本发明涉及分子生物学检测领域，特别涉及黄牛、水牛和牦牛的实时荧光pcr检测试剂和检测方法。
背景技术：
在经济利益驱动下的肉制品制假贩假事件屡禁不绝，已成为中国食品质量控制面临的重要挑战之一。牛肉一直是制假掺假的重灾区，除了用价格相对廉的猪肉、鸡肉、鸭肉冒充牛肉外，更有甚者将狐狸、水貂等肉掺入牛肉中进行销售。此外，由于牛肉本身可分为黄牛(bostaurus)肉、水牛(bubalusbubalis)肉和牦牛(bosgrunniens)肉，且这3类肉之间也存在价格差异，一般来说牦牛肉价格高于黄牛肉，黄牛肉又高于水牛肉，因此往往会出现水牛肉、黄牛肉被用来冒充牦牛肉，而水牛肉还被用来冒充黄牛肉。
为此，近年来，国家针对肉制品掺假问题加强检测监管力度，大力支持肉品检测方法的研究。目前对肉类真伪鉴别的检测技术中分子生物学的鉴定方法，仍是目前比较常用和可靠的鉴定方法。
目前用来鉴别牛肉真伪的qpcr方法已经较多，且建立一系列检测标准，如《sn/t2051-2008食品、化妆品和饲料中牛羊猪源性成分检测方法实时pcr法》，《gb/t25165-2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光pcr法》、《sn/t2557-2010畜肉食品中牛成分定性检测方法实时荧光pcr法》、《sb/t10923-2012肉及肉制品中动物源性成分的测定实时荧光pcr法》等，但上述标准并不能区分是哪种牛。虽然目前也有有关黄牛、水牛和牦牛的检测方法，如《szdb/z268-2017动物产品及饲料中黄牛、水牛和牦牛源性成分实时荧光pcr检测方法》，《sn/t3730.7-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第7部分:水牛成分检测实时荧光pcr法》，但上述方法存在灵敏度不高，或者覆盖度不高，即存在不能检测到种内某些品种的情况。《sn/t4397-2015出口食品中牦牛源性成分的检测方法实时荧光pcr法》该方法的检测灵敏度和准确度都较高，但该方法的引物探针最佳退火温度是57℃，
技术实现要素：
本发明提供了一种对可对混合含有黄牛、水牛和牦牛肉进行同步鉴定的方法，可用于肉制品的真伪鉴别。
为了实现上述目的，本发明提供了一种对黄牛、水牛及牦牛混合样品的同步物种成分检测的引物和探针，其中，
检测黄牛的引物和探针序列包括：
f:cccgtcaccctcctcaaata
r:cacactttccagtatgcttacct
p:cgcactagctacatgagagga；
检测水牛的引物和探针序列包括：
f:caacggccagcataatcgaa
r:gctttgggtgttggtagtgg
p:aacaaccaacctccccaaga；
检测牦牛的引物和探针序列包括：
f:cccgtcaccctcctcaaata
r:cacactttccagtatgcttacct
p:cgcactagctatatgagagga。
进一步的，所述探针选自taqman探针。
进一步的，所述检测黄牛的探针包括：
p:fam-cgcactagctacatgagagga-eclipse；
进一步的，所述检测水牛探针包括：
p:hex-aacaaccaacctccccaaga-eclipse；
进一步的，所述检测牦牛的探针包括：
p:rox-cgcactagctatatgagagga-eclipse。
本发明还提供了一种对黄牛、水牛及牦牛混合样品的同步物种成分检测的实时荧光pcr检测方法，包括：
步骤1：抽提样本中的dna；
步骤2：将步骤1中的dna样品加入至pcr反应体系中，按预先设定的反应程序进行反应；
步骤3：结果判定；
进一步的，本发明采用以下技术方案：
取动物肌肉、骨骼、内脏或血液100mg或100μl，使用promegaff3750(美国)抽提试剂盒进行dna提取，最后抽提得到dna溶解在20μl-100μl水中，使抽提得到的dna浓度大于等于10ng/μl。
单重实时荧光pcr反应体系及结果判定。总体积为20μl的反应体系中，成分如下：10μlpremixextaq，上游引物(10pmol/μl)0.4μl，下游引物(10pmol/μl)0.4μl，探针(10pmol/μl)0.4μl，dna用量2μl，不足的体积用水补足。应用实时荧光pcr仪lightcycle480(roche)进行反应，反应程序为(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：ct值小于35时，结果为阳性，ct值大于等于35时为阴性。
双重实时荧光pcr反应体系及结果判定。双重荧光qpcr的20μl的反应体系中，在引物探针的总浓度不变的情况下，将任意两种物种的引物和探针的含量比例调整为1:1，其他条件不变。反应程序为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：ct值小于35时，结果为阳性，ct值大于等于35时为阴性。
三重实时荧光pcr反应体系及结果判定。三重荧光qpcr的20μl的反应体系中，在引物探针的终浓度不变的情况下，将当黄牛、水牛、牦牛三组引物探针的含量比例调节为3:3:2，其他条件不变。反应程序为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：ct值小于35时，结果为阳性，ct值大于等于35时为阴性。
