本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种三角帆蚌性别的鉴定方法。
背景技术：
三角帆蚌俗称河蚌、珍珠蚌、三角蚌，是一种淡水双壳类软体动物，属瓣鳃纲，真瓣鳃目，珠蚌科、帆蚌属。它是我国主要的淡水珍珠育珠蚌，国内的淡水珍珠中80％以上都是由其育出。在性成熟三角帆蚌个体中，雌雄间在产珠性能方面存在显著差异，雄性具有更好的育珠能力。挑选出雄性三角帆蚌进行精细化养殖，对珍珠产能的提升具有较大的意义。但在实际生产中，雌雄蚌的性别鉴定仍是一个难题。从形态学来看，对三角帆蚌直观地进行性别鉴定比较困难，有研究发现三角帆蚌雌性鳃丝排列紧密，雄性排列稀疏，通过鳃丝的疏密就能区分雌雄。但是这种方法是建立在人为经验的判断上，适用于有经验的人员，并且该方法只能针对性成熟的且处在繁殖期的三角帆蚌，局限性较大，且鉴定的准确程度不高。此外，若想更好的为后续育珠插核做准备，构建单性别育珠群体，则需尽早的鉴别出三角帆蚌的性别，因此，幼龄三角帆蚌的性别鉴定对于淡水珍珠养殖也是至关重要的。综上所述，建立一种三角帆蚌性别鉴别的方法就显得尤为重要。
在哺乳动物和其他物种中，线粒体的遗传遵循严格的母系遗传，即子代的线粒体全部来源于母系，而在三角帆蚌中存在两种类型的线粒体基因组(mtdna)，分别是f型线粒体基因组和m型线粒体基因组。雄性三角帆蚌体组织中线粒体基因组为f型，性腺组织线粒体基因组为m型；雌性中线粒体基因组在体组织和性腺组织中均为f型。基于这种特殊的线粒体基因组的遗传模式，通过对比三角帆蚌f型和m型线粒体基因组序列发现，参与编码线粒体基因组的13个编码基因都存在一定程度上的序列差异，尤其是coii基因的序列差异性最大。m型线粒体基因组coii基因序列比f型线粒体基因组coii基因的5’端多出500bp的特异性序列，并且根据m型线粒体基因组仅存在于雄性性腺中这一特点，我们开发出一种快速准确的性别鉴定方法。
技术实现要素：
针对现有技术中的不足，与传统方法相比，根据分子生物学的方法判断准确，不局限于样本的时间阶段，能够实现幼龄三角帆蚌性别的精准快速检测，因此本发明提供了一种新的鉴定方法，补足了技术空缺。故本发明的目的是提供一种简单、准确的三角帆蚌性别的鉴定方法，通过对m型线粒体基因组上coii基因简单的pcr扩增就能够确定三角帆蚌的性别，为三角帆蚌的性别鉴定提供便利。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种三角帆蚌性别的鉴定方法，其包括如下步骤：
1.样本采集
根据检测需求选取若干样本，使用不同套的镊子和剪刀等取样工具避免交叉污染，剪取三角帆蚌的50-100mg新鲜性腺组织装入1.5ml灭菌离心管中，快速置于液氮中速冻，采样结束后在-80℃下保存；加入500μl裂解液，用研磨杵充分将组织磨碎，再补充500μl裂解液，开始裂解；在55℃下裂解3-4h至澄清，过程中每0.5-1h翻转摇动一次。
其中，裂解液包括320μl双蒸水ddh2o、20μl(1mol/l)三羟甲基氨基甲烷盐酸盐tris-hcl、80μl(0.5mol/l)乙二胺四乙酸二钠edta-na2；70μl(10wt％)癸二酸二酰肼sds和10μl(20mg/μl)蛋白酶kproteinasek。
2.dna提取
采用苯酚/氯仿法提取三角帆蚌基因组dna：
(1)、加入500μl苯酚，上下颠倒8min，离心；
(2)、吸取上清液，加入体积比为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇，上下颠倒，离心；
(3)、吸取上清液，加入体积比为24:1的氯仿：异戊醇，上下颠倒，离心；
(4)、吸取上清液，加入2倍体积的冰乙醇(-20℃)，低温(-20℃)静置30min，离心；
(5)、弃上清液，用体积分数为70％冰乙醇(-20℃)洗涤1-2次，离心，并将沉淀物放置在无菌操作台内干燥15min；
(6)、在干燥后的沉淀物中加入50-100μl的ddh2o溶解dna，4℃放置过夜溶解。
其中，步骤(1)至步骤(5)中，上下颠倒的时间均可以为8±0.1min，温度均可以为6±0.1℃；离心的转速均可以为11000±100r/min，时间均可以为5-10min。
3.dna浓度检测
采用nanodroop2000测定浓度和纯度，浓度测定完成后加入适量ddh2o调节浓度至100ng/μl左右。
4.pcr扩增
以dna为模板，设计f1(正向引物)和r1(反向引物)为引物进行pcr扩增。
