本发明涉及一种用于检测微卫星不稳定性的引物、探针、试剂盒及检测方法，属于微卫星不稳定性检测技术领域。
背景技术：
微卫星是分布于人类基因组中的简单重复序列，是一种比小卫星dna具有更短重复单元的卫星dna(每单元长度在1～6bp之间)，又被称作短串连重复(shorttandemrepeats，strs)或简单重复序列(simplesequencerepeat，ssrs)，可分为3种类型：单一型(pure)、复合型(compound)和间断型(interrupted)。微卫星不稳定(microsatelliteinstability，msi)指与正常组织相比，微卫星重复次数减少或者增加，出现了新的等位基因。主要机制是dna聚合酶的滑动导致重复序列中1个或多个碱基的错配，或者是由同源重组导致碱基对的丢失和插入。
错配修复(mmr)系统成员包括mlh1，msh2，msh6和pms2等蛋白。dna复制过程中偶尔会出现小dna错配错误，可以被这些蛋白识别后剪切，并合成新链进行修复。整个基因组有超过100000个微卫星的短串联重复序列区域，复制过程中易于滑动出现错误，因此非常依赖于mmr系统修复。微卫星不稳定的内在机制是错配修复(mmr)系统缺陷，从而丧失了纠正微卫星自发的长度改变的体细胞突变的能力，体细胞突变积累，最终形成msi。虽然大部分微卫星位于非编码区，但是突变会导致移码突变，引起肿瘤相关基因出现异常，进而诱导癌症发生。
高度msi(msi-h)在大约15％的crc中起决定作用，此外，msi-h也可导致子宫内膜癌，卵巢癌，胃癌等其他肿瘤。临床上已将msi作为结直肠癌及其他实体瘤预后和制定辅助治疗方案的重要分子标志物，并应用于协助lynch综合征筛查。2019年结直肠癌及其他相关实体瘤微卫星不稳定性检测中国专家共识提出：所有结直肠癌患者均应进行msi状态筛查；晚期实体瘤患者(如胃癌、小肠癌、子宫内膜癌、尿路上皮癌、胰腺癌和胆管癌等)如考虑免疫治疗应行msi状态检测。
目前，多重荧光pcr-毛细管电泳法检测msi是国际公认的金标准。此检测方法同时提取同一患者的正常组织和肿瘤组织样本dna，采用多重荧光pcr的方法对检测位点进行扩增，再通过毛细管电泳对扩增产物进行检测，并利用专业软件对两种组织来源检测结果进行对比分析，能准确的给患者msi状态进行分型。其中包含5个微卫星检测位点nr21、nr24、bat25、bat26和nr27，当这5个位点均未出现pcr扩增片段大小改变，则为微卫星稳定型(mss)；当5个msi检测位点中1个msi位点出现了pcr扩增片段大小的改变，则为微卫星低不稳定型(msi-l)；当5个msi检测位点中2个或者2个以上的msi位点均出现了pcr扩增片段大小的改变，则为微卫星高不稳定型(msi-h)。
另一种检测msi的方法是二代测序(ngs)法，有文献报道，基于ngs的msi检测结果与传统pcr方法比较的吻合度高达99％，二代测序法无需提供正常组织作为对照，同时提高了检测灵敏度。此外，二代测序法还可检测外周血循环肿瘤dna(ctdna)中的msi，为肿瘤组织取样困难或不足的晚期实体瘤患者msi检测提供了新选择。
技术实现要素：
发明目的：为了解决现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于检测微卫星不稳定性的引物、探针、试剂盒及检测方法。本发明检测方法无需正常组织作为对照，可检测组织和ctdna中的msi，具有准确性高、灵敏度高等优点，可作为现有方法的验证方法，也可作为替代和补充。
技术方案：为达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明包括五对分别扩增msi5个位点的上游引物和下游引物，及五对分别结合5个位点的内参探针和野生型探针：
(1)nr21上游引物：5’-tcctactccgcattcacactttc-3’(seqidno:1)；
nr21下游引物：5’-ggagtcgctggcacagttc-3’(seqidno:2)；
nr21内参探针5’-vic-ttctggtcactcgcgtttacaaacaaga-bhq1-3’(seqidno:11)；
nr21野生型探针5’-fam-cctttttttttttttttttttttagc-mgb-3’(seqidno:12)；
(2)nr24上游引物：5’-tacctcctgactccaaaaactcttc-3’(seqidno:3)；
nr24下游引物：5’-cttgcagtgagcggagattg-3’(seqidno:4)；
nr24内参探针5’-vic-tctcactctgtcacccaggttggaatg-bhq1-3’(seqidno:13)；
nr24野生型探针5’-fam-ctatttttttttttttttttttttttgtg-mgb-3’(seqidno:14)；
(3)bat25上游引物：5’-cctccaagaatgtaagtgggagtg-3’(seqidno:5)；
bat25下游引物：5’-gaaactaaatttcctctgcttttggttac-3’(seqidno:6)；
bat25内参探针：5’-vic-tcaaaatgacattctgcattttaactatggctcta-bhq1-3’(seqidno:15)；
