本发明属于生物学领域，涉及转基因生物检测领域，具体涉及一种数字pcr检测转基因溶菌酶羊品系特异性的引物、探针和方法，尤其涉及一种转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr引物及基于该引物的检测方法。
背景技术：
转基因技术是利用基因重组,转化等技术将人工分离和修饰过的dna将特定的外源基因整合到生物体基因组当中,使其产生定向的遗传改变,并能够稳定遗传给下一代。伴随着转基因技术不断地发展和生物生产的需求,转基因动物研究已经进入成熟的产业化阶段,相继获得了转基因小鼠、猪、山羊、牛等转基因动物。转基因动物日益增多的同时,相应安全性问题引发国际社会及相关监管部门的重视。
我国政府高度重视转基因生物安全的管理,已经颁布了《农业转基因生物安全管理条例》等系列法规,约束和限制转基因产品的检测和标识。目前对转基因植物的监管已经非常完备,对转基因动物的安全性评价研究主要集中在动物自身生长繁殖健康问题等方面,对环境安全评价却寥寥无几。
2006年3月19日,国家专利局批准了转基因溶菌酶奶羊专利。作为乳反应发生器,这种奶羊能够产出含有高浓度溶菌酶的羊奶。溶菌酶是天然的蛋白质,能够水解细菌细胞壁中的糖苷键,具有溶菌作用。常用于杀菌,防腐,乳品添加剂,治疗炎症和肿瘤等领域。目前，尚未任何关于对转基因溶菌酶羊品系检测的方法。为了有效实现对转基因溶菌酶羊品系的检测和监测，本研究针对转基因溶菌酶羊的品系特异性序列并对引物、探针及扩增体系进行优化，建立了基于转基因溶菌酶羊品系特异性的微滴数字pcr(dropletdigitalpcr)检测方法，并应用于转基因羊及其制品检测，如羊奶、羊奶制品、羊粪便等。
微滴数字pcr技术的原理是将样本dna无限稀释到上千或者上万份，被分配到不同的单元里,每个单元最多含有1个dna分子，形成油包水液滴。每个反应单元经过独立pcr扩增,反应结束后统计每个单元的荧光信号，根据泊松分布和阳性微滴比例来实现核酸分子的绝对定量，计算原始样本中靶基因的拷贝数。数字pcr技术相比较于传统的荧光定量pcr技术和常规pcr方法相比，存在明显的优势:绝对定量，不依赖标准曲线，样本需求量低，可检测低浓度样本；灵敏度高，可检测出低拷贝痕量样本以及精确分析极小目的片段差异；高度耐受抑制剂,能够降低反应体系中的噪音和抑制物对反应的干扰等。在对转基因溶菌酶羊品系的监管中，主要的监管对象是转基因动物本身和其生产的产品，如羊奶、羊奶制品等，针对这些制品的检测，目前的荧光定量pcr技术存在灵敏度低、依赖标准物质等缺点。
因此,本发明提供了一种基于微滴数字pcr检测技术，能够快速、准确检测转基因溶菌酶羊品系特异性的方法，实现对于转基因羊及其制品的检测，摆脱标准物质的依赖。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr引物及基于该引物的检测方法，能够快速准确检测转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr检测方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供了一种转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr引物，包括正向引物gm-lyz-5-f和反向引物gm-lyz-5-r，所述正向引物gm-lyz-5-f的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述反向引物gm-lyz-5-r的核苷酸序列如seqidno.2所示。
本发明引物的设计需要针对转化体特异性的序列，该序列由羊基因组和外源基因序列两部分组成，设计的引物和探针需要分别位于特定的位置进行设计，从而得到本发明的引物对。
第二方面，本发明提供了一种转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr检测的pcr反应体系，包括前述的引物。
优选地，所述检测系统还包括探针gm-lyz-5-p，所述探针的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述探针的5’端包含有荧光报告基团，3’端包含有荧光淬灭基团。
第三方面，本发明提供了一种基于前述反应体系的转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr检测方法，包括以下步骤：
a、配制pcr反应体系：每20ul反应体系中，包括：10μl数字pcr预混液,1μl正向引物gm-lyz-5-f,1μl反向引物gm-lyz-5-r,0.5μl探针gm-lyz-5-p,5.5μlh20,2μl待检测转基因羊的dna稀释液；
