本发明涉及肿瘤分子生物学领域，具体为一种lncrnafam167a-as1分子标志物及其在胃癌中的应用。
背景技术：
胃癌是世界上最普遍的癌症类型之一，在全世界的癌症死亡因素中排名第二。尽管化疗是针对进展期胃癌的一线治疗方法，但化疗药物的耐药性抑制了其疗效。在胃癌中，甚至在有氧情况下即可激活糖酵解通路，此异常现象被称为“瓦博格效应(warburgeffect)”。瓦博格效应不仅供应癌症所需的能量，而且降低氧化应激损伤，瓦博格效应产生的过度的乳酸可酸化细胞外基质且帮助肿瘤细胞逃避免疫监视。各种酶、转录因子(tf)和信号传导通路在瓦博格效应中协作调控。例如c-myc、hif-1a和p53是糖酵解中的三种关键转录因子。pi3k/akt通路会影响若干种酶。预期靶向瓦博格效应的抑制剂展示出了显著疗效且副作用很低。以2-去氧-d-葡萄糖和3-溴丙酮酸酯为例，其通过抑制己糖激酶2(hk2)来展现独特治疗潜力。这些新兴的治疗策略表明肿瘤代谢是临床干预的理想措施。
非编码rna(ncrna)，包括微rna(mirna)、长非编码rna(lncrna)和环状rna(circrna)，已被证明是重要的调控因子。常见的调控机制包括：lncrna通过结合mirna与转录因子相互作用而在调节瓦博格效应中起关键作用。例如lncrna-mif可与mir-586竞争性结合以降解c-myc，因而抑制瓦博格效应。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明主要内容为：fam167a-as1促进增殖和转移、拮抗细胞凋亡且促进瓦博格效应，fam167a-as1与lin28b和c-myc协同作用以形成激活胃癌的pi3k/akt通路的正反馈循环；因此采用检测fam167a-as1分子标志物更快捷、准确。位于染色体8p23.1中的lncrnafam167a-as1可转录为1222个碱基对(bp)的转录本。生物信息分析展示高表达fam167a-as1的胃癌患者具有更差的预后。
为了达到以上目的，本发明供如下技术方案：
本发明公开了一种检测组织中lncrnafam167a-as1分子标志物表达水平的试剂在制备胃癌诊断试剂中的应用，所述lncrnafam167a-as1分子标志物的核苷酸序列为seqidno.1。
核苷酸序列具体如下：
gaacagactggattagtgaaagctactgcagtgctttggacacttactatgatttagacttgcaatctacctggaattgatgtgagtatggtgtgagacagaacttcaggttgacttttggttctctatggatacccattagacccagtagatatagaaccatattcatggcaccagtgactgaagagtccacgcactccccactctgctgcagtgtcaccgtgatcataaatcaagtgggttgggatttccagttccttgatgaagagaagttacgagactgggcatccttgctttgttcctaaacaggaggtgaaaacattcagtcttctgccattaggtctgccttattattttcgtcagtgttgtgcaggagaatccacttagaagcctgggtaaaattgtattacatgatcttgggtttggtccctgagaaagagccagattaacgctggcaggaaagaaagcaggagtgcccttcaaacacgctgctgaagggcaactggaggttccggggaaatgtgaagaaagaaacgcaaacacccctaggaaccagattgcatcttggaactgaggaggttctggaagctgtacacccaaggaagacattctgtgccggagagagagtgggagagatgtgactgctgctggctgggtgaggacaggcccagaggacagcatcactggcacccacccctgcatttgggtcctctgcacctcagctcccagcatctgggcctcctccctgcctgcctccccccctcactcaatctgtctccactcaagaggctgatgggcaggtctccctgcttcttcaaatctttcaaagggaaacttcacaaagacaggagccctgacccatccaccttggcctcaccccaccccagcacggaagccaggcggccagtggaggccggtagtgctgaatggacatggggctggatgaaaagacttccgcctgcctctctcagccccggaatcgccatgagctgctattccggagattctatgctacagaagtacaaggtgaagaatgcataccgattacattggcaagggagagaagagcctggtgctagcacttttgcttctttggtctttcaataatgtctttccccttgattatacatgatatattcctattttggaaacttcgaaaactataaaaaagtcaaaagaataatattaccactcagaaataaagatcatcaagttttggtgt
在本发明中，所述检测组织中lncrnafam167a-as1分子标志物表达水平的试剂为实时定量pcr试剂。
在本发明中，根据核苷酸序列为seqidno.1的lncrnafam167a-as1分子标志物设计了引物用于检测该序列，引物核苷酸序列：上游引物：5’-gccggtagtgctgaatggac-3’，下游引物：5’-tccggaatagcagctcatgg-3’。
本发明还公开了一种用于胃癌诊断的实时定量pcr检测试剂盒，包括根据核苷酸序列为seqidno.1的lncrnafam167a-as1分子标志物设计并合成出特异性用于实时定量pcr的检测引物；检测方法具体为：样品总rna提取、rna反转录、进行qrt-pcr反应。
本发明还公开了一种评估胃癌预后的分子标志物，所述分子标志物为核苷酸序列为seqidno.1的lncrnafam167a-as1分子标志物。
本发明具有如下优点：
