本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒及检测方法。
背景技术：
松材线虫病，又称松树萎蔫病，是由松材线虫引起的具有毁灭性的森林病害，是全球森林生态系统中最具危险性、毁灭性的病害，已被我国列入对内、对外的森林植物检疫对象。入侵我国38年，已扩散至18个省(区、市)、672个县级行政区，累计致死松树超过6亿株，对我国的松林资源、自然景观和生态环境造成严重破坏，造成了严重的经济和生态损失，形势十分严峻。
目前中国在松材线虫病检测鉴定方法研究方面已进行了卓有成效的工作，从传统检测到现代分子检测技术均取得了长足的进步。在20世纪八九十年代，我国学者主要依靠症状检验、流胶法、化学法和显色反应等手段判断寄主的发病情况。此类方法简便易行，不需要复杂的仪器设备，在科学研究与基层生产中都得到了广泛的应用。从21世纪初开始，随着分子生物学技术的发展与应用，松材线虫检测、检疫技术取得了突飞猛进的发展。基于生物化学技术、生物电学技术和生物信息技术的rapd和pcr等新型检测工具得以应用，快速检测试剂盒技术、免疫诊断技术、诱集管捕获诊断技术等新方法、新技术也应运而生。与传统方法相比，新技术的开发与应用大大提高了检疫效率和准确性。然而，目前很多检验、检疫方法由于受到条件和技术的限制，或由于方法尚不完善，离大范围推广应用还有一定的距离。目前市面上缺少一种操作简便、快速高效、可便携易带用于现场检测的手段来应对日益严重的松材线虫病灾害。
技术实现要素：
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒及检测方法，该试剂盒具有检测灵敏度高、特异性好、操作简单，且该试剂盒可以常温运输、储存，便于大规模在松材线虫病防控部门推广应用，将有力推进松材线虫病的早期监测预防和控制。
本发明采用的技术方案如下：松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒，包括q-pcr冻干粉、复溶液和核酸提取试剂，所述q-pcr冻干粉包含扩增酶1-2u、引物100-500nm、探针100-500nm、kcl20-30mm、mgso42-10mm，所述复溶液包含tris-hcl10-20mm，所述核酸提取试剂包含tris-hcl50-200mm、edta10-30mm、nacl200-500mm、sds1-3％，所述引物、探针序列如下：
引物f：cctatgacacatttattcgtgctcgtc
引物r：cggcaagcagctggctg
探针p：fam--ggaacgacgcgaatcgaaccg--bhq1。
优选的，所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的q-pcr冻干粉中引物f和引物r使用浓度为200nm，探针p使用浓度为200nm。
优选的，所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的q-pcr冻干粉中taqdna聚合酶使用浓度为5u。
优选的，所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的q-pcr冻干粉中包含kcl20mm、mgso45mm。
优选的，所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的复溶液包含tris-hcl20mm。
优选的，所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的核酸提取试剂包含tris-hcl100mm、edta25mm、nacl500mm、sds1％。
本发明还提供了松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)利用所述核酸提取试剂从松材线虫疫木木屑样本和线虫液样本中提取松材线虫基因组dna；
(2)将通过所述步骤(1)提取的松材线虫基因组dna作为扩增模板，加入到所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒中，设置反应程序进行扩增检测；
(3)使用荧光检测设备对通过所述步骤(2)的扩增检测结果进行荧光判读。
优选的，所述步骤(1)的松材线虫基因组dna通过以下步骤得到：
取100mg左右的疫木木屑样本到1.5ml的eppendorf管中，加入1ml核酸提取试剂，10,000rpm离心30秒，95℃处理5-20分钟，得到的裂解液即为松材线虫基因组dna扩增模板。
优选的，所述步骤(1)的松材线虫基因组dna通过以下步骤得到：
取1ml的线虫液样本到1.5ml的eppendorf管中，10,000rpm离心1分钟，弃去上清加入100ul核酸提取试剂，95℃处理5-20分钟，得到的裂解液即为松材线虫基因组dna扩增模板。
优选的，所述步骤(2)具体为：
取通过所述步骤(1)制得的松材线虫dna扩增模板5ul加入到所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒20ul反应体系中，反应程序：95℃，3min；95℃，10s；60℃，20s；40个循环，fam通道检测荧光。
优选的，所述步骤(3)中荧光检测设备需要激发波长497nm，检测波长520nm，荧光检测结果的阳性判断ct值为42。
优选的，所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒用于单条及以上松材线虫的检测。