进一步的，本发明所述方法中的引物和探针选自表1所列引物和探针。
本发明还提供了一种对可对混合含有黄牛、水牛和牦牛肉进行同步鉴定的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括表1所述的引物和探针。
进一步的，所述试剂盒还包括作为内参照引物探针。
本发明与现有技术以及背景技术中提及的方法相比，具有以下优点：基于黄牛、牦牛线粒体12srrna基因(12sribosomalrna，基因序列号分别为：kf926377.1和kj463418.1)，和水牛的线粒体cytb基因(cytochromeb，基因序列号分别为：ay488491.1)设计了黄牛、水牛和牦牛特异性的引物探针各1组。建立了单重、双重和三重检测方法，实现以real-timepcr为手段的黄牛、水牛和牦牛的快速同步鉴定方案。可同步检测上述3种牛的成分，实现对黄牛、水牛及牦牛混合样品的同步物种成分检测。实验证明检测灵敏度高，且有很高的覆盖度。单重检测时，3种牛的检测灵敏度均为0.025ng/μl；双重检测时，两两组合的引物探针含量比例为1:1时，黄牛的检测灵敏度降低至0.1ng/μl，而水牛和牦牛仍为0.025ng/μl；对三重qpcr检测体系进行了优化，当黄牛、水牛和牦牛三组引物探针的含量比例为3:3:2时，检测灵敏度最佳，黄牛和水牛的检测灵敏度可达到0.1ng/μl，而牦牛的灵敏度仍可达到0.025ng/μl。
本发明不仅适用于单重实时荧光pcr反应体系、还适用于双重实时荧光pcr反应体系和单三重实时荧光pcr反应体系。有效提高了肉制品掺假问题的检测准确定和检测效率。
附图说明
图1为dna浓度和ct值相关性曲线。其中图1a为黄牛(dna浓度≥0.024ng/μl)的相关性曲线；图1b为黄牛(dna浓度≥0.006ng/μl)的相关性曲线；图1c为水牛(dna浓度≥0.024ng/μl)的相关性曲线；图1d为牦牛(dna浓度≥0.024ng/μl)的相关性曲线；图1e为牦牛(dna浓度≥0.006ng/μl)的相关性曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。但并不因此将本发明限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。
实施实例1：样本dna提取，以及实时荧光pcr反应体系和结果判定
取动物肌肉、骨骼、内脏、血液或者植物可食用部分(样品见表2)100mg或100μl，使用promegaff3750(美国)抽提试剂盒进行dna提取，最后抽提得到dna溶解在20μl-100μl水中，可根据实际对dna浓度的需求进行调节。
单重实时荧光pcr反应体系及结果判定。总体积为20μl的反应体系中，成分如下：10μlpremixextaq，上游引物(10pmol/μl)0.4μl，下游引物(10pmol/μl)0.4μl，探针(10pmol/μl)0.4μl，dna用量2μl，不足的体积用水补足。应用实时荧光pcr仪lightcycle480(roche)进行反应，反应程序为(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：ct值小于35时，结果为阳性，ct值大于等于35时为阴性。
双重实时荧光pcr反应体系及结果判定。双重荧光qpcr的20μl的反应体系中，在引物探针的总浓度不变的情况下，将任意两种物种的引物和探针的含量比例调整为1:1，其他条件不变。反应程序为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：ct值小于35时，结果为阳性，ct值大于等于35时为阴性。
三重实时荧光pcr反应体系及结果判定。三重荧光qpcr的20μl的反应体系中，在引物探针的终浓度不变的情况下，将当黄牛、水牛、牦牛三组引物探针的含量比例调节为3:3:2，其他条件不变。反应程序为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。结果判定：ct值小于35时，结果为阳性，ct值大于等于35时为阴性。
实施实例2：引物和探针的设计和特异性验证
基于黄牛、牦牛线粒体12srrna基因(12sribosomalrna，基因序列号分别为：kf926377.1和kj463418.1)，和水牛的线粒体cytb基因(cytochromeb，基因序列号为：ay488491.1)，设计得到如表1所示的黄牛、水牛和牦牛特异性的引物和探针，并在探针上标记了荧光信号，以实现实时荧光检测。
表1检测黄牛、牦牛和水牛的引物和探针序列
af:正向引物；r:反向引物；p:探针。
b引用自国标gb/t25165-2010；该引物探针可作为内参照引物探针,检验所抽提dna的质量。
将表1所示的用于检测3种牛的引物探针用于检测包括黄牛、水牛和牦牛在内的19种家畜、家禽及其他动植物。并按实施例1的实时荧光pcr反应体系进行反应和结果判定。
结果显示上述引物探针只对目标物种呈阳性反应，其他非目标物种均未检测到ct值(表2)；而同时用检测真核生物的引物探针检测时，反应都呈阳性，说明抽提得到的dna质量符合qpcr检测要求。在单重qpcr检测体系中，以单一的目标dna为检测样本，设计得到的引物探针序列有较好的特异性。
表2黄牛水牛牦牛引物探针的特异性
“—”表示3次检测结果中2次或2次以上无ct值显示.