(1)提出了lncrnafam167a-as1分子标志物及其用途。(2)lncrnafam167a-as1分子标志物具有成为胃癌生物标志物的应用前景。
“瓦博格效应”是受各种突变酶、转录因子和信号传导通路影响的典型的肿瘤代谢途径。长非编码rna(lncrna)参与“瓦博格效应”的调控。fam167a-as1是与有氧糖酵解相关且与胃癌病人预后负相关的新型lncrna。fam167a-as1促进胃癌细胞增殖和迁移、增加葡萄糖消耗和乳酸生产且抑制凋亡。实时荧光定量pcr和蛋白质印迹的结果表明fam167a-as1在糖酵解的调控中起重要作用。计算机模拟和体外研究均表明fam167a-as1在转录水平下受c-myc调节。另外，细胞核中富集的fam167a-as1可与lin28b和c-myc结合。lin28b可与c-myc形成正反馈循环通路。本专利公开了lin28b蛋白可部分通过识别c-mycmrna的m6a甲基化位点而与c-mycmrna结合。fam167a-as1不仅可将c-myc募集至lin28b启动子，而且可以促进lin28b结合c-mycmrna，增强其稳定性，c-myc/fam167a-as1/lin28b轴加速pi3k/akt信号传导通路以促进胃癌进展。因此，开发靶向fam167a-as1的治疗手段可改良肿瘤代谢状态，有助于胃癌的治疗。
附图说明
图1.fam167a-as1在胃癌中上调且与不良预后相关。
图2.fam167a-as1在体外为致癌性lncrna。
图3.fam167a-as1通过上调pi3k/akt通路来加速糖酵解。
图4.在细胞核中富集的fam167a-as1能够与lin28b结合。
图5.c-myc在转录水平下调节fam167a-as1。
图6.fam167a-as1促进c-myc与lin28b之间的相互作用。
图7.fam167a-as1通过在体内上调lin28b而促进胃癌进展。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一种检测组织中lncrnafam167a-as1分子标志物表达水平的试剂在制备胃癌诊断试剂中的应用，所述lncrnafam167a-as1分子标志物的核苷酸序列为seqidno.1。
核苷酸序列具体如下：
gaacagactggattagtgaaagctactgcagtgctttggacacttactatgatttagacttgcaatctacctggaattgatgtgagtatggtgtgagacagaacttcaggttgacttttggttctctatggatacccattagacccagtagatatagaaccatattcatggcaccagtgactgaagagtccacgcactccccactctgctgcagtgtcaccgtgatcataaatcaagtgggttgggatttccagttccttgatgaagagaagttacgagactgggcatccttgctttgttcctaaacaggaggtgaaaacattcagtcttctgccattaggtctgccttattattttcgtcagtgttgtgcaggagaatccacttagaagcctgggtaaaattgtattacatgatcttgggtttggtccctgagaaagagccagattaacgctggcaggaaagaaagcaggagtgcccttcaaacacgctgctgaagggcaactggaggttccggggaaatgtgaagaaagaaacgcaaacacccctaggaaccagattgcatcttggaactgaggaggttctggaagctgtacacccaaggaagacattctgtgccggagagagagtgggagagatgtgactgctgctggctgggtgaggacaggcccagaggacagcatcactggcacccacccctgcatttgggtcctctgcacctcagctcccagcatctgggcctcctccctgcctgcctccccccctcactcaatctgtctccactcaagaggctgatgggcaggtctccctgcttcttcaaatctttcaaagggaaacttcacaaagacaggagccctgacccatccaccttggcctcaccccaccccagcacggaagccaggcggccagtggaggccggtagtgctgaatggacatggggctggatgaaaagacttccgcctgcctctctcagccccggaatcgccatgagctgctattccggagattctatgctacagaagtacaaggtgaagaatgcataccgattacattggcaagggagagaagagcctggtgctagcacttttgcttctttggtctttcaataatgtctttccccttgattatacatgatatattcctattttggaaacttcgaaaactataaaaaagtcaaaagaataatattaccactcagaaataaagatcatcaagttttggtgt
在本发明中，所述检测血液中lncrnafam167a-as1分子标志物表达水平的试剂为实时定量pcr试剂。
在本发明中，根据核苷酸序列为seqidno.1的lncrnafam167a-as1分子标志物设计了引物用于检测该序列，引物核苷酸序列：上游引物：5’-gccggtagtgctgaatggac-3’，下游引物：5’-tccggaatagcagctcatgg-3’。
lncrnafam167a-as1分子标志物作为胃癌诊断和预后的标志物。以下实验方法为具体实施例，实验结果如图所示。
