本发明涉及人met基因检测
技术领域：
，尤其是指一种检测人met基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用。
背景技术：
：met基因位于人类7号染色体长臂(7q31)编码一种跨膜酪氨酸激酶受体，met与配体肝细胞生长因子hgf结合后，发生二聚化并引起细胞内多种酪氨酸残基的磷酸化，进而激活一系列下游信号通路，促进肿瘤细胞增殖、生长、迁移、血管生成。cmet基因导致肿瘤可以通过三种形式：met外显子14突变、met基因扩增和met过度表达。研究显示met基因扩增能激活erbb3/pi3k/akt信号途径，引发对egfr酪氨酸激酶抑制剂(egfr-tki)的耐药，met基因高表达则预后不佳。met基因扩增导致的egfr-tki耐药约占全部egfr-tki耐药的9.8～20.0％。因此，met基因扩增检测可以很好的预测分子靶向药物的治疗效果，对指导临床开展非小细胞肺癌(nsclc)的个体化靶向治疗具有重要意义。目前met基因扩增的检测方法主要有下一代测序(ngs)、荧光原位杂交(fish)以及荧光定量pcr(qpcr)的方法。下一代测序(ngs)技术能够同时对多个样本同时检测，且可以对多个基因位点检测，但成本较高、实验周期较长，且数据分析复杂；荧光原位杂交(fish)技术检测met基因扩增特异性高，但是样本处理周期长，成本高(探针价格昂贵)，结果判读主观性和专业性较强，临床应用不易推广；荧光定量pcr(qpcr)技术虽然具有重复性好、特异性强等特点，但由于其依赖于标准曲线和ct值，定量的准确度不够，且灵敏度比较差，目前该方法的灵敏度最好的为1％，无法满足某些高灵敏度的检测需求。因此，迫切需要一种新的met基因扩增检测方案来克服上述缺陷。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一种检测人met基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用，敏感性高、准确性高、解读方便且易开展。为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：包括以下步骤：s1，提取受试者全血样本中的cfdna；s2，以步骤s1中提取的cfdna为模板，将待测样品cfdna模板、用于检测人met基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字pcr反应，制备ddpcr混合液；s3，对步骤s2中pcr扩增反应后的产物进行信号收集；s4，根据步骤s3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有met基因扩增；所述步骤s2中的具体反应步骤如下：s01，制备pcr混合物总体积18-22μl：其中14-18μl使用2xddpcrmastermix(bio-rad)和定制的40xtaqman探针和引物配置的taqmanpcr反应混合物，再加入1-4μl模板dna；s02，混合好地样品加入到液滴反应装置(bio-rad)，每个反应通道加入,60-80μl地反应油(bio-rad)，待反应液滴产生后，将样品转移到96孔pcr反应板，在传统地pcr仪中进行扩增反应。优选地，检测met基因扩增的引物组合物和探针，包括met引物组和探针、内参基因引物组和探针；其中用于检测met基因扩增的上游引物序列：5'-agttcgctacgatgcaagagt-3'，核苷酸序列如seqidno.1所示；用于检测met基因扩增的下游引物序列：5'-agttgggcttacacttcggg-3'，核苷酸序列如seqidno.2所示；用于检测met基因扩增的探针序列：5'-tcctcatttggataggcttgta-3'，核苷酸序列如seqidno.3所示；内参基因为rpp30，内参基因的上游引物序列：5'-gatttggacctgcgagcg-3'，核苷酸序列如seqidno.4所示；内参基因的下游引物序列：5'-gctgtctccacaagtccgc-3'，核苷酸序列如seqidno.5所示；内参基因的探针序列：5'-ctgacctgaaggctct-3'，核苷酸序列如seqidno.6所示。优选地，met基因扩增区域的探针seqidno.3和内参基因的探针seqidno.6均可独立地于5'端结合荧光基团，于3'端结合淬灭基团；met基因扩增区域的探针seqidno.3和内参基因的探针seqidno.6的3'端均可独立的结合mgb修饰基团后再结合淬灭基团。探针5'端至3'端的方向上，依次为荧光基团，探针序列，mgb修饰基团和淬灭基团。优选地，met基因探针标记的荧光基团为fam。优选地，rpp30内参基因探针标记的荧光基团为vic。优选地，met基因探针和rpp30内参基因标记的淬灭基团为nfq。优选地，pcr反应混合物中用于met基因扩增的上游引物、下游引物、用于检测met基因扩增的内参基因的上游引物、下游引物含量均为0.8-1.2μm，进一步优选地，为0.8μm。