b、进行pcr扩增，程序如下：step1:95℃5min；step2:95℃30sec,58℃1min,gotostep2,39x；98℃10min；ramp2.5℃/s；4℃1min,ramp2.5℃/s。
优选地,步骤a的反应体系中，所述正向引物、反向引物的浓度为10ng/ul，引物探针比为1:0.5。
优选地，所述待检测转基因羊的dna稀释液的浓度为10-20ng/ul。
优选地，所述待检测转基因羊的dna稀释液的样本来源为血液样本、细胞样本、组织样本、环境样本中的任一种。
优选地，步骤b中，所述扩增产物的长度为80-180bp。
优选地，所述扩增产物的长度为90-110bp。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明相比传统的qpcr技术具有灵敏度高,特异性强,精确度好,以及不依赖标准曲线绝对定量的优势,特别在对低拷贝数和痕量样本具有重要意义。
2、本发明中所述的引物设计为特异性引物，来自转基因溶菌酶羊品系特异性序列，即旁侧序列,根据山羊和溶菌酶基因的整合位点设计。其中上游引物和探针位于外源基因溶菌酶基因序列，下游引物位于山羊基因组序列上。
3、本发明中引物的确定是依照引物设计原则，通过分析选出5对引物，逐个验证后选取最优引物序列。
4、本发明在引物浓度，探针浓度，反应温度进行了优化，目前是最优的方法。
5、本发明首次提出了对转基因溶菌酶羊品系特异性的检测，能够对转基因溶菌酶羊进行市场监管。
6、本方法对于转基因羊的常规监管和检测提供技术依据,对于科研单位和高校的转基因羊研究同样适用,有广泛的潜在应用前景。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为实施例1中的转基因溶菌酶羊品系特异性微滴数字pcr一维扩增图；
图2为实施例1中的非转基因羊特异性微滴数字pcr一维扩增图；
图3为实施例1中的转基因乳清蛋白羊特异性微滴数字pcr一维扩增图；
图4为实施例1中的转基因阮病毒敲除羊特异性微滴数字pcr一维扩增图；
图5为实施例1中的转基因乳铁蛋白羊特异性微滴数字pcr一维扩增图；
图6为实施例1中的阴性对照微滴数字pcr一维扩增图；
图7为实施例2中的灵敏度分析结果图；
图8为实施例3中的f2代转基因溶菌酶羊特异性微滴数字pcr一维扩增图；
图9为实施例3中的f3代转基因溶菌酶羊特异性微滴数字pcr一维扩增图；
图10为实施例3中的f4代转基因溶菌酶羊特异性微滴数字pcr一维扩增图；
图11为实施例3中的f5代转基因溶菌酶羊特异性微滴数字pcr一维扩增图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
下列实施实例中，具体实验条件按照本领域内参考文献或者试剂盒使用说明书进行,所用仪器和耗材,若无特别说明生产厂家者,可根据自身实验室条件按市售渠道获得。
本发明人通过将转基因溶菌酶羊的特异性旁侧序列进行比对和分析,经过大量引物的筛选和实验样本的验证,得到了溶菌酶羊的品系特异性引物和探针。具体地,本发明利用了溶菌酶的外源基因序列和品系特异性序列,利用微滴数字pcr的方法,鉴定转基因溶菌酶羊的品系特异性。
实施实例1:转基因溶菌酶羊品系特异性检测
本实施例采用的实验试剂和仪器如下：
仪器：qx200dropletdigitalpcr(bio-rad)系统：qx200微滴生成仪，qx200微滴分析仪，pcr仪；96孔板热封仪，涡旋震荡仪，
耗材：数字pcr预混液，微滴生成卡，皮套，微滴发生油，微滴读取油，96孔反应板，封口膜均购自bio-rad。
1.引物设计与合成。
特异性引物为转基因溶菌酶羊的品系特异性序列,即旁侧序列,根据山羊和溶菌酶基因的整合位点设计。设计软件为beacondesigner8。针对转基因溶菌酶羊品系特异性检测要求，根据该转基因溶菌酶羊外源基因插入片段的序列及5'端(rb)和3'端(lb)的侧翼序列信息。依照引物设计原则，综合考虑核苷酸序列gc含量和引物tm值，在转基因溶菌酶羊5′端旁侧序列上设计了上游引物5条(分别命名为q-gm-lyz-5-f1—q-gm-lyz-5-f5)(表1)；探针序列5条(分别命名为q-gm-lyz-5-p1—q-gm-lyz-5-p5)(表1)，在山羊基因组序列上设计下游引物5条，(分别命名为q-gm-lyz-5-r1—q-gm-lyz-5-r5)(表1)。合成以下引物和探针,并稀释到工作浓度10ng/ul。所设计引物经定性pcr初步筛选，选择目标产物片段在80-120bp，目标条带单一引物。引物工作后，再合成探针，经定量pcr逐一验证引物和探针组合是否工作。经优化获得最佳的引物探针组合。
表1.转基因溶菌酶羊引物和探针序列
2.dna提取