数据库gse78523由45个组织组成，包括8个进展期胃癌的完整胃粘膜肠化生组织(cim-gc)、9个早期胃癌的完整胃粘膜肠化生组织(cim-nogc)、6个进展期胃癌的不完整胃粘膜肠化生组织(iim-gc)、7个早期胃癌的不完整胃粘膜肠化生组织(iim-nogc)和15个健康的对照组织。进行基因集富集分析(gsea)以探究受fam167a-as1影响的分子通路。使用公开可用的数据库(www.kmplot.com)来进行k-m生存分析(kaplan-meierplotteranalysis)。由lncatlas来呈现fam167a-as1于hesc细胞系中的亚细胞位置；通过jaspar和ucsc软件来分析转录因子与染色体之间的联系；通过catrapid和starbase在线软件来计算lncrna与蛋白质或mirna之间的关联；通过genemania和string在线软件来预测蛋白质与蛋白质之间的关系。
细胞培养
从中国典型培养物保藏中心(chinacentertypeculturecollection，cctcc，上海)购买三种类型的胃癌细胞系(mgc-803、bgc-823和sgc-7901)和胃粘膜上皮细胞系ges-1。在dmem中培养mgc-803细胞系。在37℃和5％co2下在补充有10％胎牛血清(fbs)、100u/ml青霉素和100mg/ml链霉素(invitrogen，ca，usa)的rpmi1640(gibco)培养基中培养bgc-823、sgc-7901和ges-1。
rna提取和定量实时pcr(qrt-pcr)分析
用trizol试剂(invitrogen，usa)或rnaeasytmplusanimalrnaisolationkitwithspincolumn(中国碧云天(beyotime，china))根据说明书提取总rna。对于qrt-pcr，使用primescriptprtreagentkit(perfectrealtime；takara)反转录1μg总rna。用sybrpremixextaq(tlirnasehplus；takara)一式三份地进行pcr。参照组成性表达基因β-肌动蛋白对每种特定基因的扩增转录本水平进行标准化。
primersusedforqrt-pcrsequence(5'-3')
β-actinforwardcatgtacgttgctatccaggc
β-actinreversectccttaatgtcacgcacgat
fam167a-as1forwardgccggtagtgctgaatggac
fam167a-as1reversetccggaatagcagctcatgg
lin28bforwardagcaaaggtggtggagaaga
lin28breversetctcggtttatcatggagatg
c-mycforwardggctcctggcaaaaggtca
c-mycreversectgcgtagttgtgctgatgt
mxi1forwardgcgcctttgtttagaacgctt
mxi1reverseaatgctgtccattcgtattcgt
pi3kforwardttgttcatagcagcatggtc
pi3kreverseatggaagacgggagattcac
akt1forwardatcgcttctttgccggtat
akt1reversetcttggtcaggtggtgtgat
mtorforwardgtgcgacaccgaatcaatc
mtorreversecctgtttccactggtccacta
hif1-αforwardcccaatggatgatgacttcc
hif1-αreversetgggtaggagatggagatgc
glut1forwardtcctgccctgttgtgtatagat
glut1reversetctgtctcactcccatccaa
hk2forwardccgccagaagacattagagc
hk2reverseacttcccattccgaacacg
pkm2forwardttgttcatagcagcatggtc
pkm2reverseatggaagacgggagattcac
ldhaforwardggcctgtgccatcagtatct
ldhareversetcttccaagccacgtaggtc
pdk1forwardtcacgctgggtaatgaggat
pdk1reverseacgtgatatgggcaatccat
cdk2forwardtgaggcaggtgagagatgttt
cdk2reversecactcaatcacagccctgaa
cyclinaforwardttgctgacttgggcataatc
cyclinareverseccttctggagcatttctcgt
mettl14forwardagaaacttgcagggcttcct
mettl14reversetcttcttcatatggcaaattttctt
sirnas/shrnaoligonucleotidessequence(5'-3')
lin28b-si1ggaaggatttagaagccta
lin28b-si2upcaacagugauugugagaauuu
lin28b-si2downauucucacaaucacuguuguu
mettl14-si1upggcuaaaggaugaguuaautt
mettl14-si1downauuaacucauccuuuagcctt
mettl14-si2upggacuugggaugauauuautt
mettl14-si2downauaauaucaucccaagucctt
qchipanalysisofthefam167a-as1promoterformycoccupancy
myc-fam167a-as1forward-1attccctgacctggcaacat
myc-fam167a-as1reverse-1tagtgggcctcagctggatt
myc-fam167a-as1forward-2ttatggtaagggaatgag
myc-fam167a-as1reverse-2taatctgtggaactggaa
myc-fam167a-as1forward-3cacaggctaccggtggttatt
上述引物均由吉赛生物科技有限公司(geneseedbiotechnologycompany)和invitrogen提供。
rna衰变测量