优选地，pcr反应混合物中用于met基因扩增的探针、用于检测met基因扩增的内参基因的探针含量均为0.4-0.5μm，进一步优选地，为0.45μm。优选地，pcr反应混合物中dna模板地含量为2-3ng/μl，进一步优选地，为2.5ng/μl。优选地，ddpcr反应条件为：88-94℃预变性10-20分钟；91-93℃变性51-58秒，50-54℃退火/延伸72-80s，共进行45-50个循环，11-13℃保持。本发明的有益效果：(1)针对met基因扩增设计了特定序列的引物对和特定序列的探针，实现对met基因扩增的高灵敏度检测，灵敏度可达到0.001％；(2)可检测的样本来源多样，既可以是肿瘤组织dna，也可以是cfdna，扩大了该试剂盒的使用范围，实现无创检测met基因扩增。附图说明图1为样本b的ddpcr具体扩增结果。具体实施方式为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例与附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。实施例11)、基于微液滴数字pcr技术检测met基因扩增的引物和探针的设计与合成基于基因组分析数据，对met基因进行分析，使用oligo软件分析taqman引物和探针的位点，从中选择最佳组合如下：met基因上、下游引物：met上游引物seqidno1：5'-agttcgctacgatgcaagagt-3'met下游引物seqidno2：5'-agttgggcttacacttcggg-3'2)、利用上述的引物进行pcr扩增时，扩增片段为73bp，特别适用于血浆游离dna等小片段dna样本的扩增。3)、met基因检测探针：seqidno3：5'-tcctcatttggataggcttgta选用能够稳定扩增、且经过测试扩增效果跟met保持一致的基因为内参基因。4)、本实施例中选用的内参基因为rpp30，内参基因rpp30上、下游引物：上游引物seqidno3：5'-gatttggacctgcgagcg-3'下游引物seqidno4：5'-gcggctgtctccacaagt-3'5)、利用上述的引物进行pcr扩增时，扩增片段为62bp，特别适用于血浆游离dna等小片段dna样本的扩增。6)、内参基因rpp30检测探针：seqidno6：5'-ctgacctgaaggctct-3'。7)、本发明的引物和探针的设计特异性强，应用于pcr检测时灵敏度可达0.001％；且利用此套引物进行pcr扩增，扩增出来的片段不到100bp，特别适用于血浆游离dna等小片段dna样本的扩增，能从cfdna中检测到极低丰度的met基因扩增变异，对于指导临床治疗、改善患者预后有重要作用。实施例2提取待检样本中的cfdna：本实施例中的待检样本为血浆样本，样本编号分别为a，b，c，d和e；采用试剂盒提取血浆样本中的cfdna，具体的操作参见qiagen公司的qiaampcirculatingnuleacidkit试剂盒说明书，并且以提取出的cfdna作为ddpcr检测的模板，其中a、b和c为met阳性样本，d和e为met阴性样本。实施例3在pcr板中按照表1所示配比制备pcr反应液：其中cfdna模板和内参基因的浓度均为2.5ng/μl。表1pcr反应液配置试剂用量2×ddpcrmastermix10μlcfdna模板2μl各条引物0.8μm各探针0.45μm补depc水至20μl实施例4将装有配制好的20μl数字pcr混合液的pcr板、新的96孔pcr板、枪头、微滴发生卡和微滴生成油装入autodg自动化微滴发生器，用于制备pcr微反应微滴。将装有pcr微反应液滴的96孔pcr板用封板膜进行热封，生成的微反应液滴数量为10000～20000个。将96孔pcr板放入pcr仪按照下面条件进行扩增反应：94℃预变性20分钟；93℃变性51秒，54℃退火/延伸75s，共进行45个循环，12℃保持。实施例5pcr扩增反应后的产物进行信号收集，根据荧光信号类型判断待测样品中是否含有met基因扩增。可用quantasoft(bio-rad)软件进行数据分析，计算样品中两个基因的拷贝数，然后用met基因拷贝数去除以内参基因拷贝数，得到拷贝数比值结果。样本b具体扩增结果见图1。表2不同样品ddpcr检测结果与hic结果比对样本编号ihc结果ddpcr结果(拷贝数比值)a 16.2b 2.66c 2.29d-1.45e-1.84根据本发明的判断依据，结合ddpcr检测结果，样本a、b和c中两种基因的拷贝数比值均大于2，为met阳性；而样本d和e中，两种基因拷贝数比值均小于2，为met阴性。结果表明本发明的检测结果与ihc结果完全一致。最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3
技术特征：1.一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：包括以下步骤：
s1，提取受试者全血样本中的cfdna；
s2，以步骤s1中提取的cfdna为模板，将待测样品cfdna模板、用于检测人met基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字pcr反应，制备ddpcr混合液；
