本发明涉及rna检测技术领域，特别是涉及一种用于孤独症辅助诊断的circrna检测试剂盒。
背景技术：
孤独症谱系障碍(autismspectrumdisorder，asd)是一组严重影响儿童身心健康的神经发育障碍疾病，患儿主要表现为不同程度的语言障碍、社交障碍、兴趣狭窄以及行为方式刻板等。多起病于婴幼儿期。目前，孤独症已成为我国6岁以下儿童致残的主要原因，严重危害了儿童身心健康并给社会和家庭带来沉重的经济和精神负担。
目前，国际上临床诊断asd的方法主要是依据对患儿的言语、行为等主观观察和评估。使用孤独症行为量表(autismbehaviorchecklist，abc)、儿童孤独症评定量表(childhoodautismratingscale，cars)、孤独症诊断观察量表(autismdiagnosticobservationschedule，2ndedition，ados-2)和孤独症诊断访谈量表修订版(autismdiagnosticinterviewrevised，adi-r)进行评估。这些诊断所需的信息基本来源于患儿主要照顾者对患病儿童的描述，导致信息偏主观化，产生很多误差，容易造成漏诊和误诊。而且对于不具有典型症状的asd患者，需要较长的时间才能准确识别、诊断。这一等待时间就推延了儿童诊断和进行早期干预的关键阶段，阻碍了患儿孤独症症状的缓解和改善。
asd病因复杂，发病机制尚不明确。虽然大量研究发现了与asd相关的遗传因素，但这些遗传因素仅能解释10％～30％的asd病因，并未发现确切的asd致病基因。近年来，表观遗传机制被认为是导致神经发育异常的潜在诱因。人类基因组中73％区域的转录产物是非编码rna。环状rna(circularrna，circrna)是新兴的一类不具有游离的5'端帽子和3'端poly(a)尾巴，以共价键形成环形结构的特殊非编码rna分子。circrna不易被rna核酸外切酶降解，比线性rna更加稳定，大量存在于真核细胞的细胞质中，具有一定的组织性、时序性和疾病特异性，是一种表达稳定的潜在生物标志物。
准确地确定患者的表观遗传数据，是精准医疗的前提，对孤独症患儿进行孤独症相关circrna的检测，是早期有效诊断孤独症患者的必要前提。但是，目前对于孤独症没有一个早期、客观的诊断的方法。发明一种新型、非侵入性、生物学客观的用于孤独症辅助诊断的circrna检测的试剂盒，具有重大的社会经济意义以及临床价值。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于孤独症辅助诊断的circrna检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供circrnahsa_circ_0004566作为孤独症生物标志物的应用。
本发明还提供一种用于孤独症辅助诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括检测hsa_circ_0004566的引物组。
优选的，所述检测hsa_circ_0004566的引物组序列如seqidno.1和seqidno.2所示。
优选的，所述试剂盒中还包括rna提取试剂，enzymemix，reactionbuffer、randomprimers，无核酸酶水，premixextaqii和roxdyeii。
优选的，所述试剂盒中还包括检测内参基因的引物组。
优选的，所述的内参基因为gapdh，所述的检测内参基因的引物组序列如seqidno.3和seqidno.4所示。
本发明还提供一种利用所述的用于孤独症辅助诊断的试剂盒检测circrnahsa_circ_0004566的方法，所述试剂盒的使用方法为：先提取待测样品总rna，再进行circrna逆转录，所得产物进行qpcr从而检测hsa_circ_0004566的相对表达。
优选的，所述circrna逆转录体系为：enzymemix2μl，reactionbuffer、randomprimers4μl，总rna500ng，无核酸酶水补足20μl。
优选的，所述qpcr反应体系为premixextaqii10.0μl和roxdyeii0.5μl，正向引物和反向引物各0.5μl，cdna2.0μl，无核酸酶水6.5μl。
优选的，所述qpcr反应程序为95℃预变性120s；95℃变性15s，63℃退火20s，共50个循环。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供两种circrna作为孤独症标志物的应用以及用于孤独症辅助诊断的试剂盒。本发明所述的用于孤独症辅助诊断的试剂盒能够非侵入(大脑组织)性、生物学客观的检测孤独症标志物，具有快速、灵敏、特异的特点，可在早期识别孤独症患儿、辅助诊断孤独症患者以及时进行干预和治疗中发挥作用，具有重大的临床价值和社会经济意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为hsa_circ_0004566的熔解曲线图；
图2为gapdh的熔解曲线图；
图3为病例组和对照组hsa_circ_0004566表达水平比较图；
图4为hsa_circ_0004566诊断孤独症的roc曲线图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1
(1)trizol法提取孤独症病人血浆或血清中总rna
1)吸取300μl血浆或血清于新的ep管中,加入900μltrizol,室温下静置5min；