将细胞在6孔板中培养(4×105个/孔)。每组具有12个孔。通过添加2μg/ml放线菌素d(medchemexpress，usa)来抑制转录。每20分钟提取rna，直至1小时为止。使用rnaeasytmplusanimalrnaisolationkit来采集rna。通过以时间作为x轴和以rna的量作为y轴来绘制线性关系。
质粒构建和细胞转染
使用载体pcdna3.1( )来合成人类fam167a-as1、c-myc、mxi1、lin28b和阴性对照的全长互补dna(cdna)。使用lipfectamine3000(invitrogen，usa)将质粒转染至细胞中，并且用lipofectamine2000(invitrogen，usa)来转染sirna。
慢病毒构建和细胞感染
构建对照shrna、fam167a-as1shrna、fam167a-as1过表达慢病毒。将细胞用慢病毒感染3天并且用嘌呤霉素(1μg/μl)处理以用于筛选。当通过显微镜观察到稳定的绿色荧光时，表示构建了感染的细胞系。
细胞活力分析
将细胞接种于96孔板中(2×103个/孔)(5个孔/组)。随着添加20μlcck-8(中国碧云天)，在450nm处测量溶液的光吸收。每24小时重复此检查，持续4天。
将用于集落形成分析的细胞以500个细胞/孔的密度接种于6孔板中。在14天之后，将细胞用pbs洗涤，用4％多聚甲醛固定，用0.1％结晶紫染色30分钟并且洗涤两次。将集落在光学显微镜下以20×放大率进行拍照和计数。
通过edu分析试剂盒(ribobio，china)，根据制造商的说明书进行5-乙炔基-2'-去氧尿苷掺入分析。对于每个样品随机选择五个视野。将edu阳性细胞用红色染料染色，并且从五个视野的平均细胞数来计算相对增殖阳性比。
细胞迁移和侵袭分析
对于伤口愈合分析，将4×105个细胞接种于6孔板中。在24小时后，用10μl移液管的尖端划出划痕。在0、12和24小时采集沿刮擦线随机选择的视图的亮场图像。在无fbs的情况下培育细胞。计算填充的受伤面积的百分比：(平均剩余宽度/平均受伤宽度)×100(％)。
对于跨孔分析，将5×104个细胞转移至插入物(8μm孔径，millipore)的上腔室中。将具有10％fbs的培养基添加到下腔室中。在24小时之后，将侵袭细胞用95％乙醇固定，用0.1％结晶紫染色15分钟并且在倒置相差显微镜下以×100的放大率进行拍照。数目是在五个随机选择的显微镜中获得的。用预涂有matrigel(bdbiosciences，usa)的腔室以1×105个细胞来进行细胞侵袭分析。
细胞凋亡和细胞周期分析
使用流式细胞测量术通过bdfacsariaiisorp(specialorderresearchproduct)来检测细胞凋亡和细胞周期分布。收获细胞并且用膜联蛋白v-fitc/pi凋亡检测试剂盒(ebioscience，usa)进行染色，并且通过荧光活化细胞分选(facs)进行分析。膜联蛋白v( )/p(-)意味着早期凋亡，并且膜联蛋白( )/p( )表示晚期凋亡和坏死。
蛋白质提取和蛋白质印迹
使用补充有pmsf(biosharp，china)的ripa蛋白质提取试剂(中国碧云天)来提取蛋白质。使用bca蛋白质分析试剂盒(中国碧云天)来测定蛋白质浓度。将15μg的各类蛋白质通过12％sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分离，转移至0.22μm聚偏二氟乙烯(pvdf)膜并且依次与脱脂奶粉、靶标或β-肌动蛋白抗体和二级抗体一起培育。最后，通过增强型化学发光(ecl，usa)试剂来检测结果。从以下制造商购买抗体：cellsignalingtechnology(cst)(β-肌动蛋白、pi3k、akt、mtor、hif-1α、pkm2)和abcam(glut1、lin28b、c-myc)。
葡萄糖摄入和乳酸生产分析
将细胞接种到培养基中保持24小时，然后与新培养基一起再培育24小时。利用基于荧光的葡萄糖分析试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国(nanjingjianchengbioengineeringinstitute，china))和乳酸测试试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司，中国(keygenbiotech,china))，根据制造商说明书来评估细胞内葡萄糖和乳酸的水平。将葡萄糖摄入和乳酸生产的总和除以细胞数目。
seahorse细胞外通量分析
使用seahorsebiosciencesxfe96通量分析仪(northbillerica，ma)，在xf培养基中在基础条件下，基于对葡萄糖(10mm)、寡霉素(1μm)和2-dg(100mm)的反应来测量细胞外酸化率(ecar)。另外基于对oligo(1μm)、fccp(1μm)和抗霉素(1μm)的反应来测量耗氧率(ocr)。
fish和亚细胞分级分离
用fluorescentinsituhybridizationkit和fishprobemix(ribo，china)根据制造商说明书对固定的细胞进行处理。用共聚焦激光扫描显微镜来拍摄照片。经由pariskit(lifetechnologies，usa)根据制造商说明书来进行细胞核和胞质部分的分离。
染色质免疫沉淀分析
使用ezmagnachipkit(millipore，usa)根据制造商说明书进行染色质免疫沉淀(chip)实验。从abcam购买抗c-myc抗体(ab32072)，并且从cst获得抗h3k4me2抗体(#9725)。。
rna免疫沉淀
用ezmagnariprna-bindingproteinimmunoprecipitationkit(millipore，usa)进行rna免疫沉淀(rip)实验。从abcam购买抗lin28b抗体(ab191881，1:100)。从cst购买抗flag抗体(#14793，1:100)。通过琼脂糖凝胶电泳和qrt-pcr来检测共沉淀的rna，同时分析总rna和兔igg对照rna。
荧光素酶报告基因分析
