本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种胃癌标志物及其应用。
背景技术：
胃癌是严重危害人类健康的疾病，发病率占我国恶性肿瘤第二位，死亡率占我国恶性肿瘤第三位。由于早期诊断不灵敏等原因，很多胃癌患者被发现时已处于中晚期，预后较差。对于无法手术的患者，化疗是常用的治疗方案，然而现在的化疗方案仍缺乏靶向性，且有诸多副作用，迫切需要寻找更加有效的胃癌治疗靶点和预后指标。
circrnas是一类具有环状闭合结构的rna分子，由于circrnas在肿瘤的侵袭、转移及耐药等方面有着重要作用，且具有组织疾病特异性及稳定性等优点，已成为近年来肿瘤领域的研究热点，但是目前并没有一种可明确治疗且具有胃癌标志作用的circrnas出现。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种胃癌标志物及其应用，hsa_circ_0061137的编码蛋白质可以抑制胃癌细胞的生长和转移，将为胃癌的预后和治疗提供一条全新的途径，hsa_circ_0061137和其编码的蛋白质有望成为胃癌的预后标志物和临床治疗的靶分子。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种胃癌标志物，所述标志物为环状rnahsa_circ_0061137，所述hsa_circ_0061137的核苷酸序列为seqidno.1所示。
优选的，所述标志物编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。
本发明还提供了一种检测所述标志物的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示：tgggcgagcgatcacaattac，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示：cagacgaaacctctgggtcc。
本发明还提供了一种检测所述标志物的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对。
优选的，所述试剂盒中还包括dna聚合酶、缓冲液和水。
本发明还提供了上述标志物在制备胃癌预后判断和治疗药物中的应用。
本发明还提供了上述标志物在制备抑制胃癌细胞增殖的药物中的应用。
本发明还提供了一种用于胃癌预后判断和治疗的药物，所述药物的有效成分包括所述标志物的编码蛋白质。
本发明还提供了一种抑制胃癌细胞增殖的药物，所述药物的有效成分包括所述标志物的编码蛋白质。
优选的，所述药物中还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
本发明提供了一种胃癌标志物，所述标志物为环状rnahsa_circ_0061137，位于20号染色体上，全长1787bp，由dido1基因2-6号外显子转录后经反向剪切形成。本发明所述标志物hsa_circ_0061137在胃癌组织中低表达，且胃癌组织中hsa_circ_0061137表达较低的患者预后更差；当过表达所述标志物hsa_circ_0061137的蛋白时，可以抑制胃癌细胞增殖。本发明所述胃癌标志物的发现，为胃癌的预后和治疗提供了一条全新的途径，hsa_circ_0061137和其编码的蛋白质有望成为胃癌的预后标志物和临床治疗的靶分子。
附图说明
图1为hsa_circ_0061137实时定量pcr扩增产物溶解曲线及测序分析；
图2为hsa_circ_0061137在胃癌组织中的表达及与预后关系；
图3为hsa_circ_0061137编码蛋白可抑制胃癌细胞增殖能力；
图4为hsa_circ_0061137所编码蛋白的过表达载体结构示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种胃癌标志物，所述标志物为环状rnahsa_circ_0061137，所述hsa_circ_0061137的核苷酸序列为seqidno.1所示。
本发明所述环状rnahsa_circ_0061137，位于20号染色体上，全长1787bp，由dido1基因2-6号外显子转录后经反向剪切形成；所述hsa_circ_0061137可编码一段长度为529氨基酸的蛋白质，其氨基酸序列优选如seqidno.2所示。在本发明中，过表达所述hsa_circ_0061137的蛋白质可以起到抑制胃癌细胞增殖的效果。
本发明还提供了一种检测所述标志物的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示(tgggcgagcgatcacaattac)，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示(cagacgaaacctctgggtcc)。本发明所述引物对优选为反向扩增引物，扩增的片段优选为209bp。
本发明还提供了一种检测所述标志物的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对。
本发明所述试剂盒中优选还包括dna聚合酶、缓冲液和水，在本发明中所述dna聚合酶和缓冲液优选以2×mixture的形式存在；所述水优选为rnasefree双蒸水。
本发明还提供了上述标志物在制备胃癌预后判断和治疗药物中的应用。