实施实例3：单重qpcr的检测灵敏度
将3种牛的dna浓度都调节到25ng/μl左右，再进行4倍稀释，共形成8个浓度梯度。各个dna浓度单重qpcr的结果如表3所示，当3种dna的浓度稀释到0.025ng/μl时，3种牛的检测都能得到ct值小于35且阳性明显的s型扩增曲线，此时得到3组标准曲线的r2值均大于0.99(图1a，c，d)；但进一步稀释后(0.006ng/μl)，黄牛和牦牛得到的ct值分别为38.4和38.8，而水牛则无ct值显示，此时黄牛和牦牛的标准曲线的r2值分别降至0.9826(图1b)和0.9597(图1e)；dna浓度降至0.002ng/μl左右时，则3种牛的检测结果都呈阴性。
r2值大于0.99时，说明该标准曲线所取范围内的dna浓度与检测得到的ct值有较好的对应关系，ct值能比较准确的反应对应dna的浓度；r2值下降，说明两者间的对应关系下降，ct值反应对应dna的浓度的可信度下降。因此，3种牛在单重，以及在双重及三重荧光pcr检测中，以35为ct值的临界值，3次检测结果中2次或2次以上ct值小于35，结果为阳性( )；2次或2次以上ct值大于等于35或无ct值显示，结果为阴性(—)。
表3单重实时荧光pcr检测黄牛水牛牦牛的灵敏度
*检测黄牛时，不同稀释度的dna只含黄牛dna，以此类推；
**用nanodropnd-1000实际测得的浓度；
***4倍梯度稀释推算得到的浓度；
—:3次检测结果中2次或2次以上无ct值显示.
实施实例4：双重和三重qpcr的检测灵敏度
在双重qpcr的检测中，将任意两种引物探针组合按照1:1比例混合，得到结果显示：只有黄牛的检测因为试剂间及两种dna间的叠加而导致其灵敏度降低至0.1ng/μl，而水牛和牦牛的检测灵敏度仍保持在单重qpcr的水平(0.025ng/μl)，并未下降(表4)。
但双重变成三重qpcr后，结果则大不相同，即便是在最高的起始浓度下(25ng/μl)，黄牛和水牛的检测都未得到阳性结果，但牦牛的检测灵敏度仍然保持在0.025ng/μl的浓度水平，未受到三重的影响。
为了提高三重qpcr检测中黄牛和水牛的检测灵敏度，调整了3种引物探针组合的浓度比例。比较了8种混合比例，提高黄牛和水牛的引物探针比例有助于提高检测灵敏度，表5显示，当黄牛、水牛、牦牛三组引物探针的比例调节为3:3:2时，黄牛和水牛的检测灵敏度可达到0.1ng/μl，而牦牛的灵敏度仍可达到0.025ng/μl，因此认为该比例较佳。
表4双重和三重实时荧光pcr同步检测黄牛、水牛及牦牛
adna浓度，在双重和三重qpcr反应中，对应目标物种目标浓度的dna都加入1μl，即在检测黄牛和水牛的双重qpcr反应体系中只加入1μl黄牛和1μl水牛的dna，三重qpcr中则黄牛、水牛和牦牛各加入1μl；在双重qpcr和三重qpcr中，各物种引物探针组合的比例为1:1和1:1:1；
b黄牛；c水牛；d牦牛；
:3次检测结果中2次或2次以上ct值小于35；
－:3次检测结果中2次或2次以上ct值大于等于35或无ct值显示。
表5黄牛、水牛和牦牛三重荧光qpcr检测体系优化
adna浓度,即在三重qpcr中对应浓度的黄牛、水牛和牦牛的dna各加入1μl；b在三重qpcr中，各物种引物探针组合的比例；
:3次检测结果中2次或2次以上ct值小于35；
－:3次检测结果中2次或2次以上ct值大于等于35或无ct值显示。
实施例5：不同检测方法对3种牛肉混合样品检测结果的比较
深加工混合样的制备及混合物的dna抽提：以黄牛、水牛和牦牛肉的肉干为材料，制备深加工混合样，按照表6的比例混合，每个混合样总重30g，共制成7个样。按照比例混合后的样品经过震荡研磨仪(precellysevolution，bertin)充分混合研磨成肉泥，加入dna提取裂解液(dneasynericonfoodkit，qiagen)，使混合物降解成液状，取降解后混合物2ml，继续进行dna抽提(dneasynericonfoodkit，qiagen)。抽提后的dna用以下方法进行检测。
检测方法：
方法1：即本发明的方法,但针对表6的混合样，只采用了双重和三重real-timepcr方法进行检测。每个混合样，用每种方法重复检测3次，3次结果中两次显示为阳性，即3次结果中两次的ct值小于35即为阳性，以“ ”表示，说明能检测到该混合肉样中黄牛、水牛或牦牛成分，否则以“—”表示，说明不能检测到相应成分。