其中，pcr扩增的体系为：反应体系为25μl，其中包括:dna模板为1μl，正向引物f1(5'-ctaactataccgatgcctt-3')和反向引物r1(5'-atgagcttatggggtcaaat-3')各为1μl，2×taq-mix酶(天根公司)为12.5μl，最后用ddh2o补足至25μl。
pcr扩增的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。
5.琼脂糖凝胶电泳
首先配制浓度为1％的琼脂糖凝胶，待凝胶凝固(约20min)后，将pcr产物点入凝胶孔中，凝胶电泳约15min后，在凝胶成像仪中观察电泳结果。
6.结果判断
根据琼脂糖凝胶电泳，如果有电泳条带则为雄性，没有电泳条带则为雌性。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明根据m型线粒体coii基因在雌雄性腺中的表达特异性来进行性别鉴定，直接通过电泳条带有无来判断性别，结果简单直观。另外，与之前的分子标记试剂盒相比，该发明使用的是dna样本，对样本的要求不高，通过凝胶电泳来判断更加快速简单，无需后续的测序结果，大大缩短检测时间，从而提高了检测效率。
附图说明
图1为本发明的实施例1中4月龄三角帆蚌性腺中m型coii基因的检测图。
图2为本发明的实施例1中5月龄三角帆蚌性腺中m型coii基因的检测图。
图3为本发明的实施例2中二龄三角帆蚌性腺中m型coii基因的检测图。
具体实施方式
本发明提供了一种三角帆蚌性别的鉴定方法。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
本实施例的幼龄三角帆蚌性别的鉴定方法包括如下步骤：
1.样本采集
随机选取4月龄和5月龄三角帆蚌各20只，使用不同套的镊子和剪刀等取样工具避免交叉污染，采取少量性腺放入1.5ml灭菌离心管中，快速置于液氮中速冻，采样结束后直接用于dna提取。
2.dna提取和浓度测定
(1)、加入500μl苯酚，上下颠倒8min，6℃，11000r/min离心10min。
(2)、吸取上清液，加入体积比为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇，上下颠倒8min，6℃，11000r/min离心10min。
(3)、吸取上清液，加入体积比为24:1的氯仿：异戊醇，上下颠倒8min，6℃，11000r/min离心10min。
(4)、吸取上清液，加入2倍体积的冰乙醇(-20℃)，低温(-20℃)静置30min，6℃，10000r/min离心6min。
(5)、弃上清液，用体积分数为70％冰乙醇(-20℃)洗涤1-2次(6℃，10000r/min离心5min)，将沉淀物放置在无菌操作台内干燥15min。
(6)、根据所得沉淀量加入50-100μl的ddh2o溶解dna，4℃放置过夜溶解。
(7)、采用nanodroop2000测定浓度和纯度，之后将浓度稀释至100ng/μl左右。
3.pcr扩增
取dna模板为1μl，正向引物f1和反向引物r1各1μl，2×taq-mix酶(天根公司)为12.5μl，ddh2o为9.5μl。pcr的扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。pcr产物经浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测条带。
4.结果
图1和图2是对4月龄和5月龄的三角帆蚌的性腺组织检测结果。有电泳条带的代表雄性，没有电泳条带的代表雌性。结果显示4月龄中雄性11只，雌性9只。5月龄三角帆蚌中雄性14只，雌性6只。后续对这两批样本进行标记和继续养殖，在它们性腺发育成熟后，在繁殖期时取性腺液体在显微镜下进行精子或者卵子观察，结果与上述实验结果一致，检测的成功率达到100％。
实施例2：
本实施例的成熟三角帆蚌性别的鉴定方法包括如下步骤：
1.样本采集
随机选取二龄三角帆蚌44只，使用不同套的镊子和剪刀等取样工具避免交叉污染，采取少量性腺放入1.5ml灭菌离心管中，快速置于液氮中速冻，采样结束后直接用于dna提取。
2.dna提取和浓度测定
(1)、加入500μl苯酚，上下颠倒8min，6℃，11000r/min离心10min。
(2)、吸取上清液，加入体积比为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇，上下颠倒8min，6℃，11000r/min离心10min。