在本发明中，过表达所述标志物的蛋白质，具有抑制胃癌细胞增殖的能力，所以可作为胃癌预后判断和治疗的药物或治疗靶点。
本发明还提供了上述标志物在制备抑制胃癌细胞增殖的药物中的应用。
本发明还提供了一种用于胃癌预后判断和治疗的药物，所述药物的有效成分包括所述标志物的编码蛋白质。本发明所述药物中优选还包括药学上可接受的载体和/或辅料。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定。
本发明还提供了一种抑制胃癌细胞增殖的药物，所述药物的有效成分包括所述标志物的编码蛋白质。本发明所述药物中优选还包括药学上可接受的载体和/或辅料。本发明对所述药物的剂型并没有特殊限定。
下面结合实施例对本发明提供的胃癌标志物及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
对胃癌circrna芯片数据集gse83521和gse891436进行分析时，发现环状rnahsa_circ_0061137在两个数据集中的胃癌组织中都显著低表达。根据hsa_circ_0061137所示的cdna序列(seqidno.1)，设计反向扩增引物序列，引物具体序列见seqidno.3(tgggcgagcgatcacaattac)和seqidno.4(cagacgaaacctctgggtcc)，pcr产物大小209bp。并采用测序和琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物特异性和正确性(图1)。
rna样品制备：向细胞样品中加入1mltrizol裂解细胞(若为组织，则向30mg组织中加入1mltrizol匀浆)；加入200μl氯仿，振荡混匀，放置3min；4℃，10000×g离心15min，取上层水相加入新ep管；加入500μl异丙醇，混匀，室温放置10min；4℃，10000×g离心10min，吸弃上清；加入75％乙醇1ml洗涤沉淀，7500×g离心5min，弃上清；室温干燥，加入无rnase水溶解，并测浓度和纯度。
rna逆转录：采用hiscript1ststrandcdnasynthesiskit(vazyme)，试剂成分与反应体系如下：
在pcr仪器上逆转录程序：25℃5min，50℃15min，85℃5min。运行结束后，cdna产物于4℃保存。
实时荧光定量pcr：采用aceqqpcrsybrgreenmastermix(vazyme)，试剂成分与反应体系如下：
实时荧光定量pcr反应程序为：95℃5min预变性；95℃10s变性，55℃30s退火，72℃30s延伸，40个循环；72℃至95℃熔解曲线分析。
琼脂糖凝胶电泳具体操作如下：配制3％琼脂糖凝胶，加热融化后倒入制胶槽，插入梳子，室温放置使琼脂糖凝胶冷却凝固；将pcr产物与10×上样缓冲液混匀，加入凝胶孔中；100v电泳至溴酚蓝跑至距离胶2/3处；将琼脂糖凝胶放置于eb溶液中染色10min；置于凝胶成像仪中成像。
实施例2
样本收集：样本收集于2015年6月至2016年2月在镇江市第一人民医院普外科行胃癌切除术的患者，共收集胃癌组织37例和配对健康组织37例。纳入胃癌患者的胃癌组织均经病理学组织学确诊，术前未经药物、放化疗及其他辅助治疗。样本收集前均获得患者及家属知情同意书，并经镇江市第一人民医院和江苏大学伦理委员会批准。收集病人性别、年龄、预后情况等病理资料。
结果显示，hsa_circ_0061137在胃癌组织中表达下调(图2中a)。预后分析结果显示，hsa_circ_0061137低表达的患者预后较差(图2中b)。
实施例3
hsa_circ_0061137可编码长度为529个氨基酸的蛋白，序列如seqidno.2所示。由广州伯信生物科技有限公司合成构建该蛋白过表达载体(图4)，转染胃癌细胞mgc-803和hgc-27，检测该蛋白对胃癌细胞功能的影响。
细胞转染：将处于对数生长期的mgc-803和hgc-27细胞弃去培养基，消化后接种于6孔板；24h后，将有血清细胞培养基换成无血清培养基；将10μl的lipofiter转染试剂与100μl无血清培养基混合，将4μg质粒与100μl无血清培养基混合室温放置5min；将两者混合，室温静置20min；将混合物加入6孔板；6h后，将6孔板培养基换成有血清培养基。
细胞生长曲线：消化对照组和实验组细胞并计数；向每个24孔接种1×104个细胞；每天消化24孔板中对照组和实验组细胞并计数，连续计数5天；此实验平行重复3次，绘制细胞生长曲线，并做统计分析。结果显示hsa_circ_0061137过表达抑制胃癌细胞增殖(图3)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>江苏大学
<120>一种胃癌标志物及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1787
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
gagcttactccacgggaacagcctctagataatctgagttgttgaaaatacgaagcctgt60
tactcgtgaacagtggctgacaacagtgttgttgtgagcctggctgtctgcttggaccca120
gaggtttcgtctgccagggtttttggttgtatttaggatttcagggaaaagtgtccaagc180
