纯化产物通过点样仪转移到芯片(agenabioscience，产品ref:01509lot:0000022421)上，放入质谱仪中，进行质谱检测(质谱检测分子量范围：4500-8000道尔顿)。
如图1-19所示，得到rs1042714、rs5443、rs5186、rs495828、rs1529927、rs5063、rs275651、rs1042323、rs1131667、rs1057910、rs1799722、rs17268282、rs4961、rs4148323、rs3890011、rs1934969、rs2032582、rs1799853、rs1045642的snp位点信息结果。由这些图可以看出，每个位点的检出率均在98％以上，本发明的专用引物和方法可以用于这些snp位点的信息检测。
7、结果判读：通过质谱检测结果，参考下表1，为11种临床常用慢性心力衰竭治疗药物的风险进行精准预测及禁用药预警。
表1.19个snp位点信息指导表型分析
注释：上表中，如果出现同一患者对同一药物不同检测位点的检测结果的临床意义判读不一致的情况，临床医生将再参考不同检测位点对该药物的代谢和抵抗的贡献度，再进一步调整对该患者的针对性的用药方案。
实施例3
本实施例用来说明检测11种慢性心力衰竭精准用药相关基因的snp位点的方法及专用引物的应用。
1、模板dna的提取。提取14例受检者外周血基因组dna，浓度统一稀释至20-30ng/μl。其中，受检者1-8(待检样本1-8)均是男性心衰非肝硬化患者；受检者9-14(待检样本9-14)是男性心衰、肝硬化患者。
2、pcr反应：参见实施例2步骤2。
3、碱性磷酸酶处理(sap消化反应)：参见实施例2步骤3。
4、单碱基延伸反应：参见实施例2步骤4。
5、树脂纯化：参见实施例2步骤5。
6、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)检测：参见实施例1步骤6。
经检测，在本实施例的14例受检样本中，各个位点的检出率均为100％。结果如下表2所示。
表2：14例受检样本snp位点检测结果
根据表2的检测结果可以看出：
样本1、样本5、样本6、样本8、样本11、样本12服用美托洛尔后，不易产生高甘油三酯血症风险(副作用)；样本2、样本3、样本9、样本13服用美托洛尔后有一定的高甘油三酯血症风险(副作用)；样本4、样本7、样本10、样本14易产生高甘油三酯血症风险(副作用)，应谨慎使用或减少药物用量。
样本1、样本5、样本11、样本14对美托洛尔反应性最低；样本2、样本3、样本7、样本8、样本12有一定的美托洛尔抵抗；样本4、样本6、样本9、样本10、样本13对美托洛尔敏感，不易产生美托洛尔抵抗，可适当减少临床用量。
样本1、样本5、样本6、样本8、样本11、样本12对卡维地洛反应性最低，易发生卡维地洛抵抗，导致血药浓度升高；样本2、样本3、样本9、样本10、样本13、样本14有一定的卡维地洛抵抗；样本4、样本7对卡维地洛敏感，不易发生卡维地洛抵抗，可适当减少临床用量。
样本4、样本8、样本14对替米沙坦反应性最低，易发生替米沙坦抵抗；样本2、样本5、样本9、样本10、有一定的替米沙坦抵抗；样本1、样本3、样本6、样本7、样本11、样本12样本13、对替米沙坦敏感，不易发生替米沙坦抵抗，可适当减少临床用量。
样本3、样本6、样本9、样本11对培哚普利反应性最低，易发生培哚普利抵抗；样本2、样本4、样本5、样本7、样本8、样本10、样本13、样本14有一定的培哚普利抵抗；样本1、样本12不易发生培哚普利抵抗，可适当减少临床用量。
样本3、样本6、样本7、样本9、样本11对氯沙坦反应性降低，易发生氯沙坦抵抗；样本1、样本2、样本4、样本8、样本10、样本12、样本13有一定的氯沙坦抵抗；样本5、样本14对氯沙坦敏感，可适当减少临床用量。
样本1、样本5、样本9、样本12服用依那普利后，不易产生刺激性干咳的副作用；样本4、样本6、样本8、样本13服用依那普利后，会有一定程度的刺激性干咳；样本2、样本3、样本7、样本10、样本11、样本14服用依那普利后，更易引起刺激性干咳，应适当减少临床用量或慎重服用。
样本1、样本3、样本6、样本12对呋塞米代谢反应最好，利尿效果最明显，样本7、样本11、样本13、样本14对呋塞米有较好的代谢能力，样本2、4、5、8、9、10对呋塞米反应性最低，利尿效果不明显。
样本1、样本3、样本6、样本7、样本11、样本12、样本13对托拉塞米代谢反应最好，利尿效果最明显；样本2、样本5对托拉塞米有一定的代谢能力；样本4、样本8、样本9、样本10、样本14易发生托拉塞米抵抗，利尿效果差。
样本1、3、7、12对厄贝沙坦反应好，样本2、4、5、6、8、9、10、11、13、14服用厄贝沙坦后易导致药物蓄积，血药浓度升高。
样本1、样本3、样本6、样本7、样本11、样本12、样本14对螺内酯反应差，易发生螺内酯抵抗；样本4、样本9、样本10、样本13对螺内酯有一定的抵抗，反应性一般；样本2、样本5、样本8对螺内酯反应性最好，不易发生螺内酯抵抗，可减少临床用量。
样本1、样本3、样本4、样本6、样本11对地高辛的反应性最强，代谢能力最好，不易发生地高辛中毒；样本2、样本5、样本7、样本10、样本13、14对地高辛有一定的代谢能力；样本8、样本9、样本12对地高辛抵抗，代谢能力差，易产生地高辛中毒。
