本发明属于核酸检测领域。
背景技术：
水蛭俗称蚂蟥，是蛭纲动物的总称，是一味用于破血通经、逐瘀消瘾的传统中药，在临床广泛用于中风后遗证、脑血栓等的治疗。国际上将吸食哺乳动物血液，其唾液腺分泌物中含有水蛭素等多种生物活性物质，并且在医药上具有广阔应用前景的蛭类动物统称为医学蛭类。《中国药典》2015版收载的入药品种为水蛭科的宽体金线蛭(whitmaniapigrawhitman)、水蛭(hirudonipponiawhitman，以下称为日本医蛭)及尖细金线蛭(whitmaniaacranulatawhitman)(国家药典委员会.中华人民共和国药典(第一部)[m].北京：中国医药科技出版社，2015.)。然而，水蛭的市场需求和高昂的价格导致市场上菲牛蛭(poecilobdellamanillensislesson)、棒纹牛蛭(poecilobdellajavanicawahlberg)、光润金线蛭(whitmanialaevisbaird)等伪品以次充好的现象十分普遍，且这些近缘物种仅依靠形态特征难以区分和鉴定，影响了药品的安全性和有效性。
传统的水蛭鉴定方法基于完整水蛭的形态特征或薄层色谱对其进行分析，近代的分析方法多依赖于高成本、复杂的仪器，如高效液相色谱指纹图谱和气相色谱/质谱联用技术被广泛应用于特征小分子的检测，而电泳或生物质谱联用技术常被应用于特征蛋白或特定肽段的检测。
技术实现要素：
本发明要解决的问题是：提供一种鉴别宽体金线蛭的pcr检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种鉴别宽体金线蛭的pcr引物，引物序列如seqidno.1～2所示。
前引物在制备宽体金线蛭鉴别试剂盒中的用途。
如前述的用途，所述试剂盒除包括序列如seqidno.1～2所示的引物以外，还包括taqdna聚合酶、dntp、mg2 、pcr反应缓冲液。
如前述的用途，所述试剂盒工作时的退火温度为60℃。
如前述的用途，所述试剂盒是将宽体金线蛭与日本医蛭、尖细金线蛭、菲牛蛭相区分的试剂盒。
一种鉴别宽体金线蛭的pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括序列如seqidno.1～2所示的引物。
进一步地，所述试剂盒还包括taqdna聚合酶、dntp、mg2 、pcr反应缓冲液。
进一步地，所述试剂盒工作时的退火温度为60℃。
前述的引物在鉴别宽体金线蛭中的用途。
进一步地，所述鉴别是将宽体金线蛭与日本医蛭、尖细金线蛭、菲牛蛭相区分。
本发明的有益效果：
首先，本发明引物对特异性良好，利用其进行pcr，不与目标以外的dna片段产生非特异性反应，并且扩增得到的pcr产物可以明显区分，可以用于快速、准确的鉴别宽体金线蛭品种真伪，而不对其它水蛭品种产生非特异性反应，一次反应可以将目标水蛭品种鉴别出来。
其次，本发明的引物对灵敏度高。在使用凝胶电泳成像时，其最低检测限低至0.1ngdna。
另外，采用基于coi基因设计的通用引物对宽体金线蛭进行鉴定时，往往容易引入寄主血液的污染，导致鉴定结果为非水蛭类等情况。采用本发明所述特异性引物鉴定宽体金线蛭，既避免了寄主dna与宽体金线蛭dna同时扩增造成的污染，同时又省去dna条形码测序与序列分析等步骤，同时可降低检验人员的分子生物学知识水平要求，降低人力物力的消耗，缩短检验时限，以期节时、高效得鉴定宽体金线蛭，具有显著优势。
最后，水蛭coi基因(尤其是宽体金线蛭与尖细金线蛭的coi基因)之间的差异性极小，而以差异序列为基础设计的引物会受到引物设计原则(例如cg碱基占比、连续单碱基重复次数、引物二级结构等等)的制约，不一定在应用中能有效区分不同水蛭，基于该基因设计区分水蛭物种的引物难度极大。郑阳等在基于coi基因设计区分引物时，未能成功设计得到可区分宽体金线蛭与尖细金线蛭的特异性引物(郑阳，水蛭的dna分子鉴定和蛋白质分析，江苏大学硕士学位论文，2019，第二章第2.3.1节)。本发明的引物是在coi基因上进行特定选择设计而成，克服了前述的障碍，实现了宽体金线蛭和尖细金线蛭的区分。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：为特异性引物考察凝胶图，最左侧为dnamarker，其中从下至上依次为5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；从左至右依次为：1-宽体金线蛭，2-日本医蛭，3-尖细金线蛭，4-菲牛蛭，5-水(空白对照)。