bat25野生型探针：5’-fam-tgatttttttttttttttttttttttttgag-mgb-3’(seqidno:16)；
(4)bat26上游引物：5’-tgactacttttgacttcagccagtatatg-3’(seqidno:7)；
bat26下游引物：5’-gctcctttataagcttcttcagtatatgtc-3’(seqidno:8)；
bat26内参探针：5’-vic-attgcagcagtcagagcccttaacctt-bhq1-3’(seqidno:17)；
bat26野生型探针：5’-fam-cctttttttttttttttttttttttttttacc-mgb-3’(seqidno:18)；
(5)nr27上游引物：5’-caaagcattgaagtctgcagttg-3’(seqidno:9)；
nr27下游引物：5’-ctagcaatgaccaataagcaagtcac-3’(seqidno:10)；
nr27内参探针：5’-vic-tctgtgagatccaggaaaccatgcttg-bhq1-3’(seqidno:19)；
nr27野生型探针：5’-fam-tggcttttttttttttttttttttttttttac-mgb-3’(seqidno:20)；
探针5’端分别用fam和vic荧光基团修饰，3’端分别用bhq1和mgb淬灭基团修饰。
一种用于检测微卫星不稳定性的试剂盒，包括所述的引物和所述的探针。
试剂盒在实现方式中，包括引物探针混合液。分别将所述每个位点的上游引物、下游引物、内参探针和野生型探针先溶于te溶液中，然后再混合在一起，制备成引物探针混合液，优选，其中引物的浓度为10um，探针的浓度为5um。
所述的引物、所述的探针、或所述的试剂盒在检测微卫星不稳定性中的应用。
一种基于数字pcr技术检测微卫星不稳定性的方法，包括以下步骤：
(1)将pcr预混液与待测的dna模板、所述的引物、所述的探针混合，制备得到数字pcr混合液；
(2)将数字pcr混合液制备成微滴，然后进行pcr扩增反应；
(3)对pcr扩增反应后的产物进行信号分析，在分析软件中根据不同的荧光信号来判断待测样本的突变情况，并计算突变模板的含量。
优选，步骤(2)中，所述pcr扩增反应的条件为：95℃，10min；94℃，30s；60℃，60s；98℃，10min；4℃，终止；其中，94℃和60℃进行40个循环，升降温速度为2℃/s。
数字pcr是一种核酸分子绝对定量方法，利用微流控或微滴化方法，将核酸分子分散至芯片的微反应器中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。经过pcr扩增后，有一个核酸分子模板的反应器就会产生荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。这样根据反应器的数量和含有荧光信号的反应器比例，就可以推算出原始溶液的核酸含量。数字pcr作为第三代pcr技术，具有定量快速准确等优势，广泛用于拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究(如等位基因不平衡表达)、二代测序结果验证、mirna表达分析、单细胞基因表达分析等。
本发明试剂盒用于检测5个微卫星位点nr21、nr24、bat25、bat26和nr27，也是目前普遍使用的msi检测位点。当这5个位点均未出现pcr扩增片段大小改变，则为微卫星稳定型(mss)；当5个msi检测位点中1个msi位点出现了pcr扩增片段大小的改变，则为微卫星低不稳定型(msi-l)；当5个msi检测位点中2个或者2个以上的msi位点均出现了pcr扩增片段大小的改变，则为微卫星高不稳定型(msi-h)。
taqman荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，如fam、tet、vic、hex等，3’端携带淬灭基团，如bhq、mgb等。pcr扩增时在加入一对引物的同时加入特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；pcr扩增时，taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。利用特异性探针的荧光信号就可以区分出不同的模板类型。
有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：
1)本发明方法操作简便，无需正常组织作为对照，节约了样本，降低了取样检测的难度。
2)本发明方法对组织和ctdna中的msi都可以检测，具有准确性高、灵敏度高等优点，结果不但可以定性还可以定量。
附图说明
图1为使用本发明的方法检测msinr21位点的野生型结果图。
图2为使用本发明的方法检测msinr21位点的突变型结果图。
图3为使用本发明的方法检测msinr24位点的野生型结果图。
图4为使用本发明的方法检测msinr24位点的突变型结果图。
图5为使用本发明的方法检测msibat25位点的野生型结果图。
图6为使用本发明的方法检测msibat25位点的突变型结果图。
