本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及用于检测猪背膘厚的snp标记及其应用。
背景技术：
养猪业是畜牧业的重中之重，关系到国计民生。近三十年来，我国一直致力于中国瘦肉型猪新品系的选育，育种目标主要集中在背膘性状的改良上。猪的背膘厚和瘦肉率是生猪养殖和育种过程中最主要的经济性状，该性状的高低直接影响整个养猪产业的经济效益和种群的育种价值。其中，猪的校正背膘厚是一种遗传力较高的性状，可以直接反映胴体品质和瘦肉率高低。背膘厚越低，瘦肉率越高，生长速度越快。背膘厚还可反映母猪的营养水平和繁殖性能。在同一猪群中，背膘厚越低的个体一般具有更高的瘦肉率和更快的生长速度。
因此，加深对背膘厚度性状的研究和相关候选基因鉴定，不仅有助于了解背膘厚性状形成分子机制，而且对进一步进行基因组育种具有重大意义。
全基因组关联分析(genome-wideassociationstudy,gwas)，是指在数百或数千个个体的大群体中，对全基因组范围内的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，snp)进行基因分型，进而将基因型与可观测的性状进行群体水平的统计学分析，基于得到的统计量和p值，筛选出最有可能影响该性状的snps标记。其中，snp标记是第三代分子标记，是指在基因组dna序列上由单个碱基的突变而产生的一种多态性，这种突变包括单碱基的颠换、转换、插入和缺失。
目前，仍然缺少功能明确、效应显著且可直接用于育种的与猪背膘厚相关的snp标记。
因此，有必要提供一种用于检测猪背膘厚的snp标记及其应用，以提高猪育种进程和猪产业化利润。
技术实现要素：
为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，获得了与猪校正背膘厚相关的snp标记，丰富了影响猪生产性状的snp位点，所述snp标记位于猪1号染色体上第311973532bp处，与or10ag1基因紧密连锁，且与猪校正背膘厚显著相关，通过检测该snp标记的不同基因型可以进行猪背膘厚性状的遗传改良，缩短了育种周期，提高了育种效率和育种精度，从而完成了本发明。
具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
第一方面，提供一种用于检测猪背膘厚的snp标记，其中，所述snp标记位于国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处。
第二方面，提供一种用于鉴定第一方面所述snp标记的引物对，其中，所述引物对为p4和p5，其核苷酸序列分别如seqidno.4和seqidno.5所示。
第三方面，提供一种第二方面所述的引物对在鉴定猪背膘厚或在猪遗传育种方面的应用。
第四方面，提供一种第一方面所述的snp标记的获取方法，其中，所述方法包括以下步骤：
步骤1，获取猪的表型性状数据；
步骤2，获取猪的基因组dna；
步骤3，对猪全基因组内的snp进行基因型检测；
步骤4，将基因型数据与猪的表型性状数据进行关联分析。
第五方面，提供一种鉴定或辅助鉴定猪背膘厚的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
步骤a，获取待测猪的基因组dna；
步骤b，对待测猪的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；
步骤c，对扩增产物进行测序，并根据测序结果确定待测猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点的基因型。
第六方面，提供一种第一方面所述的snp标记或第四方面所述方法获得的snp标记在鉴定或辅助鉴定猪背膘厚方面的应用。
第七方面，提供一种第一方面所述的snp标记或第四方面所述方法获得的snp标记在筛选低校正背膘厚猪群体方面的应用。
本发明所具有的有益效果包括：
(1)本发明提供的用于检测猪背膘厚的snp标记，可通过检测该snp标记的不同基因型来进行猪背膘厚性状的遗传改良，缩短了育种周期，降低了育种成本；
(2)本发明提供的用于检测猪背膘厚的snp标记，可通过鉴定该标记来筛选低背膘厚种猪个体，获得的低背膘厚的猪品系具有重要的经济效益和社会价值；
(3)本发明通过全基因组关联分析挖掘得到与猪校正背膘厚相关的snp位点，有助于了解猪背膘厚性状形成分子机制，对提高猪产业化利润和加快遗传进展有着重要的作用。
附图说明
图1示出本发明实施例1中snp位点的三种基因型与猪校正背膘厚差异的单因素方差分析图。
具体实施方式
下面通过优选实施方式和实施例对本发明进一步详细说明。通过这些说明，本发明的特点和优点将变得更为清楚明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
本发明的第一方面，提供了一种用于检测猪背膘厚的snp标记，所述snp标记位于国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处。