使用载体gv208来构建表达萤火虫荧光素酶的质粒和定制启动子。将mrna的区域插入到psicheck2的3'utr中。在转染之后，通过dual-luciferase报告基因分析试剂盒(promega，usa)来收集细胞。通过使用bdmonolight3010光度计(bdbiosciences)来测量荧光素酶活性。通过将萤火虫荧光素酶(fluc)活性除以对应海肾荧光素酶(rluc)活性将结果标准化。
体内肿瘤生长分析
在南京医科大学动物中心饲养四周龄的雌性无胸腺balb/c裸小鼠。将细胞团块(5×106个)溶解于200μlpbs中并且皮下注射至每只小鼠的左侧，每3天通过测量纵径和横径来计算肿瘤体积。(该方案获得南京医科大学动物实验伦理学委员会批准。)
免疫组化染色
使用免疫组化(ihc)分析通过特殊抗体(ki67、servicebio、gb13030-2；lin28b、ab71415)来检查ki67和lin28b的表达；一抗的稀释度为1:100。
统计
在体外一式三份地进行所有实验并且重复三次。按需要通过配对student'st检验、χ2检验、wilcoxon检验或单因素方差分析(anova)来测定细胞增殖、迁移和侵袭分析中的统计显著性。通过spss17.0统计软件包来计算统计分析结果。将不超过0.05的p值看成是统计显著的。结果是来自3个独立试验的1个代表性实验。以平均值±sd(sd)的形式来呈现数据。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
实验数据及实验结果如图所示：
图1.fam167a-as1在胃癌中上调且与不良预后相关a.在gse78523中的cim-gc和cim-nogc中的fam167a-as1的表达水平(非配对t检验，p＝0.0649)。b.gse78523中的fam167a-as1高表达子组和低表达子组的gsea比较(nse＝-1.68，p<0.05)。c.由qrt-pcr展示的ges-1、bgc-823、ags、sgc-7901和mgc-803中的fam167a-as1水平。d.fam167a-as1水平与os、pfs和pps之间的相关性。下边和上边分别来指示具有fam167a-as1的高表达(os：263名患者；pfs：200；pps：154)或低表达(os：368名患者；pfs：322；pps：230)的组(os：p＝0.00017，hr＝1.51；pfs：p＝0.0076，hr＝1.38；pps：p<0.0001，hr＝1.75)。***p<0.001。将变量展示为平均值±sd。
图2.fam167a-as1在体外为致癌性lncrnaa.fam167a-as1敲降/过表达的细胞和对照细胞从第1天至第5天的生长曲线。b.fam167a-as1敲降/过表达的细胞和对照组的集落形成能力。c.edu分析通过红色染色来展示增殖细胞(图像，100×)。直方图呈现了所有组的条件。d.在12小时和24小时时检测划痕的宽度。呈现了所有组的结果。e.对跨越具有(下图)或不具有(上图)基质的膜的细胞数目进行计数。呈现了代表性照片(图像，100×)。f.通过膜联蛋白v-fitc/pi染色方法来评估被fam167a-as1或空质粒转染的bgc-823细胞的凋亡率。g.facs分析呈现了各阶段的比例以展示fam167a-as1对细胞周期的影响。h.通过qrt-pcr来检测fam167a-as1敲降/过表达的细胞和对照组中的细胞周期蛋白a和cdk2的水平。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。将变量展示为平均值±sd。
图3.fam167a-as1通过上调pi3k/akt通路来加速糖酵解。a.seahorse细胞外通量分析指示了在培养12小时之后的fam167a-as1敲降/过表达的细胞和对照组中的ecar/ocr。b.在培养24小时之后，通过吸光度来测量fam167a-as1敲降/过表达的细胞或对照组的葡萄糖和乳酸的水平。c-d.通过qrt-pcr来检测并且通过蛋白质印迹来论证在治疗组和对照组中不同地表达的mrna和蛋白质。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。将变量展示为平均值±sd。
图4.在细胞核中富集的fam167a-as1能够与lin28b结合。a.通过fish分析检测到的fam167a-as1在mgc-803中的定位的代表性图像。左图展示了用heochst染色的细胞核。中图展示了用cy3染色的fam167a-as1、u6或18s的位点。右图将两个照片合并(上图)。使用gapdh和u6作为内部参考，通过qrt-pcr来检测fam167a-as1在细胞核和细胞质中的表达(下图)。b.rip分析展示了相比于igg，lin28b结合更多的fam167a-as1。fam167a-as1的过表达增加了δδct值。通过琼脂糖凝胶电泳(上图)和qrt-pcr(下图)来测试结果。c.通过qrt-pcr来检测并且通过蛋白质印迹来论证fam167a-as1敲降/过表达的细胞和对照组中的lin28b的水平。d.被对照或lin28bsirna转染的fam167a-as1过表达的细胞的集落形成能力(左图)。这些细胞从第1天到第5天的生长曲线(右图)。e.呈现了lin28b-si组和si-nc组中的划痕宽度。f.在24小时培养之后，通过吸光度来测量lin28b-si组和si-nc组的葡萄糖和乳酸的水平。g.在24小时培养之后，治疗组和对照组的fam167a-as1敲降的细胞(左图)或fam167a-as1过表达的细胞(右图)中的ecar/ocr。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。将变量展示为平均值±sd。