经过临床用药验证发现，上述样本1-14对于该11种慢性心力衰竭用药的反应性情况与采用本发明提供的检测慢性心力衰竭精准用药相关基因的snp位点的专用引物及方法所检测得到的结果一致(具体结果不再赘述)，表明采用本发明提供的检测慢性心力衰竭精准用药相关基因的snp位点的专用引物及方法可以很好地预测检测慢性心力衰竭用药反应性(含副作用)的风险。
对比例1
引物设计是该项发明的关键，引物与模板的结合率直接影响pcr扩增及单碱基延伸效率，从而影响检测结果的灵敏度和检出率，尤其是单碱基延伸引物(uep)的设计要求非常高，每条单碱基延伸引物除了要求序列与检测位点前的序列完全碱基互补配对外，这19条单碱基延伸引物的分子量及扩增得到的片段的碱基长度都必须呈梯度递增，以使产物产生分子量差异，从而实现质谱检测。
针对每个snp位点，发明人平行设计了3组pcr引物和单碱基延伸引物，分别为引物组1、引物组2、引物组3(实施例1-3使用的为引物组3)，按照实施例2中的方法将384例样本分别用3组引物检测，通过比较，实施例2(使用了引物组3)检测效果最好：检出率高，灵敏度高，聚类效果好，特异性高，可信度高。
表3.引物组1
表4引物组2
引物组3见上述序列1-序列57。
使用引物组1和引物组2均出现位点检出率低，聚类效果差的情况。
其中，使用引物组1时，在384例受检样本中，各个位点的检出率如下：rs1042714的检出率为81.7％、rs5443的检出率为1.56％、rs5186的检出率为78.1％、rs495828的检出率为85.7％、rs1529927的检出率为75.6％、rs5063的检出率为91.3％、rs275651的检出率为55.3％、rs1042323的检出率为0.52％、rs1131667的检出率为65.9％、rs1057910的检出率为48.7％、rs1799722的检出率为35.4％、rs17268282的检出率为75.8％、rs4961的检出率为66.9％、rs4148323的检出率为93.5％、rs3890011的检出率为89.3％、rs1934969的检出率为53.2％、rs2032582的检出率为88.1％、rs1799853的检出率为52.3％、rs1045642的检出率为55.1％。
使用引物组2时，在384例受检样本中，各个位点的检出率如下：rs1042714的检出率为55.2％、rs5443的检出率为22.3％、rs5186的检出率为34.2％、rs495828的检出率为33.8％、rs1529927的检出率为46.5％、rs5063的检出率为88.3％、rs275651的检出率为76.7％、rs1042323的检出率为81.5％、rs1131667的检出率为23.9％、rs1057910的检出率为88.9％、rs1799722的检出率为90.5％、rs17268282的检出率为89.3％、rs4961的检出率为92.3％、rs4148323的检出率为85.2％、rs3890011的检出率为92.3％、rs1934969的检出率为33.6％、rs2032582的检出率为40.5％、rs1799853的检出率为55.2％、rs1045642的检出率为87.0％。
其中，图20是rs1042323位点使用引物组1的检测结果；图21是rs5443位点使用引物组1的检测结果；图22是rs1042323位点使用引物组2的检测结果；图23是rs1045642位点使用引物组2的检测结果。
对比例2
除了在实施例2使用的所有引物的基础上另外再加入华法林药物抵抗相关位点rs9923231的引物组之外，其他均与实施例2相同。
其中，华法林药物抵抗相关位点rs9923231的引物序列如下：
rs9923231-pcr引物1：5′-acgttggatggctaggattataggcgtgag-3′；
rs9923231-pcr引物2：5′-acgttggatgtctgggaagtcaagcaagag-3′；
rs9923231-uep引物：5′-gattataggcgtgagccaccgcacc-3′。
结果发现，在保持实施例2的各种操作参数不变的情况下，即使增加一个前述19个位点之外的华法林药物抵抗相关位点rs9923231的相关引物组，就会破坏实施例2的反应体系和反应条件的兼容性，导致前述19个snp位点的检出率出现下降，聚类效果变差。
具体地，各个位点的检出率如下：rs1042714的检出率为88.2％、rs5443的检出率为33.9％、rs5186的检出率为65.3％、rs495828的检出率为35.9％、rs1529927的检出率为19.0％、rs5063的检出率为46.3％、rs275651的检出率为90.2％、rs1042323的检出率为54.8％、rs1131667的检出率为55.2％、rs1057910的检出率为86.7％、rs1799722的检出率为42.5％、rs17268282的检出率为51.2％、rs4961的检出率为35.8％、rs4148323的检出率为36.2％、rs3890011的检出率为29.6％、rs1934969的检出率为52.7％、rs2032582的检出率为90.6％、rs1799853的检出率为38.7％、rs1045642的检出率为46.6％。
图24示出了rs1529927位点的检测结果，图25示出了rs1057910位点的检测结果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>北京大学人民医院