取非转基因羊,转基因溶菌酶羊,转基因乳清蛋白羊,转基因阮病毒敲除羊,转基因乳铁蛋白羊血液，各200ul，按“血液/细胞/组织基因组dna提取试剂盒”说明书提取dna并稀释到20ng/ul。
3.定性pcr反应，筛选引物工作效率。
以转基因溶菌酶羊，非转基因羊的dna为模板，应用常规pcr反应体系和条件，(94℃5min；94℃30s,58℃30s，72℃30s，30cycles；72℃延伸7min；4℃1min)进行引物的验证。结果表明，gm-lyz-5-f1和gm-lyz-5-r1引物扩增产物条带单一。其他引物的扩增出现多条扩增条带，特异性不好，位置不对，或者引物二聚体过多等原因，无法使用。
4.数字pcr反应，转化体特异性测试。
4.1优化反应条件和反应程序。
以非转基因羊,转基因溶菌酶羊,转基因乳清蛋白羊,转基因阮病毒敲除羊,转基因乳铁蛋白羊血液为dna模板，选择引物退火温度和引物浓度作为两个关键参数进行正交实验，得到结果后再进行引物和探针比的优化。分别配置引物浓度为10ng/ul，50ng/ul,100ng/ul,的引物(gm-lyz-5-f1/r1)和探针(fam-gm-lyz-5-p1-bq1)；设置56℃、57℃、58℃和59℃4个退火温度；引物探针比分别配置为：1：1，1：0.2，1：0.4，1：0.5，1：0.6，1：0.8，6个梯度进行体系优化；10ulddpcrsupermix(ddpcr预混液)2uldna,h2o补齐共20ul体系,离心30秒,将加样过程中黏贴在离心管外壁上的液滴流下，再低速涡旋震荡混匀30秒,再离心30秒。每个反应条件做3次重复，每次做4个平行样品。
4.2.生成微滴。将配置好的体系用20ul量程的移液器缓慢加入微滴生成卡中sample位置，不可有气泡；再利用多道移液器将微滴发生油70ul/每孔加入到微滴生成卡中oil位置，其中，二者加样顺序不可颠倒。盖上胶皮带，将微滴生成卡放入微滴发生器内，生成油包水微滴。每个微滴生成卡可同时产生8x20000个油包水微滴，即同时可检测8个样本，样本剩余的孔需要用平衡液补齐。
本次实验样本除非转基因羊,转基因溶菌酶羊,转基因乳清蛋白羊,转基因阮病毒敲除羊,转基因乳铁蛋白羊血液的dna外，阴性对照为超纯水。
4.3.微滴pcr扩增。用多通道移液器缓慢转移微滴至96孔反应板中，热封膜密封。放入微滴pcr仪进行2小时左右的微滴pcr。优化反应条件为：step1:95℃5min；step2:95℃30sec,56℃～591min,gotostep2,39x。98℃10min。ramp2.5℃/s；4℃1min,ramp2.5℃/s。
4.4.微滴信号检测。取出96孔反应板，放置到微滴分析仪中，微滴将逐个分析每个样品孔内的液滴。微滴被吸入以后，管路将分解乳化后的微滴，使他们逐一通过双色光学检测系统。系统将计算阴性和阳性微滴的个数。以数字的格式对靶dna进行绝对定量的分析。
4.5.分析检测结果。根据阳性和阴性微滴的数目直观读取每个样品的扩增结果。
4.6.结果分析。
在结果判定的过程中，如果仅有阳性微滴没有阴性微滴，考虑样本为浓度过高，稀释样本到合适浓度重复实验即可。如果仅有阴性微滴没有阳性微滴，判定样本中不含有溶菌酶羊转化体。
本次结果显示，引物探针组合gm-lyz-5-f1/r1，fam-gm-lyz-5-p-bq1在不同的引物浓度和退火温度处理中均表现出非常好的扩增特异性。且引物浓度为10ng/ul,引物探针比为1：0.5时，不同的退火温度时均表现一致的扩增效率，且扩增条带清晰，单一。根据引物特异性扩增结果稳定性和检测需要，反应体系中的引物终浓度确定为10ng/ul,反应程序中的退火温度设定为58℃。
本次实验结果图1显示，用引物q-gm-lyz-5-f1/r1和探针fam-q-gm-lyz-5-p1-bq1在扩增时，仅转基因溶菌酶羊有阳性微滴生成，且反应孔的阳性微滴信号和阴性微滴信号区分明显。图2-图6显示非转基因羊,转基因乳清蛋白羊,转基因阮病毒敲除羊,转基因乳铁蛋白羊样本，阴性对照，均仅有阴性微滴无阳性微滴生成。说明该方法经过引物的筛选后得到一对能够用于转基因溶菌酶羊检测的特异性引物。且使用该方法，采用3家单位进行协同验证，经过平行实验验证，结果一样。说明该引物特异性良好，本发明结果稳定。
实施实例2:转基因溶菌酶羊品系灵敏度检测
1.血液dna样本提取，引物合成，仪器耗材选用均参照实施实例1。
2.将转基因溶菌酶羊的血液梯度稀释：20000copy/ul，2000copy/ul，200copy/ul，100copy/ul，50copy/ul，25copy/ul，10copy/ul，5copy/ul
3.体系配置，微滴生成，pcr程序设置，微滴读取，参考实施实例1。