根据本发明一种优选的实施方式，所述位于国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp标记具有c/t多态性，其与猪校正背膘厚显著相关。
其中，所述snp标记记为wu_10.2_1_311973532，其ncbi参考编号为rs337950898。
在本发明中，所述猪校正背膘厚指的是用背膘厚度校正公式校正后的猪背膘厚度，所述校正公式为：
校正背膘厚＝实测背膘厚×cf；
cf＝a÷{a [b×(实测体重-100)]}；
其中，a/b为不同猪种背膘厚度校正系数。。
优选地，所述位于国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp标记与or10ag1(嗅觉受体家族10亚家族ag成员1)基因紧密连锁。
本发明人以猪为研究对象，通过全基因组关联分析方法，获得了与猪校正背膘厚相关的上述snp标记。进一步地，基于连锁不平衡(linkagedisequilibrium，ld)原理，在该snp位点附近进行单倍型分析发现，该位点可以与附近其他snps形成一个大小为454kb的单倍型块，包含了or10ag1(嗅觉受体家族10亚家族ag成员1)基因，该基因在人类和黑猩猩等灵长类动物上高度保守。
利用连锁不平衡原理进行gwas分析，只要保证每个单倍型模块中都有snp的分型信息，即可得到较全面的gwas结果。
其中，自然群体的基因组中存在数目庞大的多态性，由于连锁的存在及群体形成过程中突变、重组和选择等因素的影响，多态位点的等位基因间存在广泛的非随机关联，即连锁不平衡，多个基因座的等位基因间的ld形成了一系列的单倍型。
本发明人发现，所述位于国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处snp位点与or10ag1基因紧密连锁，其与猪校正背膘厚显著相关，推断or10ag1基因与猪肌肉生长发育具有关联性。
在进一步优选的实施方式中，所述位于国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处snp标记的基因型为cc型的猪，相较于基因型为tc或tt的猪有更低的校正背膘厚，即具有更高的瘦肉率和更快的生长速度。
其中，所述cc基因型的猪指国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点在两个等位基因中的碱基均为c；tc基因型的猪指国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点在两个等位基中的碱基为t和c；tt基因型的猪指国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点在两个等位基因中的碱基均为t。
为获得与猪背膘厚相关的基因型类型，首先需要获得猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点的基因分型信息。
根据本发明一种优选的实施方式，所述snp位点的基因分型方法包括以下步骤：
(1)提取猪的基因组dna，变性后进行全基因组扩增；
(2)将扩增产物孵化过夜，酶解后进行离心、净化；
(3)将步骤2处理的产物与芯片进行特异性杂交，然后进行单碱基延伸反应，并检测反应信号。
其中，步骤(1)中，所述全基因组扩增技术是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，主要目的是在如实反映基因组全貌的基础上，最大限度地增加dna的量，在没有序列倾向性的前提条件下对微量组织、单个细胞的整个基因组dna进行扩增，为后续的多基因、多位点分析及基因组的全面研究提供足量的dna模板。
步骤(2)中，所述孵化过夜在37℃条件下进行。
步骤(3)中，所述单碱基延伸反应的引物为p1、p2和p3，其核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2和seqidno.3所示。
优选地，本发明采用美国纽勤(neogen)公司的neogen_por80k芯片，利用分型软件gencallversion7.0.0进行snp分型检测。
本发明的第二方面，提供了一种用于鉴定第一方面所述检测猪背膘厚的snp标记的引物对，所述引物对为p4和p5，其核苷酸序列分别如seqidno.4和seqidno.5所示。
本发明的第三方面，提供了第二方面所述引物对在鉴定猪背膘厚或在猪遗传育种方面的应用，其中，所述猪遗传育种为猪分子标记辅助育种。
本发明的第四方面，提供了一种第一方面所述snp标记的获取方法：
步骤1，获取猪的表型性状数据。
在本发明中，选择猪群体进行表型性状数据测定，所述群体中的猪个体为100天左右日龄、体重在85～105kg范围内的猪。
所述猪的表型性状包括猪背膘厚度，并利用背膘厚度校正公式进行校正，即猪校正背膘厚。