<120>用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的引物及应用
<160>57
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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1.一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物，其特征在于：
包括引物组1和引物组2，其中：
所述引物组1为特异性pcr引物，包括引物对1、引物对2、引物对3、引物对4、引物对5、引物对6、引物对7、引物对8、引物对9、引物对10、引物对11、引物对12、引物对13、引物对14、引物对15、引物对16、引物对17、引物对18、引物对19；
所述引物对1由序列1所示的单链dna分子和序列2所示的单链dna分子组成；
所述引物对2由序列3所示的单链dna分子和序列4所示的单链dna分子组成；
所述引物对3由序列5所示的单链dna分子和序列6所示的单链dna分子组成；
所述引物对4由序列7所示的单链dna分子和序列8所示的单链dna分子组成；
所述引物对5由序列9所示的单链dna分子和序列10所示的单链dna分子组成；
所述引物对6由序列11所示的单链dna分子和序列12所示的单链dna分子组成；
所述引物对7由序列13所示的单链dna分子和序列14所示的单链dna分子组成；
所述引物对8由序列15所示的单链dna分子和序列16所示的单链dna分子组成；
所述引物对9由序列17所示的单链dna分子和序列18所示的单链dna分子组成；
所述引物对10由序列19所示的单链dna分子和序列20所示的单链dna分子组成；
所述引物对11由序列21所示的单链dna分子和序列22所示的单链dna分子组成；
所述引物对12由序列23所示的单链dna分子和序列24所示的单链dna分子组成；
所述引物对13由序列25所示的单链dna分子和序列26所示的单链dna分子组成；
所述引物对14由序列27所示的单链dna分子和序列28所示的单链dna分子组成；
所述引物对15由序列29所示的单链dna分子和序列30所示的单链dna分子组成；
所述引物对16由序列31所示的单链dna分子和序列32所示的单链dna分子组成；
所述引物对17由序列33所示的单链dna分子和序列34所示的单链dna分子组成；
所述引物对18由序列35所示的单链dna分子和序列36所示的单链dna分子组成；
所述引物对19由序列37所示的单链dna分子和序列38所示的单链dna分子组成；
所述引物组2为单碱基延伸引物，包括单碱基延伸引物1、单碱基延伸引物2、单碱基延伸引物3、单碱基延伸引物4、单碱基延伸引物5、单碱基延伸引物6、单碱基延伸引物7、单碱基延伸引物8、单碱基延伸引物9、单碱基延伸引物10、单碱基延伸引物11、单碱基延伸引物12、单碱基延伸引物13、单碱基延伸引物14、单碱基延伸引物15、单碱基延伸引物16、单碱基延伸引物17、单碱基延伸引物18、单碱基延伸引物19；
所述单碱基延伸引物1为序列39所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物2为序列40所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物3为序列41所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物4为序列42所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物5为序列43所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物6为序列44所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物7为序列45所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物8为序列46所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物9为序列47所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物10为序列48所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物11为序列49所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物12为序列50所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物13为序列51所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物14为序列52所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物15为序列53所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物16为序列54所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物17为序列55所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物18为序列56所示的单链dna分子；