图5.c-myc在转录水平下调节fam167a-as1。a.此图概括了jaspar和ucsc的预测结果。根据jaspar的结果，结合基序是“cacgtg”并且预测的结合位点是90-101、400-411和1902-1913。将来自ucsc的chip-seq的c-myc结合位点呈现为fam167a-as1的启动子中的黑色方块。方块的黑度表示结合的强度。也在h3k4me3和h3k27ac的迹线中证明了结合。b.在c-myc或mxi1的过表达之后，fam167a-as1的表达。c.通过将fam167a-as1的启动子分为3个部分来比较每个位点的结合能力，所述3个部分分别被igg、c-myc和h3k4me2的抗体吸收。d.荧光素酶报告基因显示了c-myc或mxi1对fam167a-as1启动子的影响(左图)和c-myc与突变启动子之间的结合(右图)。突变位点分别是90-101(mut1)、400-411(mut2)和1902-1913(mut3)。mut-all是具有所有三种突变的启动子。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。将变量展示为平均值±sd。
图6.fam167a-as1促进c-myc与lin28b之间的相互作用a.在正常细胞、fam167a-as1敲降/过表达的细胞和对照细胞中通过chip来测量igg、c-myc或h3k4me2和lin28b-int1中的结合强度。b.分别用c-myc和lin28b-int1-wt/-mt共转染存在或不存在fam167a-as1过表达的293t细胞系。比较不同组的rlu。c.rip分析展示：相比于igg，c-myc结合更多的fam167a-as1。fam167a-as1的过表达增加了δδct值。通过琼脂糖凝胶电泳(上图)和qrt-pcr(下图)来测试结果。d.进行rip分析以检测正常细胞或fam167a-as1过表达的bgc-823细胞中的lin28b与c-mycmrna之间的相互作用(左图)。用c-myccds、3'utr或crd将经过flag标记的lin28b或对照质粒共转染至bgc-823中。使用flag抗体来研究外源性lin28b与c-mycmrna的不同部分之间的结合(右图)。e.通过荧光素酶报告基因分析来测量由lin28b诱导的rlu的累加百分比。阳性对照(pc)是arid3a3'utr。其突变型充当阴性对照(nc)。比较了lin28b对c-myccds-wt/mt、3'utr-wt/mt和crd-wt/mt的影响(左图)。将fam167a-as1或空质粒转染至存在lin28b过表达的293t细胞系中以研究其对lin28b的结合能力的影响(右图)。f.在si-nc或mettl14-sirna1/2转染之后根据rlu来测量lin28b与c-myc的不同部分之间的结合强度。g.比较了被si-nc或lin28b-sirna1/2转染的bgc-823中的c-mycmrna半衰期(左图)；被对照或fam167a-as1质粒转染的bgc-823中的c-mycmrna半衰期(中间)；和被对照或fam167a-as1质粒转染的lin28b敲降的bgc-823中的c-mycmrna半衰期(右图)。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。将变量展示为平均值±sd。
图7.fam167a-as1通过在体内上调lin28b而促进胃癌进展。a.来自在左侧腹注射fam167a-as1过表达的细胞(上图)或对照细胞(下图)的小鼠(n＝8，每组)的皮下肿瘤的代表性图像。测量了肿瘤的平均重量(左侧)；每3天绘制肿瘤生长曲线一次，直至第25天为止(右图)。b.属于fam167a-as1过表达的细胞组(上图)或对照组(下图)(n＝3，每组)的肺的代表性图像(左图)。不同肺的苏木精-曙红染色照片(图像，20×)(右图)。c.通过蛋白质印迹检测的fam167a-as1过表达的细胞和对照组(n＝4，每组)中的蛋白质水平。d.由ihc示出的fam167a-as1过表达的细胞或对照组中的lin28b蛋白和ki-67指数(图像，20×，40×)(左图)；由qrt-pcr示出的fam167a-as1过表达的细胞或对照组中的lin28bmrna(右图)。*p<0.05；**p<0.01。将变量展示为平均值±sd。e.由c-myc驱动的fam167a-as1使得c-myc接近lin28b启动子，并且支持c-myc与lin28b之间的结合。lin28b拮抗let-7并且促进pi3k/akt通路。c-myc/fam167a-as1/lin28b轴诱导瓦博格效应以加速肿瘤进展。
结果
fam167a-as1在胃癌中上调且与不良预后相关
使用公共数据库来比较进展期胃癌(cim-gc)与早期胃癌(cim-nogc)(图1a)的完整胃粘膜肠化生之间的fam167a-as1水平。cim-gc中的fam167a-as1比cim-nogc中表达更多。基因集富集分析(gsea)展示氧化磷酸化通路在fam167a-as1低表达组中富集(图1b)。相比于正常胃细胞系ges-1，fam167a-as1在胃癌细胞系(ags、sgc-7901和mgc-803)中表达更高(图1c)。但是，bgc-823中的fam167a-as1的表达水平与ges-1中类似。利用在线软件(www.kmplot.com)来进行生存分析发现：在631位胃癌患者中，263位具有更高fam167a-as1的胃癌患者具有更短的总生存期(os)、无进展生存期(pfs)和进展后生存期(pps)(图1d)。所有这些结果表明fam167a-as1参与胃癌的发生和发展。
fam167a-as1在体外为致癌性lncrna
设计慢病毒包装的下调fam167a-as1表达的shrna干扰序列，和上调fam167a-as1表达的载体质粒(lv5-fam167a-as1)。被lv5-fam167a-as1感染的bgc-823细胞中fam167a-as1表达上调。实时荧光定量pcr法检测这些通过转染fam167a-as1的shrna干扰序列和lv5-fam167a-as1表达载体的细胞中的fam167a-as1的水平。fam167a-as1过表达的胃癌细胞中，细胞活力、增殖和集落形成能力增加。相反，在fam167a-as1表达下调的胃癌细胞增殖能力降低(图2a-c)。fam167a-as1过表达的细胞转移和侵袭能力也增强，反之，fam167a-as1下调的胃癌细胞转移和侵袭能力降低(图2d-e)。过表达fam167a-as1的bgc-823细胞的凋亡率低于对照组的凋亡率(图2f)。fam167a-as1高表达的细胞在s期时向长，而g1期保留时间较短(图2g)。细胞周期蛋白依赖性激酶2(cdk2)和细胞周期蛋白a是完成s期和开始dna复制必需的成分。其表达水平与fam167a-as1的表达成正相关(图2h)。fam167a-as1可加速g1/s期转变以延长s期；所有这些变化表明fam167a-as1在胃癌中起致癌基因作用。