具体地：在测定体重时，同时测定活体背膘厚，优选采用b超扫描测定群体中猪个体的倒数第3～4肋间处背膘厚，以毫米为单位。最后，按如下校正公式计算猪达100kg体重的活体背膘厚：
校正后背膘厚与实测背膘厚的关系式为：
校正背膘厚＝实测背膘厚×cf(其中：cf＝a÷{a [b×(实测体重-100)]})。
其中，a/b为不同猪种背膘厚度校正系数。
校正日龄＝测定日龄-[(实测体重-100)/cf]，
其中：公猪cf值＝(实测体重/测定日龄)×1.826040；
母猪cf值＝(实测体重/测定日龄)×1.714615，
实测体重的单位为kg。
在本发明中，优选对测得的表型性状数据进行质量控制，清除表型值缺失的个体。
步骤2，获取猪的基因组dna。
在本发明中，采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取猪的基因组dna，优选采集实验群体的猪耳组织进行基因组dna的提取。
步骤3，对猪全基因组内的snp进行基因型检测。
在本发明中，优选按照下述步骤对snp进行基因分型检测：
(1)提取猪的基因组dna，变性后进行全基因组扩增；
(2)将扩增产物孵化过夜，酶解后进行离心、净化；
(3)将步骤2处理的产物与芯片进行特异性杂交，然后进行单碱基延伸反应，并检测反应信号。
更优选地，采用美国纽勤(neogen)公司的neogen_por80k芯片，利用分型软件gencallversion7.0.0对提取的基因组dna样品进行snp分型检测。
其中，在基因型检测的过程中，清除基因型检出率小于95％的snp位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率(minimumallelefrequency，maf)小于1％的个体。
步骤4，将基因型数据与猪的表型性状数据进行关联分析。
在本发明中，优选利用r语言包gapit进行基因型对猪表型性状的关联分析，所述分析模型为：
y＝xβ zu e，
其中：y是观察到的表型的值；β是含有固定效应的未知值，包括遗传标记，种群结构(q矩阵)和截距；u是来自个体或者系的多个背景qtl的随机加性遗传效应的未知值；x和z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。
假设u和e向量是正态分布的，具有零均值和方差：
其中：g＝σ2ak，其中σ2a作为加性遗传方差，k作为亲属矩阵；假设残余效应的均匀方差；即，r＝σ2ei，其中σ2e是残差方差；由遗传方差解释的总方差的比例被定义为遗传力(h2)。
通过上述分析模型，能够获得与猪背膘厚相关的snp标记，以及背膘厚小的snp标记对应的基因型。
本发明的第五方面，提供了一种鉴定或辅助鉴定猪背膘厚的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤a，获取待测猪的基因组dna。
其中，采用现有技术中常用的方法或试剂盒提取猪的基因组dna，优选采集实验群体的猪耳组织进行基因组dna的提取。
步骤b，对待测猪的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物。
其中，所述扩增优选采用第二方面所述的引物对进行，获得的扩增产物经回收后，为包含猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点的核苷酸片段。
根据本发明一种优选的实施方式，所述pcr扩增的体系包括10×pcrbuffer(15mmmgcl2)、mgcl2(25mm)、dntpmix10(25mm)、引物混合物(1μm)、hotstartaq(5u/μl)和水(hplcgrade)。
在进一步优选的实施方式中，所述pcr扩增的反应条件为：95℃300s；95℃4s，55℃30s，72℃30s，35个循环；16℃∞。
步骤c，对扩增产物进行测序，并根据测序结果确定待测猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点的基因型。
其中，若待测猪的国际参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点的基因型为cc，则该待测猪具有较低的猪背膘厚，若待测猪的国际参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点的基因型为tc或tt，则该待测猪具有较高的猪背膘厚。
本发明的第六方面，提供了一种第一方面所述snp标记或第四方面所述方法获得的snp标记在鉴定或辅助鉴定猪背膘厚方面的应用。
本发明的第七方面，提供了一种第一方面所述snp标记或第四方面所述方法获得的snp标记在筛选低校正背膘厚猪群体方面的应用，所述应用包括确定猪的国际参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点的基因型的步骤。
其中，淘汰在上述snp位点基因型为tc和tt的猪个体，选择在上述snp位点基因型为cc的猪作为种猪，以逐代提高该snp位点的纯合基因型cc的频率，从而降低后代猪的背膘厚。