tttcagtgttggagcaggtatggacgacaaaggcgacccgagcaatgaggaggcacctaa240
ggccatcaaacccaccagcaaagagttcaggaaaacatggggttttcgaaggaccactat300
cgccaagcgagagggcgcaggggacgcggaggctgacccactggagccgccacccccaca360
gcagcagctgggcctgtccctgcggcgcagtgggaggcagcccaagcgcactgagcgcgt420
ggagcagttcctgaccattgcgcggcgccgcggcaggaggagcatgcctgtctccctgga480
ggattctggtgagcccacgtcctgccccgccacagacgccgagacagcctccgagggcag540
cgtggaaagcgcttctgagaccagaagcggcccccagtctgcttccacagctgtgaagga600
acgaccagcctcttctgaaaaggtgaaaggaggggatgaccacgatgacacctccgatag660
tgacagcgatggcctgaccttgaaagagcttcagaatcgccttcgcaggaagcgggaaca720
ggagcccactgagaggcccctgaaagggatccagagtcgcctgcggaagaagcgccggga780
ggagggtcccgccgagactgtgggctccgaggccagtgacactgtggagggcgtcctgcc840
cagtaagcaggagcccgagaacgatcagggggttgtgtcccaggctgggaaagatgacag900
agagagtaagttggagggaaaggcggctcaggacatcaaagatgaggagcctggagactt960
gggccgaccgaagcctgaatgtgagggttacgaccccaacgccctgtattgcatttgccg1020
ccagcctcacaacaacaggtttatgatttgctgtgaccgctgtgaagaatggtttcatgg1080
cgattgtgtgggcatttctgaggctcgagggaggcttttggaaaggaatggggaagacta1140
tatctgcccaaactgcaccattctgcaagtgcaggatgagactcattcagaaacggcaga1200
tcagcaggaagctaaatggagacctggagatgctgatggcaccgattgtacaagtatagg1260
aacaatagagcagaagtctagcgaagaccaagggataaagggtagaattgagaaagctgc1320
aaatccaagtggcaagaagaaactcaagatcttccagcctgtgatagaggcgcctggtgc1380
ctcaaaatgtattggccccgggtgctgtcacgtggcgcagcccgactcggtgtactgcag1440
taatgactgtatcctcaaacacgccgcagcgacaatgaagtttctaagctcaggtaaaga1500
acagaagccaaagcctaaagaaaagatgaagatgaagccagagaagcccagtcttccgaa1560
atgcggtgctcaggcaggtattaaaatctcttctgtgcacaagagaccagctccagaaaa1620
aaaagagaccacagtgaagaaggcagtggtggtccctgcgcggagtgaagcactcgggaa1680
ggaagcagcttgtgagagcagcacgccgtcgtgggcgagcgatcacaattacaatgcagt1740
aaagccagaaaagactgctgctccctcgccgtcactgttgtataaat1787
<210>2
<211>529
<212>prt
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
metaspasplysglyaspproserasngluglualaprolysalaile
151015
lysprothrserlysgluphearglysthrtrpglypheargargthr
202530
thrilealalysarggluglyalaglyaspalaglualaaspproleu
354045
gluproproproproglnglnglnleuglyleuserleuargargser
505560
glyargglnprolysargthrgluargvalgluglnpheleuthrile
65707580
alaargargargglyargargsermetprovalserleugluaspser
859095
glygluprothrsercysproalathraspalagluthralaserglu
100105110
glyservalgluseralasergluthrargserglyproglnserala
115120125
serthralavallysgluargproalaserserglulysvallysgly