fam167a-as1通过上调pi3k/akt通路来加速糖酵解
与氧化磷酸化相关的基因在fam167a-as1低表达的胃癌样本中被活化(图1b)。首先，检测fam167a-as1-敲低/过表达和对照组中的ecar/ocr(图3a)。fam167a-as1的过表达增加ecar且抑制ocr。接着，测量葡萄糖消耗和乳酸生产(图3b)。具有更高fam167a-as1表达的细胞吸收更多葡萄糖且生产更多乳酸。通过qrt-pcr和蛋白质印迹测量了糖酵解相关酶和转运体的水平(图3c-d)。相比于对照组，若干成分显著改变，包括pkm2和glut1。pi3k、akt、mtor和hif-1a的表达也通过fam167a-as1来调控。pi3k/akt通路可上调glut1且促进瓦博格效应。因此，fam167a-as1通过pi3k/akt通路来促进瓦博格效应。
细胞核中富集的fam167a-as1能够与lin28b结合
为了解释fam167a-as1与pi3k/akt通路之间的关系，首先使用网站工具来预测fam167a-as1的亚细胞位置。至少在hesc细胞系中，fam167a-as1主要位于细胞核中。rnafish实验提示：mgc-803细胞中的fam167a-as1在细胞核分布(图4a)。因此，fam167a-as1与rna结合蛋白(rbp)结合以调节pi3k/akt通路。在线rna/蛋白质相互作用预测软件catrapid预测fam167a-as1可与lin28b结合。作为致癌因子的lin28b不仅可促进pi3k/akt通路，并且还抑制let-7的成熟以增强葡萄糖代谢。fam167a-as1可通过lin28b促进胃癌进展。rip实验分析表明：fam167a-as1可以结合lin28b蛋白。lin28b蛋白在fam167a-as1过表达的细胞中富集度更高(图4b)。fam167a-as1的上调增加了lin28b蛋白的表达(图4c)。在lin28b敲降之后，fam167a-as1过表达的细胞展示较弱增殖和转移潜能且生产较少乳酸。相比之下，过表达lin28b的细胞中，fam167a-as1敲降的细胞展示更多ecar(图4d-g)。这些结果表明lin28b是fam167a-as1的下游靶基因。
c-myc在转录水平调节fam167a-as1
c-myc通常在癌症中活化。基于gse64889，当sirna在结肠癌中遏制c-myc时，fam167a-as1减少。通过分析了fam167a-as1基因上游的2000bp区域发现3个假定的结合位点。染色质免疫沉淀-测序(chip-seq)数据也表明c-myc可结合至fam167a-as1启动子区(图5a)。构建c-myc和mxi1(其为c-myc的拮抗剂)的过表达质粒以转染胃癌细胞。fam167a-as1在c-myc组中上调，而在mxi1组中下调(图5b)。chip实验确认c-myc的结合位点(图5c)。由于c-myc优先连接至富含常染色质标记的启动子，包括组蛋白h3赖氨酸4的二/三甲基化(h3k4me2/3)。使用h3k4me2抗体来进行chip实验且获得类似结果(图5c)。根据荧光素酶报告基因实验，共转染fam167a-as1启动子序列和c-myc可使相对荧光素酶(rlu)上升，而共转染fam167a-as1启动子序列和mxi1，使其下降。fam167a-as1启动子中的第一e-box的突变体可使荧光素酶下降最显著，意味着启动子区的90-101位点对c-myc具有最高亲和力(图5d)。因此：c-myc在转录水平调节fam167a-as1的表达。
fam167a-as1促进c-myc与lin28b之间的相互作用
通过进行chip实验来证实c-myc可通过结合至lin28b的第一内含子来诱导lin28b转录(图6a)。设计了具有lin28b第一内含子的野生型或突变型(lin28b-int1-wt/mt)的质粒。mt组(突变体组)表现显著较低的rlu值(图6b)。鉴于fam167a-as1过表达升高lin28b的水平，fam167a-as1可促进c-myc与lin28b启动子的结合。rip实验提示：fam167a-as1可结合c-myc蛋白(图6c)。更多的c-myc富集于fam167a-as1过表达细胞中的lin28b-int1中(图6a)且反之亦然。在共转染c-myc、lin28b-int1-wt、fam167a-as1或对照质粒之后，具有较高fam167a-as1表达的hek293t细胞系呈现较高rlu值(图6b)。
lin28b也上调c-myc，由let-7前体的降解引起。作为rna结合蛋白(rbp)的lin28b可与c-myc转录本直接结合以保护其翻译。通过rip证实了此猜测(图6d)。根据公布的par-clip结果，设计了可能与c-myc编码序列(cds)和3'非翻译区(utr)中的lin28b结合的序列。接着将flag标记的过表达lin28b质粒和含有c-mycmrna不同区域片段的质粒共转染至bgc-823细胞系中。通过使用flag抗体行rna免疫共沉淀实验，确认了外源性lin28b可结合c-myc不同区域片段(图6d)。另外，将可能的结合区和其突变型添加至psicheck2载体上的rluc质粒的3'utr中，在hek293t细胞中进行荧光素酶报告基因分析。在lin28b过表达之后，cds-wt的rlu值显著增加(图6e)。此外，通过与公布的merip结果比较发现n6-甲基腺苷(m6a)在lin28b结合位点中富集(补充文件1)。因此使用具有富集m6a的c-myc编码区决定子(crd)来证实c-mycrna的m6a促进其与lin28b蛋白结合。