采用上述结构后，本发明有益效果如下：本发明松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒及检测方法，本发明松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒为常温型产品，可实现多场景应用。既能在实验室内进行松材线虫检测检疫工作，也可在户外开展现场快速检测检疫工作。本发明松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒检测时间在40分钟之内完成，操作简单实用性强，更方便各级松材线虫病检测检疫单位、研究机构及社会服务单位在实验室和户外开展松材线虫检测检疫鉴定工作；本发明松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒检测灵敏度高，可实现单条及以上松材线虫样本的检测工作。且本发明松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒具有很好的检测特异性，能够区分松材线虫和拟松材线虫及其他线虫；本发明松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒检测方法对样本处理方式简单、时间短，整个样本处理过程不超过10分钟，样本处理设备经济高效。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为实施例2中本发明松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒对单条松材线虫样本检测结果荧光检测结果图；
图2为实施例3中本发明试松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒对松材线虫分离液样本和拟松材线虫分离液样本检测结果荧光检测结果图；
图3为实施例4中本发明松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒对疫木木屑样本检测结果荧光检测结果图；
图4为实施例5中本发明松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒对不同浓度线虫液样本检测结果荧光检测结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
实施例1松材线虫dna检测的荧光比色试剂盒构建
1、原料准备
实验中用到的松材线虫木屑样本、松材线虫分离液样本、拟松材线虫分离液样本及其他二十余种其他线虫样本均由国家林业和草原局森林病虫害防治总站提供。taqdna聚合酶、反应buffer、扩增引物、探针序列及其他化学试剂由南京耐德高科技有限公司提供。
2、扩增引物的设计及合成
根据genbank中的松材线虫和拟松材线虫基因序列特异性比对，选择保守序列区作为扩增区域，利用oligo7.0引物设计软件和blast软件程序设计出特异性扩增引物，其中引物、探针的序列分别为：
引物f：cctatgacacatttattcgtgctcgtc
引物r：cggcaagcagctggctg
探针p：fam--ggaacgacgcgaatcgaaccg--bhq1
3、松材线虫基因组dna模板的制备
(1)松材线虫疫木木屑样本基因组dna模板制备
取100mg左右的疫木木屑样本到1.5ml的eppendorf管中，加入1ml核酸提取试剂(包含tris-hcl100mm、edta25mm、nacl500mm、sds1％)，10,000rpm离心30秒，95℃处理10分钟，得到的裂解液即为松材线虫基因组dna扩增模板。
(2)松材线虫分离液样本基因组dna模板制备
取1ml的线虫液样本到1.5ml的eppendorf管中，10,000rpm离心1分钟，弃去上清加入100ul核酸提取试剂(包含tris-hcl100mm、edta25mm、nacl500mm、sds1％)，95℃处理10分钟，得到的裂解液即为松材线虫基因组dna扩增模板。
需要说明的是样本裂解时间进行了优化，一份样本分成四份95℃分别裂解2分钟、5分钟、10分钟、15分钟，根据荧光扩增ct值对裂解效率进行评估，最终确定最佳裂解时间为10分钟。
4、扩增体系的优化
所述的松材线虫常温型快速q-pcr试剂盒，扩增体系以25ul计：
q-pcr冻干粉1孔
复溶液20ul
基因组dna模板5ul
需要说明的是对反应体系中各组分的浓度进行了优化，具体为：
(1)处理好的松材线虫基因组dna模板，加入到不同浓度mgso4(2mm、5mm、10mm)配制的q-pcr冻干粉体系中，根据ct值判定最佳浓度，最终确定最佳mgso4浓度为5mm。
(2)处理好的松材线虫基因组dna模板，加入到不同浓度扩增酶(2u、5u、10u)配制的q-pcr冻干粉体系中，根据ct值判定酶的用量，最终确定最佳扩增酶用量为5u。
5、扩增反应程序
所述的松材线虫常温型快速q-pcr试剂盒，反应程序：95℃，3min；95℃，10s；60℃，20s；40个循环，fam通道检测荧光。荧光检测设备激发波长497nm，检测波长520nm，荧光检测结果的阳性判断ct值为42。
需要说明的是对反应程序的反应温度进行了优化，处理好的松材线虫基因组dna模板，加入到扩增体系中，反应温度分别设置59℃、60℃、61℃，根据ct值判定最优反应温度，最终确定最优反应温度为60℃。
6、结果判定