图7为使用本发明的方法检测msibat26位点的野生型结果图。
图8为使用本发明的方法检测msibat26位点的突变型结果图。
图9为使用本发明的方法检测msinr27位点的野生型结果图。
图10为使用本发明的方法检测msinr27位点的突变型结果图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1引物和探针设计
1.材料
所用数字pcr仪为bio-radqx-200仪，所用ddpcrsupermixforprobes(nodutp)及相关耗材均购自bio-rad公司。
2.基因组dna提取
采集患者全血2ml。取全血200ul，用天根公司的血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒(dp304)提取血液的基因组dna，并用thermofisher公司的qubit3.0对dna进行定量。
用切片机从石蜡组织块上切下5-10片，然后用诺唯赞公司的fastpureffpednaisolationkit提取试剂盒(dc105)提取基因组dna，并用thermofisher公司的qubit3.0对dna进行定量。
3.引物及探针序列设计
nr21上游引物：5’-tcctactccgcattcacactttc-3’
nr21下游引物：5’-ggagtcgctggcacagttc-3’
nr21内参探针5’-vic-ttctggtcactcgcgtttacaaacaaga-bhq1-3’
nr21野生型探针5’-fam-cctttttttttttttttttttttagc-mgb-3’
nr24上游引物：5’-tacctcctgactccaaaaactcttc-3’
nr24下游引物：5’-cttgcagtgagcggagattg-3’
nr24内参探针5’-vic-tctcactctgtcacccaggttggaatg-bhq1-3’
nr24野生型探针5’-fam-ctatttttttttttttttttttttttgtg-mgb-3’
bat25上游引物：5’-cctccaagaatgtaagtgggagtg-3’
bat25下游引物：5’-gaaactaaatttcctctgcttttggttac-3’
bat25内参探针5’-vic-tcaaaatgacattctgcattttaactatggctcta-bhq1-3’
bat25野生型探针5’-fam-tgatttttttttttttttttttttttttgag-mgb-3’
bat26上游引物：5’-tgactacttttgacttcagccagtatatg-3’
bat26下游引物：5’-gctcctttataagcttcttcagtatatgtc-3’
bat26内参探针5’-vic-attgcagcagtcagagcccttaacctt-bhq1-3’
bat26野生型探针5’-fam-ctttttttttttttttttttttttttttacc-mgb-3’
nr27上游引物：5’-caaagcattgaagtctgcagttg-3’
nr27下游引物：5’-ctagcaatgaccaataagcaagtcac-3’
nr27内参探针5’-vic-tctgtgagatccaggaaaccatgcttg-bhq1-3’
nr27野生型探针5’-fam-ggcttttttttttttttttttttttttttac-mgb-3’
分别将所述每个位点的上游引物、下游引物、内参探针和野生型探针先溶于te溶液中，然后再混合在一起，制备成引物探针混合液，其中引物的浓度为10um，探针的浓度为5um。
实施例2利用本方法检测msi的5个位点的稳定性
操作具体流程为：
1.分别按表1-5配置pcr反应体系，所用模板分别用血液基因组dna和组织基因组dna：
表1
表2
表3
表4
表5
2.将配制好的20ul样品反应体系加入到dg8cartridge中间一排的8个孔内，在dg8cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油(dgoil)，盖上胶垫(gasket)，注意两边的小孔都要钩牢；将微滴发生卡底座放置到微滴生成仪中，进行微滴生成。生成的微滴在上面一行的反应孔内，从发生卡上层孔内吸取微滴转移至96孔板的内，然后使用px1热封仪将96孔板封膜。
3.将封好膜的96孔板放入pcr仪中，运行如下反应程序：
注：升降温速度为2℃/s
4.结果分析：pcr反应程序结束后，将96孔板放入qx200微滴读取仪中进行微滴读取，在软件quantasoft上查看和分析结果。坐标轴channel1为fam信号，channel2为vic信号。将不同荧光信号的微滴分成3种类型，黑色无模板微滴(左下方)/绿色含突变型微滴(右下方)/红色含野生型微滴(右上方)。当绿色含突变型微滴数≥3个时判定为突变型，并计算突变率＝fractionalabundance(1-a/b)。图1、3、5、7、9中没有绿色含突变型微滴，因此没有检测到突变。图2、4、6、8、10中含有绿色含突变型微滴，因此检测到突变，突变率为60％/26％/64％/57％/56％。
实施例3本方法检测ctdna样本的msi