130135140
glyaspasphisaspaspthrseraspseraspseraspglyleuthr
145150155160
leulysgluleuglnasnargleuargarglysarggluglnglupro
165170175
thrgluargproleulysglyileglnserargleuarglyslysarg
180185190
argglugluglyproalagluthrvalglyserglualaseraspthr
195200205
valgluglyvalleuproserlysglngluprogluasnaspglngly
210215220
valvalserglnalaglylysaspasparggluserlysleuglugly
225230235240
lysalaalaglnaspilelysaspglugluproglyaspleuglyarg
245250255
prolysproglucysgluglytyraspproasnalaleutyrcysile
260265270
cysargglnprohisasnasnargphemetilecyscysaspargcys
275280285
gluglutrpphehisglyaspcysvalglyileserglualaarggly
290295300
argleuleugluargasnglygluasptyrilecysproasncysthr
305310315320
ileleuglnvalglnaspgluthrhissergluthralaaspglngln
325330335
glualalystrpargproglyaspalaaspglythraspcysthrser
340345350
ileglythrilegluglnlyssersergluaspglnglyilelysgly
355360365
argileglulysalaalaasnproserglylyslyslysleulysile
370375380
pheglnprovalileglualaproglyalaserlyscysileglypro
385390395400
glycyscyshisvalalaglnproaspservaltyrcysserasnasp
405410415
cysileleulyshisalaalaalathrmetlyspheleusersergly
420425430
lysgluglnlysprolysprolysglulysmetlysmetlysproglu
435440445
lysproserleuprolyscysglyalaglnalaglyilelysileser
450455460
servalhislysargproalaproglulyslysgluthrthrvallys
465470475480
lysalavalvalvalproalaargserglualaleuglylysgluala
485490495
alacysgluserserthrprosertrpalaserasphisasntyrasn
500505510
alavallysproglulysthralaalaproserproserleuleutyr
515520525
lys
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
tgggcgagcgatcacaattac21
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
cagacgaaacctctgggtcc20
1.一种胃癌标志物，其特征在于，所述标志物为环状rnahsa_circ_0061137，所述hsa_circ_0061137的核苷酸序列为seqidno.1所示。
2.根据权利要求1所述标志物，其特征在于，所述标志物编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。
3.一种检测权利要求1所述标志物的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seqidno.3所示，所述下游引物的核苷酸序列如seqidno.4所示。
4.一种检测权利要求1所述标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求3所述引物对。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括dna聚合酶、缓冲液和水。
6.权利要求1或2所述标志物在制备胃癌预后判断和治疗药物中的应用。
7.权利要求1或2所述标志物在制备抑制胃癌细胞增殖的药物中的应用。
8.一种用于胃癌预后判断和治疗的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括权利要求1或2所述标志物的编码蛋白质。
9.一种抑制胃癌细胞增殖的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括权利要求1或2所述标志物的编码蛋白质。
10.根据权利要求8或9所述药物，其特征在于，所述药物中还包括药学上可接受的载体和/或辅料。
技术总结