实施例
以下通过具体实例进一步描述本发明，不过这些实例仅仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1
1、试验动物：
本发明所应用的试验猪群体为河北美神原种猪场的长白、大白和杜洛克纯种猪，共1173头(其中，长白猪379头，大白猪594头，杜洛克猪200头)，体重在85～105kg范围内。
2、表型测定：
在测定体重时，同时测定活体背膘厚；采用b超仪扫描测定倒数第3～4肋间处的背膘厚，以毫米为单位；最后按如下校正公式计算猪达100kg体重的活体背膘厚：
校正后背膘厚与实测背膘厚的关系式为：
校正背膘厚＝实测背膘厚×cf(其中：cf＝a÷{a [b×(实测体重-100)]})；
其中，大白猪、长白猪、杜洛克猪的公母猪背膘厚度校正表如下表1所示：
表1公母猪背膘厚度校正表
其中，a/b为不同猪种背膘厚度校正系数。
校正日龄＝测定日龄－[(实测体重－100)/cf]
其中：
公猪cf值＝(实测体重/测定日龄)×1.826040
母猪cf值＝(实测体重/测定日龄)×1.714615。
3、试验猪群体的基因组dna提取：
逐个采集猪耳组织浸泡于75％乙醇中，置于-20℃冰箱保存备用，采用北京百泰克生物技术有限公司的dp1902型号细胞/组织基因组dna提取试剂盒，按照说明书所述步骤进行提取：
(1)将猪耳组织剪碎后放入一个1.5ml离心管后，加入200μl组织裂解液tl，用大口径枪头吹打混匀；
(2)加入20μl的蛋白酶k(20mg/ml)，剧烈颠倒轻摇充分混匀；
(3)将裂解物放置在55℃水浴3小时或者直到组织消化完全，期间轻柔的振荡几次帮助裂解；
(4)用一个1ml不带针头的一次性输液器抽打裂解物2-3次；
(5)加入200μl结合液cb和100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇充分混匀；
(6)13,000rpm离心5分钟，将上清加入一个吸附柱ac中，(吸附柱放入收集管中)10,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；
(7)加入500μl抑制物去除液ir，12,000rpm离心30秒，弃废液；
(8)加入700μl漂洗液wb(请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；
(9)加入500μl漂洗液wb，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；
(10)将吸附柱ac放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；
(11)取出吸附柱ac，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液eb(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5分钟，12,000rpm离心1分钟；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟；洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要dna浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50μl，体积过小降低dna洗脱效率，减少dna产量；
(12)dna可以存放在2-8℃，如果要长时间存放，可以放置在-20℃，为dna分型做准备。
经过nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度统一稀释到50ng/μl于-20℃下保存备用。
4、获得基因型数据：
将dna样品送纽勤生物科技(上海)有限公司，基于neogen_por80k芯片，利用分型软件gencallversion7.0.0进行snp基因型判定。
同时，对所用样本的芯片扫描分型数据进行质量控制，以清除基因型检出率小于95％的snp位点；清除检出率小于95％的个体；清除最小等位基因频率(minimumallelefrequency，maf)小于1％的个体。。
采用popgene3.2计算该snp标记位点的基因型频率和等位基因频率，结果如表2所示：
表2
5、关联分析：
gwas分析的具体步骤如下：
利用r语言包gapit，基于压缩混合线性模型，进行基因型对猪表型性状的关联分析，所述分析模型为：
y＝xβ zu e，
其中：y是观察到的表型的值；β是含有固定效应的未知值，包括遗传标记，种群结构(q矩阵)和截距；u是来自个体或者系的多个背景qtl的随机加性遗传效应的未知值；x和z是已知的设计矩阵；e是未观察到的残差向量。
假设u和e向量是正态分布的，具有零均值和方差：
其中：g＝σ2ak，其中σ2a作为加性遗传方差，k作为亲属矩阵；假设残余效应的均匀方差；即，r＝σ2ei，其中σ2e是残差方差；由遗传方差解释的总方差的比例被定义为遗传力(h2)。