s3，对步骤s2中pcr扩增反应后的产物进行信号收集；
s4，根据步骤s3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有met基因扩增；
所述步骤s2中的具体反应步骤如下：
s01，制备pcr混合物总体积18-22μl：其中14-18μl使用2xddpcrmastermix(bio-rad)和定制的40xtaqman探针和引物配置的taqmanpcr反应混合物，再加入1-4μl模板dna；
s02，混合好地样品加入到液滴反应装置(bio-rad)，每个反应通道加入,60-80μl地反应油(bio-rad)，待反应液滴产生后，将样品转移到96孔pcr反应板，在传统地pcr仪中进行扩增反应。
2.根据权利要求1所述的一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：检测met基因扩增的引物组合物和探针，包括met引物组和探针、内参基因引物组和探针；其中用于检测met基因扩增的上游引物序列：5'-agttcgctacgatgcaagagt-3'，核苷酸序列如seqidno.1所示；
用于检测met基因扩增的下游引物序列：5'-agttgggcttacacttcggg-3'，核苷酸序列如seqidno.2所示；
用于检测met基因扩增的探针序列：5'-tcctcatttggataggcttgta-3'，核苷酸序列如seqidno.3所示；
内参基因为rpp30，内参基因的上游引物序列：5'-gatttggacctgcgagcg-3'，核苷酸序列如seqidno.4所示；
内参基因的下游引物序列：5'-gctgtctccacaagtccgc-3'，核苷酸序列如seqidno.5所示；
内参基因的探针序列：5'-ctgacctgaaggctct-3'，核苷酸序列如seqidno.6所示。
3.根据权利要求2所述的一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：met基因扩增区域的探针seqidno.3和内参基因的探针seqidno.6均可独立地于5'端结合荧光基团，于3'端结合淬灭基团；met基因扩增区域的探针seqidno.3和内参基因的探针seqidno.6的3'端均可独立的结合mgb修饰基团后再结合淬灭基团。探针5'端至3'端的方向上，依次为荧光基团，探针序列，mgb修饰基团和淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：met基因探针标记的荧光基团为fam。
5.根据权利要求3所述的一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：rpp30内参基因探针标记的荧光基团为vic。
6.根据权利要求3所述的一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：met基因探针和rpp30内参基因标记的淬灭基团为nfq。
7.根据权利要求1所述的一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：pcr反应混合物中用于met基因扩增的上游引物、下游引物、用于检测met基因扩增的内参基因的上游引物、下游引物含量均为0.8-1.2μm，进一步优选地，为0.8μm。
8.根据权利要求1所述的一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：pcr反应混合物中用于met基因扩增的探针、用于检测met基因扩增的内参基因的探针含量均为0.4-0.5μm，进一步优选地，为0.45μm。
9.根据权利要求1所述的一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：pcr反应混合物中dna模板地含量为2-3ng/μl，进一步优选地，为2.5ng/μl。
10.根据权利要求1所述的一种检测人met基因扩增的方法，其特征在于：ddpcr反应条件为：88-94℃预变性10-20分钟；91-93℃变性51-58秒，50-54℃退火/延伸72-80s，共进行45-50个循环，11-13℃保持。
技术总结本发明涉及人MET基因检测技术领域，尤其是指一种检测人MET基因扩增的引物组合物、试剂和试剂盒及其应用，其应用为一种检测人MET基因扩增的方法，包括以下步骤：S1，提取受试者全血样本中的cfDNA；S2，以步骤S1中提取的cfDNA为模板，将待测样品cfDNA模板、用于检测人MET基因扩增的引物组合物、探针或试剂盒进行定量数字PCR反应，制备ddPCR混合液；S3，对步骤S2中PCR扩增反应后的产物进行信号收集；S4，根据步骤S3中收集的荧光信号类型判断待测样品中是否含有MET基因扩增。本发明敏感性高、准确性高、解读方便且易开展。
技术研发人员：段小红;杨春燕;王冬冬;丁蕊;张腾龙;周启明
受保护的技术使用者：杭州求臻医学检验实验室有限公司
技术研发日：2020.12.29
技术公布日：2021.03.12