方法2：参照专利cn107858442a，即应用高分辨率熔解曲线(hrm)法。检测结束后，通过软件分析扩增产物与阳性对照是否一致，即分析样品的熔解曲线是否与阳性对照一致。若与黄牛的熔解曲线一致则含有黄牛成分，以此类推。每一个样品重复检测3次，若两次和对应阳性对照一致，则表示检测到该成分，用“ ”表示，否则为阴性，用“—”。
方法3：参照专利cn109457015a，即环介导等温扩增技术(lamp法)。该方法与三重qpcr及hrm法比较，一个检测孔只能检测一种牛成分，一个样品若要检测三种牛成分的话，即需要3个检测孔，这和本发明方法中的单重qpcr类似。
为避免由于使用不同dna造成不同检测方法的不同结果，一次重复中所有方法的使用相同的dna。
检测结果:
方法1：如表6所示，样品1-7所有检测得到的ct值均小于35，因此检测结果皆为阳性。因此本发明的方法，不论是双重qpcr还是三重qpcr都能从不同比例的混合肉样中同步检测到目标物种，即以三重qpcr检测为例，由于3个目标物种标记了3种不同的荧光，因此对一个混合肉样来说，只需要一个检测孔，就可以完成是否含有这3种牛成分的检测。
表6双重qpcr和三重qpcr检测深加工混合肉干样品中的黄牛、水牛和牦牛
a在三重qpcr中，各物种引物探针组合的比例；
b黄牛；c水牛；d牦牛；
:3次检测结果中2次或2次以上ct值小于35；
－:3次检测结果中2次或2次以上ct值大于等于35或无ct值显示。
方法2：高分辨率熔解曲线(hrm)法和方法1中的三重qpcr方法类似，可以在一个检测孔中对一个样品同时检测黄牛、水牛和牦牛三种物种。检测结果显示(表7)，对6个单纯肉样检测，结果与预设结果一致，但对7个混合样检测得到的熔解曲线，都与牦牛阳性对照一致，黄牛和水牛对应的熔解曲线均未出现。说明该方法对混合样的检测存在偏差。因此该方法比较适合对整块肉样进行鉴定，而不适合对肉丸、肉松等深加工样品的鉴定。
表7高分辨率熔解曲线(hrm)法检测单一肉样及深加工混合肉样中的黄牛、水牛和牦牛
a混合肉样的质量比例(黄牛：水牛：牦牛)；
b黄牛；c水牛；d牦牛；
:3次检测结果中2次或2次以上的熔解曲线与对应的阳性对照的熔解曲线一致，否则为“－”。
方法3：环介导等温扩增技术(lamp)与三重qpcr及hrm法比较，并不能在一个检测孔中同时完成3种牛的检测，而只能一个检测孔检测一种牛成分，一个样品若要检测三种牛成分的话，即需要3个检测孔，这和本发明方法中的单重qpcr类似。结果显示(表8)，该方法的特异性不高，黄牛、水牛和牦牛的引物皆不能区分这3种牛，因此用该方法检测混合样品，也不具意义，无法达到区分的目的。
表8环介导等温扩增(lamp)法检测单一肉样及深加工混合肉样中的黄牛、水牛和牦牛
a混合肉样的质量比例(黄牛：水牛：牦牛)；
b黄牛；c水牛；d牦牛；
:3次检测结果中2次或2次以上的熔解曲线与对应的阳性对照的熔解曲线一致，否则为“－”。
序列表
<110>浙江省检验检疫科学技术研究院
<120>黄牛、水牛和牦牛的实时荧光pcr检测试剂和检测方法
<160>11
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>bostaurus
<400>1
cccgtcaccctcctcaaata20
<210>2
<211>23
<212>dna
<213>bostaurus
<400>2
cacactttccagtatgcttacct23
<210>3
<211>21
<212>dna
<213>bostaurus
<400>3
cgcactagctacatgagagga21
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>bubalusbubalis
<400>4
caacggccagcataatcgaa20
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>bubalusbubalis
<400>5
gctttgggtgttggtagtgg20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>bubalusbubalis
<400>6
aacaaccaacctccccaaga20
<210>7
<211>20
<212>dna
<213>bosgrunniens
<400>7
cccgtcaccctcctcaaata20
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<211>23
<212>dna