荧光检测设备激发波长497nm，检测波长520nm，荧光检测结果的阳性判断ct值为42。
实施例2松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的灵敏度验证
将线虫液样本用水稀释后，借助显微镜挑取单条线虫样本，使用优化好的样本处理程序进行基因组dna模板的制备，加入优化好的试剂盒扩增体系，检测结果如图1所示，图为荧光结果，1、2为单条线虫样本检测结果，3为阴性对照结果，4为阳性对照结果。从图1可知，单条线虫样本检测结果均为阳性，试剂盒灵敏度可检测到单条线虫。
实施例3松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的特异性验证
使用松材线虫分离液样本和拟松材线虫分离液样本，使用优化好的样本处理程序进行基因组dna模板的制备，加入优化好的试剂盒扩增体系，检测结果如图2所示，图为荧光结果，1为松材线虫分离液样本检测结果，2为拟松材线虫分离液样本检测结果，3为阴性对照结果，4为阳性对照结果。从图2可知，1号结果为阳性，2号结果为阴性，说明试剂盒具有很好的检测特异性，能够区分松材线虫样本和拟松材线虫样本。
实施例4松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒对疫木木屑样本检测验证
使用两份松材线虫疫木木屑样本，使用优化好的样本处理程序进行基因组dna模板的制备，加入优化好的试剂盒扩增体系，检测结果如图3所示，图为荧光结果，1、2为疫木木屑样本检测结果，3为阴性对照结果，4为阳性对照结果。从图3可知，1、2号样本检测结果均为阳性，说明试剂盒可准确检测不同的疫木木屑样本。
实施例5松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒对线虫液样本检测验证
使用线虫液样本进行四个浓度梯度稀释制成四份线虫液样本，使用优化好的样本处理程序进行基因组dna模板的制备，加入优化好的试剂盒扩增体系，检测结果如图4所示，图为荧光结果，1、2、3、4为线虫液样本检测结果，5为阴性对照结果，6为阳性对照结果。从图4可知，1、2、3、4号样本检测结果均为阳性，试剂盒可准确检测不同浓度的线虫液样本。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。
1.松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒，其特征在于：包括q-pcr冻干粉、复溶液和核酸提取试剂，所述q-pcr冻干粉包含扩增酶1-2u、引物100-500nm、探针100-500nm、kcl20-30mm、mgso42-10mm，所述复溶液包含tris-hcl10-20mm，所述核酸提取试剂包含tris-hcl50-200mm、edta10-30mm、nacl200-500mm、sds1-3％，所述引物、探针序列如下：
引物f：cctatgacacatttattcgtgctcgtc
引物r：cggcaagcagctggctg
探针p：fam--ggaacgacgcgaatcgaaccg--bhq1。
2.松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)利用所述核酸提取试剂从松材线虫疫木木屑样本和线虫液样本中提取松材线虫基因组dna；
(2)将通过所述步骤(1)提取的松材线虫基因组dna作为扩增模板，加入到所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒中，设置反应程序进行扩增检测；
(3)使用荧光检测设备对通过所述步骤(2)的扩增检测结果进行荧光判读。
3.根据权利要求2所述的松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)的松材线虫基因组dna通过以下步骤得到：
取100mg左右的疫木木屑样本到1.5ml的eppendorf管中，加入1ml核酸提取试剂，10,000rpm离心30秒，95℃处理5-20分钟，得到的裂解液即为松材线虫基因组dna扩增模板。
4.根据权利要求2所述的松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)的松材线虫基因组dna通过以下步骤得到：
取1ml的线虫液样本到1.5ml的eppendorf管中，10,000rpm离心1分钟，弃去上清加入100ul核酸提取试剂，95℃处理5-20分钟，得到的裂解液即为松材线虫基因组dna扩增模板。
5.根据权利要求2所述的松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)具体为：
取通过所述步骤(1)制得的松材线虫dna扩增模板5ul加入到所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒20ul反应体系中，反应程序：95℃，3min；95℃，10s；60℃，20s；40个循环，fam通道检测荧光。
6.根据权利要求2所述的松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中荧光检测设备需要激发波长497nm，检测波长520nm。
7.松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒的用途，其特征在于：所述松材线虫核酸检测常温型快速pcr试剂盒用于单条及以上松材线虫的检测。
技术总结