在m6a写入蛋白(m6awriter)mettl14敲降之后，lin28b与crd之间的结合强度显著降低(图6f)。而lin28b与cds或3'utr之间的结合不受影响。此结果提示：m6a尤其在将rbp引导至crd中起重要作用。另外，rna稳定性实验提示：c-mycmrna在lin28b敲低细胞中更快速地降解，表明lin28b可在转录后水平调节c-myc(图6g)。在fam167a-as1过表达细胞中，lin28b结合的c-mycmrna的表达量升高(图6d)。荧光素酶报告基因实验提示：在lin28b过表达的细胞系中，上调fam167a-as1可进一步升高rlu值(图6e)。fam167a-as1过表达减轻由lin28b敲低引起的c-mycmrna不稳定性(图6g)。因此，c-myc可与lin28b基因的启动子结合，而lin28b蛋白可再与c-myc的转录本结合。fam167a-as1可充当放大c-myc/lin28b轴引起肿瘤进展效应的桥梁。
fam167a-as1通过在体内上调lin28b而促进胃癌进展
设计无胸腺(nu/nu)小鼠成瘤模型验证fam167a-as1基因功能。通过将fam167a-as1过表达或对照细胞注射至裸鼠的左侧腹部或尾静脉中，结果提示：fam167a-as1过表达细胞的肿瘤生长比来自对照的肿瘤生长显著增快(图7a)。类似地，fam167a-as1过表达组中裸鼠的肺转移位点更多(图7b)。蛋白质印迹展示pi3k/akt通路相关蛋白(pi3k、akt、mtor和hif-1a)和糖酵解酶(glut1和pkm2)在fam167a-as1过表达组中上调(图7c)。来自fam167a-as1过表达组的肿瘤也呈现更大lin28b和ki67指数(图7d)。这些活体内实验证实fam167a-as1可经由lin28b和pi3k/akt通路来诱导肿瘤形成和促进瓦博格效应。
本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
序列表
<110>徐同鹏
<120>一种lncrnafam167a-as1分子标志物及其在胃癌中的应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1222
<212>dna
<213>homosapiens
<400>1
gaacagactggattagtgaaagctactgcagtgctttggacacttactatgatttagact60
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gttctctatggatacccattagacccagtagatatagaaccatattcatggcaccagtga180
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caaacacgctgctgaagggcaactggaggttccggggaaatgtgaagaaagaaacgcaaa540
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ggaagacattctgtgccggagagagagtgggagagatgtgactgctgctggctgggtgag660
gacaggcccagaggacagcatcactggcacccacccctgcatttgggtcctctgcacctc720
agctcccagcatctgggcctcctccctgcctgcctccccccctcactcaatctgtctcca780
ctcaagaggctgatgggcaggtctccctgcttcttcaaatctttcaaagggaaacttcac840
aaagacaggagccctgacccatccaccttggcctcaccccaccccagcacggaagccagg900
cggccagtggaggccggtagtgctgaatggacatggggctggatgaaaagacttccgcct960
gcctctctcagccccggaatcgccatgagctgctattccggagattctatgctacagaag1020
tacaaggtgaagaatgcataccgattacattggcaagggagagaagagcctggtgctagc1080
acttttgcttctttggtctttcaataatgtctttccccttgattatacatgatatattcc1140
tattttggaaacttcgaaaactataaaaaagtcaaaagaataatattaccactcagaaat1200
aaagatcatcaagttttggtgt1222
1.一种检测组织中lncrnafam167a-as1分子标志物表达水平的试剂在制备胃癌诊断试剂中的应用，所述lncrnafam167a-as1分子标志物的核苷酸序列为为seqidno.1。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测组织中lncrnafam167a-as1分子标志物表达水平的试剂为实时定量pcr试剂。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：根据核苷酸序列为seqidno.1的lncrnafam167a-as1分子标志物设计了引物用于检测该序列，引物核苷酸序列为：上游引物：5’-gccggtagtgctgaatggac-3’，下游引物：5’-tccggaatagcagctcatgg-3’。
4.一种用于胃癌诊断的实时定量pcr检测试剂盒，包括根据核苷酸序列为seqidno.1的lncrnafam167a-as1分子标志物设计并合成出特异性用于实时定量pcr的检测引物；检测方法具体为：总rna提取、rna反转录、进行qrt-pcr反应。
5.一种评估胃癌预后的分子标志物，所述分子标志物为核苷酸序列为seqidno.1的lncrnafam167a-as1分子标志物。
技术总结