1.选取一例msi-h患者，前期组织检测为5个位点不稳定。利用streck游离dna采血管采集该患者全血10ml。经过1900g和16000g二次离心后，得到血浆。取4ml血浆，利用qiagen公司的
2.检测方法按照实施例2流程进行。
3.检测结果：检出msi5个位点不稳定，结果与已知组织结果一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>江苏吉诺思美精准医学科技有限公司
<120>一种用于检测微卫星不稳定性的引物、探针、试剂盒及检测方法
<160>20
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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<212>dna
<213>人工序列(nr21上游引物artificialsequence)
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<213>人工序列(nr27野生型探针artificialsequence)
<400>20
tggcttttttttttttttttttttttttttac32
1.一种用于用于检测微卫星不稳定性的引物，其特征在于，包括如下引物对：
(1)上游引物：5’-tcctactccgcattcacactttc-3’(seqidno:1)；
下游引物：5’-ggagtcgctggcacagttc-3’(seqidno:2)；
(2)上游引物：5’-tacctcctgactccaaaaactcttc-3’(seqidno:3)；
下游引物：5’-cttgcagtgagcggagattg-3’(seqidno:4)；
(3)上游引物：5’-cctccaagaatgtaagtgggagtg-3’(seqidno:5)；
下游引物：5’-gaaactaaatttcctctgcttttggttac-3’(seqidno:6)；
(4)上游引物：5’-tgactacttttgacttcagccagtatatg-3’(seqidno:7)；
下游引物：5’-gctcctttataagcttcttcagtatatgtc-3’(seqidno:8)；
(5)上游引物：5’-caaagcattgaagtctgcagttg-3’(seqidno:9)；
下游引物：5’-ctagcaatgaccaataagcaagtcac-3’(seqidno:10)。
2.一种用于检测微卫星不稳定性的探针，其特征在于，包括如下成对的内参探针和野生型探针：
(1)内参探针5’-vic-ttctggtcactcgcgtttacaaacaaga-bhq1-3’(seqidno:11)；野生型探针5’-fam-cctttttttttttttttttttttagc-mgb-3’(seqidno:12)；
(2)内参探针5’-vic-tctcactctgtcacccaggttggaatg-bhq1-3’(seqidno:13)；野生型探针5’-fam-ctatttttttttttttttttttttttgtg-mgb-3’(seqidno:14)
(3)内参探针5’-vic-tcaaaatgacattctgcattttaactatggctcta-bhq1-3’(seqidno:15)；野生型探针5’-fam-tgatttttttttttttttttttttttttgag-mgb-3’(seqidno:16)
(4)内参探针5’-vic-attgcagcagtcagagcccttaacctt-bhq1-3’(seqidno:17)；野生型探针5’-fam-cctttttttttttttttttttttttttttacc-mgb-3’(seqidno:1)；
(5)内参探针5’-vic-tctgtgagatccaggaaaccatgcttg-bhq1-3’seqidno:19)；野生型探针5’-fam-tggcttttttttttttttttttttttttttac-mgb-3’(seqidno:20)。
3.一种用于检测微卫星不稳定性的试剂盒，包括权利要求1所述的引物和权利要求2所述的探针。
4.权利要求1所述的引物、权利要求2所述的探针、或权利要求3所述的试剂盒在检测微卫星不稳定性中的应用。
5.一种基于数字pcr技术检测微卫星不稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将pcr预混液与待测的dna模板、权利要求1所述的引物、权利要求2所述的探针混合，制备得到数字pcr混合液；
(2)将数字pcr混合液制备成微滴，然后进行pcr扩增反应；
(3)对pcr扩增反应后的产物进行信号分析，在分析软件中根据不同的荧光信号来判断待测样本的突变情况，并计算突变模板的含量。
6.根据权利要求5所述的基于数字pcr技术检测微卫星不稳定性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述pcr扩增反应的条件为：95℃，10min；94℃，30s；60℃，60s；98℃，10min；4℃，终止；其中，94℃和60℃进行40个循环，升降温速度为2℃/s。
技术总结