(3)、吸取上清液，加入体积比为24:1的氯仿：异戊醇，上下颠倒8min，6℃，11000r/min离心10min。
(4)、吸取上清液，加入2倍体积的冰乙醇(-20℃)，低温(-20℃)静置30min，6℃，10000r/min离心6min。
(5)、弃上清液，用体积分数为70％冰乙醇(-20℃)洗涤1-2次(6℃，10000r/min离心5min)，将沉淀物放置在无菌操作台内干燥15min。
(6)、根据所得沉淀量加入50-100μl的ddh2o溶解dna，4℃放置过夜溶解。
(7)、采用nanodroop2000测定浓度和纯度，之后将浓度稀释至100ng/μl左右。
3.pcr扩增
取dna模板为1μl，正向引物f1和反向引物r1各1μl，2×taq-mix酶(天根公司)为12.5μl，ddh2o为9.5μl。pcr的扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。pcr产物经浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测条带。
4.结果
图3是对二龄的三角帆蚌性腺组织检测结果。结果显示，在44只蚌中有雄性21只，雌性23只。在显微镜下观察性腺组织中的精子或卵子，结果与上述实验结果一致，检测的成功率达到100％。
上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>上海海洋大学
<120>三角帆蚌性别的鉴定方法
<141>2020-12-04
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>19
<212>dna
<213>人工序列()
<400>1
ctaactataccgatgcctt19
<210>2
<211>20
<212>dna
<213>人工序列()
<400>2
atgagcttatggggtcaaat20
1.一种三角帆蚌性别的鉴定方法，其特征在于：其包括如下步骤：
(1)、剪取三角帆蚌的性腺组织放入灭菌离心管中，加入裂解液使其裂解；在55℃下裂解3-4h至澄清，过程中每0.5-1h翻转摇动一次；
(2)、加入苯酚，上下颠倒，离心；吸取上清液，加入体积比为25:24:1的苯酚：氯仿：异戊醇，上下颠倒，离心；吸取上清液，加入体积比为24:1的氯仿：异戊醇，上下颠倒，离心；吸取上清液，加入冰乙醇，低温静置30min，离心；弃上清液，用冰乙醇洗涤，离心，并将沉淀物在无菌环境下干燥；
(3)、在干燥后的沉淀物中加入双蒸水溶解dna，4℃放置过夜溶解；测定浓度和纯度，浓度测定完成后加入双蒸水调节浓度；
(4)、以dna为模板，设计引物进行pcr扩增；
(5)、配制琼脂糖凝胶，待凝胶凝固后，将pcr产物点入凝胶孔中，观察电泳结果。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述裂解液的成分包括双蒸水、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸二钠、癸二酸二酰肼和蛋白酶k。
3.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中，所述颠倒的时间均为8±0.1min；所述离心的转速均为11000±100r/min，时间均为5-10min，温度均为6±0.1℃。
4.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(4)中，所述引物中正向引物序列为：seqidno.1，反向引物序列为：seqidno.2。
5.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(4)中，所述pcr扩增的体系为：dna模板为1μl，正向引物和反向引物各为1μl，2×taq-mix酶为12.5μl，最后用ddh2o补足至25μl。
6.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(4)中，所述pcr扩增的条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸5min。
7.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于：步骤(5)中，所述电泳结果为：如果有电泳条带则为雄性，没有电泳条带则为雌性。
技术总结