2)加入300μl氯仿,剧烈震荡15s,室温下静置5min；
3)4℃下12,000rpm高速离心15min；
4)将上层血浆或血清转移至另一干净的ep管中(不能吸到分层以下油质),加入500μul异丙醇,放置于-20℃冰箱中10min；
5)4℃下12,000pm高速离心10min；
6)弃去上清,加入1ml预冷的75％ch3ch2oh；
7)4℃下7,500mpm离心5min；弃去上清,室温下晾干10-30min(不可完全风干也不可晾干不彻底)；
8)加入20μldepc处理水,55-60℃水浴促溶10min。所有容器及移液管均为无酶以防止rna降解。
(2)琼脂糖凝胶电泳进行rna质控
使用酶标仪检测总rna纯度和浓度。在260mm波长下测定各样本od值,每个样本重复三次。
每个样本的纯度(od)值在1.8-2.0范围，由于样本较多，仅列出部分样本的浓度和纯度。如表1所示。
表1样本的浓度和纯度
(3)circrna逆转录
反转录体系总体积为20μl。反应条件为：25℃5min，42℃60min，95℃5s。反应所需试剂如表2所示。
表2使用的试剂
(4)实时荧光定量pcr
qpcr检测hsa_circ_0004566的引物由primerpremier5.0软件设计，引物信息如表3所示。反应体系总体积为20μl，反应所需试剂如表4所示。反应条件为：95℃预变性120s；95℃变性15s，63℃退火20s，共50个循环，并进行熔解曲线检测。hsa_circ_0004566的核苷酸序列如seqidno.5所示。hsa_circ_0004566和gapdh的熔解曲线图如图1、图2所示。
表3引物序列信息(seqidno.1-seqidno.4)
表4所用试剂
hsa_circ_0004566基因序列(seqidno.5)：aaactctgtctccaaaaaaaaaaaaaaggccttttaaaaacttagcttactggtaatgttttgtttctgtggcgagattgcccacttgggttatttggtttcttacgtataaaaagccccagagcctctaaaatctggttttatggtgatttcacaagattgtatcagtgtcatctactcttttttgtgctggactttggatttacctttaagttgttgcaattgctgcattgtgacgtaaaggtatttgatgaatgaagttaagttttggccttggcacagtgaccaggagctgagcagtgggtcatgggagaggaagggcgatggaataaaccgtgtggaccaaatggagggagacgagagcgatgaaagaactgaggctgaaattattattgacatgagctaatctcactctcttgtttcagaatatatacagccctgctctgggacacacctccattggatttaaaagacagtcctcgtcagcactgactttcagctatggaatcgggtctcagtcgctcgcccaggtggagtgcagtggtgccaccctaactgactgcagccttgagcttctgtgcggaagtgatcctcccacctcggcctcttaaagttctgggattataggtttggcctagagctctttcttcttaggtaactttaactttttacccgttgattgtattaaataattttctttccctatccctaacgtggcaaataacccacttaaaggggttgatgagagtaaggagtccagagtggtaagagcatttaaaacctcacattgctccaccattcagagagagccgccattagtacctcctgggtttcctaacacagaatgcgtgtagccgactccttagcacctgggttatcatcttgtcctgttgccatttccataggtagaa。
(5)数据处理
以gapdh作为内参基因，使用2－δct法计算目标circrna的相对表达。δct＝ct(目的circrna)-ct(gapdh)。
孤独症病例组和健康对照组的hsa_circ_0004566的相对表达量分别为0.68±0.26和1.02±0.21，差异有统计学意义(t＝-6.674，p<0.001)，病例组比对照组下调了34％，如图3所示。结果表明hsa_circ_0004566在病例组和对照组中表达水平存在显著差异。
为评估hsa_circ_0004566作为孤独症的诊断标志物的潜力，采用受试者工作特征曲线(receiveroperatingcharacteristiccurve，roc)进行分析。roc曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，是用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值，从而计算出一系列灵敏度(sensitivity，简写sen)和特异度(specificity，简写spe)，再以灵敏度为纵坐标、(1-特异度)为横坐标绘制成曲线。曲线下面积越大，诊断准确性越高。在roc曲线上，最靠近坐标图左上方的点为敏感性和特异性均较高的临界值。roc曲线下的面积值(auc)在1.0和0.5之间。在auc>0.5的情况下，auc越接近于1，说明诊断效果越好。auc在0.5～0.7时有较低准确性，auc在0.7～0.9时有一定准确性，auc在0.9以上时有较高准确性。hsa_circ_0004566的roc曲线下面积(areaunderthecurve，auc)为0.803(95％ci：0.733～0.872，p<0.001)，灵敏度和特异度分别为82.5％和76.9％，见图4。可见hsa_circ_0004566可作为诊断孤独症的可靠的、有潜力的生物标志物，为孤独症相关circrna的研究提供指导意义。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110>华北理工大学