4.结果见图7和表2，从其结果可知本方法的lod和loq均为50copy/ul。说明本方法的灵敏度为50copy/ul。使用该方法，采用3家单位进行协同验证，经过平行实验验证，结果一样。说明该发明灵敏度良好，实验结果稳定。
表2
实施实例3:转基因溶菌酶羊品系实际样品验证
1.选取已知转基因溶菌酶羊不同代系的血液样本：f2,f3,f4,f5。提取dna方法，引物合成，仪器耗材选用均参照实施实例1。
2.将已知转基因溶菌酶羊不同代系的血液梯度稀释到20copy/ul。
3.体系配置，微滴生成，pcr程序设置，微滴读取，参考实例1。
4.结果见图8-图11，分别为f2,f3,f4,f5的转基因溶菌酶羊扩增结果图,每个代系均发生了阳性扩增，且阴性微滴和阳性微滴信号区分明显。验证了该引物的品系特异性。使用该方法，采用3家单位进行协同验证，经过平行实验验证，结果一样。说明该发明经过实际样品检测，效果良好，实验结果稳定。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110>上海交通大学
<120>转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr引物及基于该引物的检测方法
<130>dd11300
<160>15
<170>siposequencelisting1.0
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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catgctcctgataaattagttccc24
1.一种转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr引物，其特征在于，包括正向引物gm-lyz-5-f和反向引物gm-lyz-5-r，所述正向引物gm-lyz-5-f的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述反向引物gm-lyz-5-r的核苷酸序列如seqidno.2所示。
2.一种转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr检测的pcr反应体系，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求1所述的转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr的pcr反应体系，其特征在于，所述检测系统还包括探针gm-lyz-5-p，所述探针的核苷酸序列如seqidno.3所示；所述探针的5’端包含有荧光报告基团，3’端包含有荧光淬灭基团。
4.一种基于权利要求2或3所述反应体系的转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、配制pcr反应体系：每20ul反应体系中，包括：10μl数字pcr预混液,1μl正向引物gm-lyz-5-f,1μl反向引物gm-lyz-5-r,0.5μl探针gm-lyz-5-p,5.5μlh20,2μl待检测转基因羊的dna稀释液；
b、通过微滴生成器生成油包水微滴后，进行pcr扩增，程序如下：step1:95℃5min；step2:95℃30sec,58℃1min,gotostep2,39x；98℃10min；ramp2.5℃/s；4℃1min,ramp2.5℃/s；
c、扩增结束后识别含扩增产物的微滴的荧光信号并得出计数结果。
5.根据权利要求4所述的转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr检测方法，其特征在于，步骤a的反应体系中，所述正向引物、反向引物的浓度为10ng/ul，引物探针比为1:0.5。
6.根据权利要求4所述的转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr检测方法，其特征在于，所述待检测转基因羊的dna稀释液的浓度为10-20ng/ul。
7.根据权利要求4所述的转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr检测方法，其特征在于，所述待检测转基因羊的dna稀释液的样本来源为血液样本、细胞样本、组织样本、环境样本中的任一种。
8.根据权利要求4所述的转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr检测方法，其特征在于，步骤b中，所述扩增产物的长度为80-180bp。
9.根据权利要求8所述的转基因溶菌酶羊品系特异性微滴式数字pcr检测方法，其特征在于，所述扩增产物的长度为90-110bp。
技术总结