<213>bosgrunniens
<400>8
cacactttccagtatgcttacct23
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<211>21
<212>dna
<213>bosgrunniens
<400>9
cgcactagctatatgagagga21
<210>10
<211>19
<212>dna
<213>eukaryotes
<400>10
cctgagaaacggctaccat19
<210>11
<211>19
<212>dna
<213>eukaryotes
<400>11
cgtgtcaggattgggtaat19
1.对黄牛、水牛及牦牛混合样品的同步物种成分检测的检测试剂，包括引物和探针，其特征在于，
检测黄牛的引物和探针序列包括：
f:cccgtcaccctcctcaaata
r:cacactttccagtatgcttacct
p:cgcactagctacatgagagga；
检测水牛的引物和探针序列包括：
f:caacggccagcataatcgaa
r:gctttgggtgttggtagtgg
p:aacaaccaacctccccaaga；
检测牦牛的引物和探针序列包括：
f:cccgtcaccctcctcaaata
r:cacactttccagtatgcttacct
p:cgcactagctatatgagagga。
2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，探针选自taqman探针。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于，
检测黄牛的探针包括：
p:fam-cgcactagctacatgagagga-eclipse；
检测水牛探针包括：
p:hex-aacaaccaacctccccaaga-eclipse；
检测牦牛的探针包括：
p:rox-cgcactagctatatgagagga-eclipse。
4.一种对黄牛、水牛及牦牛混合样品的同步物种成分检测的实时荧光pcr检测方法，包括：
步骤1：抽提样本中的dna；
步骤2：将步骤1中的dna样品加入至pcr反应体系中，按预先设定的反应程序进行反应；
步骤3：结果判定；
所述pcr反应体系包括检测黄牛、水牛和牦牛的引物和探针，分别是，
检测黄牛的引物和探针序列包括：
f:cccgtcaccctcctcaaata
r:cacactttccagtatgcttacct
p:cgcactagctacatgagagga；
检测水牛的引物和探针序列包括：
f:caacggccagcataatcgaa
r:gctttgggtgttggtagtgg
p:aacaaccaacctccccaaga；
检测牦牛的引物和探针序列包括：
f:cccgtcaccctcctcaaata
r:cacactttccagtatgcttacct
p:cgcactagctatatgagagga。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，探针选自taqman探针。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
检测黄牛的探针包括：
p:fam-cgcactagctacatgagagga-eclipse；
检测水牛探针包括：
p:hex-aacaaccaacctccccaaga-eclipse；
检测牦牛的探针包括：
p:rox-cgcactagctatatgagagga-eclipse。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，反应程序为：(1)95℃，10sec；(2)95℃，5sec；60℃，23sec；40个循环。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，结果判定：ct值小于35时，结果为阳性，ct值大于等于35时为阴性。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进行双重实时荧光pcr反应时，黄牛、水牛及牦牛中任意两种物种的引物探针的含量为1:1。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，进行三重实时荧光pcr反应时，黄牛、水牛、牦牛三组引物探针的含量比例为3:3:2。
技术总结