<120>一种用于孤独症辅助诊断的circrna检测试剂盒
<160>5
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ctatggaatcgggtctcagtcgctc25
<210>2
<211>25
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
tacaatcaacgggtaaaaagttaaa25
<210>3
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
acaactttggtatcgtggaagg22
<210>4
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
gccatcacgccacagtttc19
<210>5
<211>911
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>5
aaactctgtctccaaaaaaaaaaaaaaggccttttaaaaacttagcttactggtaatgtt60
ttgtttctgtggcgagattgcccacttgggttatttggtttcttacgtataaaaagcccc120
agagcctctaaaatctggttttatggtgatttcacaagattgtatcagtgtcatctactc180
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ttaactttttacccgttgattgtattaaataattttctttccctatccctaacgtggcaa720
ataacccacttaaaggggttgatgagagtaaggagtccagagtggtaagagcatttaaaa780
cctcacattgctccaccattcagagagagccgccattagtacctcctgggtttcctaaca840
cagaatgcgtgtagccgactccttagcacctgggttatcatcttgtcctgttgccatttc900
cataggtagaa911
1.circrnahsa_circ_0004566作为孤独症生物标志物的应用。
2.一种用于孤独症辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括检测hsa_circ_0004566的引物组。
3.根据权利要求2所述的一种用于孤独症辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述检测hsa_circ_0004566的引物组序列如seqidno.1和seqidno.2所示。
4.根据权利要求2所述的一种用于孤独症辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括rna提取试剂，enzymemix，reactionbuffer、randomprimers，无核酸酶水，premixextaqii和roxdyeii。
5.根据权利要求2所述的一种用于孤独症辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括检测内参基因的引物组。
6.根据权利要求5所述的一种用于孤独症辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述的内参基因为gapdh，所述的检测内参基因的引物组序列如seqidno.3和seqidno.4所示。
7.一种利用权利要求2-6任一项所述的用于孤独症辅助诊断的试剂盒检测circrnahsa_circ_0004566的方法，其特征在于，所述试剂盒的使用方法为：先提取待测样品总rna，再进行circrna逆转录，所得产物进行qpcr从而检测hsa_circ_0004566的相对表达。
8.根据权利要求7所述的用于孤独症辅助诊断的试剂盒检测circrnahsa_circ_0004566的方法，其特征在于，所述circrna逆转录体系为：enzymemix2μl，reactionbuffer、randomprimers4μl，总rna500ng，无核酸酶水补足20μl。
9.根据权利要求7所述的用于孤独症辅助诊断的试剂盒检测circrnahsa_circ_0004566的方法，其特征在于，所述qpcr反应体系为premixextaqii10.0μl和roxdyeii0.5μl，正向引物和反向引物各0.5μl，cdna2.0μl，无核酸酶水6.5μl。
10.根据权利要求7所述的用于孤独症辅助诊断的试剂盒检测circrnahsa_circ_0004566的方法，其特征在于，所述qpcr反应程序为95℃预变性120s；95℃变性15s，63℃退火20s，共50个循环。
技术总结