经关联分析，本发明获得与猪校正背膘厚存在显著关联的snp位点，即为试验猪群体中1号染色体上第311973532处的snp位点。
结果如表3所示：
表3
其中，p<0.01代表差异极显著。
由表3可知，wu_10.2_1_311973532位点的三种基因型在猪校正背膘厚性状上有极显著差异(p<0.01)，该位点的cc型校正背膘厚显著低于tc型和tt型(p<0.01)。由此可以明显看出，在猪群体中，继代选育wu_10.2_1_311973532位点的cc基因型个体，可逐步降低猪背膘厚，从而提高饲养效率，增加经济效益。
进一步地，采用rstudio软件对基因型数据和表型数据利用kruskal-wallis方法进行差异显著性检验。利用r语言的ggplot2、ggpubr和magrittr函数包绘制箱线图，结果如图1所示。
由图1可知，cc基因型猪相比较于ct型和tt型个体，具有最低的背膘厚。通过对该位点进行基因型检测，筛选cc型种猪，则能降低猪群的背膘厚，提高瘦肉率。
以上结合具体实施方式和范例性实例对本发明进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本发明的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本发明的范围内。
sequencelisting
<110>中国农业科学院农业基因组研究所
<120>一种用于检测猪背膘厚的snp标记及其应用
<130>2019
<160>5
<170>patentinversion3.5
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>p1（人工序列）
<400>1
gaagacatgagcccaaata19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>p2（人工序列）
<400>2
gaagacatgagcccaaatac20
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>p3（人工序列）
<400>3
gaagacatgagcccaaatat20
<210>4
<211>17
<212>dna
<213>p4（人工序列）
<400>4
tttccaggaagtatggc17
<210>5
<211>18
<212>dna
<213>p5（人工序列）
<400>5
ctgccaatgcagggttct18
1.一种用于检测猪背膘厚的snp标记，其特征在于，所述snp标记位于国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处。
2.根据权利要求1所述的snp标记，其特征在于，所述snp标记具有c/t多态性，
所述位于国际猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处snp标记的基因型为cc型的猪，相较于基因型为tc或tt的猪有更低的校正背膘厚，即具有更高的瘦肉率和更快的生长速度。
3.用于鉴定权利要求1或2所述snp标记的引物对，其特征在于，所述引物对为p4和p5，其核苷酸序列分别如seqidno.4和seqidno.5所示。
4.权利要求3所述的引物对在鉴定猪背膘厚或在猪遗传育种方面的应用。
5.一种权利要求1或2所述的snp标记的获取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤1，获取猪的表型性状数据；
步骤2，获取猪的基因组dna；
步骤3，对猪全基因组内的snp进行基因型检测；
步骤4，将基因型数据与猪的表型性状数据进行关联分析。
6.一种鉴定或辅助鉴定猪背膘厚的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤a，获取待测猪的基因组dna；
步骤b，对待测猪的基因组dna进行pcr扩增，获得扩增产物；
步骤c，对扩增产物进行测序，并根据测序结果确定待测猪参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点的基因型。
7.一种权利要求1或2所述的snp标记或权利要求5所述方法获得的snp标记在鉴定或辅助鉴定猪背膘厚方面的应用。
8.一种权利要求1或2所述的snp标记或权利要求5所述方法获得的snp标记在筛选低校正背膘厚猪群体方面的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用包括确定猪的国际参考基因组10.2版本参考序列1号染色体上第311973532处的snp位点的基因型的步骤。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，选择在上述snp位点基因型为cc的猪作为种猪，以逐代提高该snp位点的纯合基因型cc的频率。
技术总结