所述单碱基延伸引物19为序列57所示的单链dna分子。
2.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于：
所述引物组1中的引物对1-引物对19中的各条引物为等摩尔比混合，构成扩增引物mix；
所述引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物19为等摩尔比混合，构成单碱基延伸引物mix。
3.根据权利要求1所述的专用引物，其特征在于：
所述snp位点包括：rs1042714、rs5443、rs5186、rs495828、rs1529927、rs5063、rs275651、rs1042323、rs1131667、rs1057910、rs1799722、rs17268282、rs4961、rs4148323、rs3890011、rs1934969、rs2032582、rs1799853、rs1045642。
4.一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的制剂，其特征在于：
所述制剂包括试剂一和试剂二；其中：
所述试剂一包括根据权利要求1所述的引物组1中的引物对1-引物对19，以及pcr缓冲液、mgcl2、dntp和dna聚合酶；
所述试剂二包括根据权利要求1所述的引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物19，以及单碱基延伸缓冲液、单碱基延伸酶、单碱基延伸终止mix。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于：
所述试剂一中，所述引物对1-引物对19中的38条引物在所述试剂一中的浓度均为0.5μm；
所述mgcl2在所述试剂一中的浓度为2mm；
所述dntp在试剂一中的浓度为0.5mm；
所述dna聚合酶在试剂一中的浓度为0.2u/μl；
所述试剂二中，所述单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物19在试剂二中的浓度均为0.5μm。
6.根据权利要求4或5所述的制剂，其特征在于：
所述snp位点包括：rs1042714、rs5443、rs5186、rs495828、rs1529927、rs5063、rs275651、rs1042323、rs1131667、rs1057910、rs1799722、rs17268282、rs4961、rs4148323、rs3890011、rs1934969、rs2032582、rs1799853、rs1045642。
7.权利要求1-3中任一项所述的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的专用引物，或权利要求4-6中任一项所述的用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的制剂在制备用于检测慢性心力衰竭用药抗药性的产品中的应用。
8.一种用于检测慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点的方法，包括如下步骤：
1)用根据权利要求1所述的用于检测慢性心力衰竭用药抗药性相关基因的snp位点的专用引物的引物组1中的引物对1-引物对21，以待测样本的基因组dna为模板进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；
2)将所述pcr扩增产物进行碱性磷酸酶消化，得到消化产物；
3)将所述消化产物用根据权利要求1所述的用于检测慢性心力衰竭用药抗药性相关基因的snp位点的专用引物的引物组2中的单碱基延伸引物1-单碱基延伸引物19进行单碱基延伸反应，得到单碱基延伸反应产物；
4)将所述单碱基延伸反应产物经过纯化后，进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测，得到待测样本中慢性心力衰竭精准用药相关基因snp位点信息。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
步骤1)中，所述pcr扩增的程序为：
先94℃2min预变性；再94℃20s、56℃30s、72℃60s进行45个循环；再72℃3min；最后4℃保存；
步骤2)中，所述碱性磷酸酶消化的条件为：37℃、40min，85℃、5min，4℃保存；
步骤3)中，所述单碱基延伸反应的程序为：94℃30s；先94℃5s，再52℃5s、80℃5s、5个循环，共进行40个循环；再72℃3min；最后4℃保存；
步骤4)中，所述纯化为树脂纯化。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：
所述snp位点包括：rs1042714、rs5443、rs5186、rs495828、rs1529927、rs5063、rs275651、rs1042323、rs1131667、rs1057910、rs1799722、rs17268282、rs4961、rs4148323、rs3890011、rs1934969、rs2032582、rs1799853、rs1045642。
技术总结