图2：稳定性测试图。最左侧为dnamarker(大小同图1的marker)，从左到右依次是8个不同批次的宽体金线蛭样品。
图3：引物对不同混合样品的分析结果。
图4：灵敏度测试图。
具体实施方式
实施例1宽体金线蛭的鉴别
首先，根据coi基因设计合成序列如下所述的引物：
wp-5’：gaggctaccaacctgaacgatta(seqidno.1)；
wp-3’：agccgaagacctaaatccatgag(seqidno.2)。
采用如下方法进行鉴别：
(1)基因组dna提取：待测样品取30mg，用动物dna提取试剂盒提取总dna。按照dna提取试剂盒说明书进行操作，于-4℃保存；取dna提取物1μl，采用紫外-分光光度仪验证dna质量，od260/280须大于1.6且小于1.8，od260/230须大于2.0；
(2)pcr扩增体系的建立与反应：总体积为50μl，2×tsingkemastermix(一种pcr预混液的商品，其内包括taqdna聚合酶、dntp、mg2 、pcr反应缓冲液)25ul，上游引物wp-5’1μl，下游引物wp-3’1μl，dna模板1μl(10-30ng)，ddh2o补齐50μl；
pcr反应参数：94℃预变性2min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1.5min，上述程序执行35个循环；72℃延伸5min；
(3)结果检测：pcr扩增反应结束后，取pcr反应产物5μl，凝胶电泳检测，经凝胶成像系统自动生成凝胶图。
当凝胶图中样品位置出现2000bp条带时，则表明被检样品为宽体金线蛭。
以下用实验例的形式对本发明的有益效果进一步说明。
实验例1特异性检测
以来源清晰并经过传统方法验证过品种的宽体金线蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、菲牛蛭标准品为待检样品，用实施例1的方法进行鉴别。
结果如图1所示，只有宽体金线蛭标准品出现了扩增条带，其余品种皆未出现条带。
该结果表明，本发明的方法(尤其是引物)可以特异性鉴别宽体金线蛭。
实验例2稳定性测试
以不同批次的宽体金线蛭为待检样品，验证实施例1的方法是否具有稳定性。
结果发现，8个不同批次的宽体金线蛭样品均能扩增出单一条带(图2)。
该结果表明，本发明的方法(尤其是引物)可稳定鉴别宽体金线蛭。
实验例3混合样本测试
为了检验本发明的方法和引物对混合样本的鉴别能力，设置了4种混合样品：
wp与hn混合、wp与wa混合、hn与wp混合、wp与hn和wa混合，其中前3种各设置5种比例：9∶1、7∶3、1∶1、3∶7、1∶9；最后一种比例为1∶1∶1。每个样本的核酸浓度为20.0ng/μl。
注：wp，宽体金线蛭；hn，日本医蛭；wa，尖细金线蛭。
混合样品分别使用实施例1的方法进行鉴别，结果如图3所示。可见随着wp的比例增大，条带越亮，其比例减小，条带越暗。但总体上，非wp水蛭为wp的9倍时，仍然能检测到wp条带。
前述结果表明，随着混伪品的加入，wp条带的亮度会变低，因此可借助条带明暗程度来辨别wp混伪品和纯品。
实验例4退火温度筛选
将退火温度设置为55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65℃，使用实施例1的方法对宽体金线蛭样品进行pcr扩增。
结果显示，温度的升高可提高反应的特异性，但当退火温度高于60℃时，特异性鉴别条带亮度逐渐变弱，因此选择60℃为扩增体系的退火温度。
实验例5灵敏度测试
将宽体金线蛭dna模板浓度分别稀释至20ng/μl，10ng/μl，5ng/μl，1ng/μl，0.1ng/μl，0.01ng/μl，对宽体金线蛭的灵敏度进行测定，即对20ng至0.01ng范围内的dna进行pcr扩增(方法同实施例1)。
宽体金线蛭不同浓度的dna扩增后得到的条带如图4所示。由图4可见，随着dna浓度的降低，条带的亮度也逐渐降低。结果表明，引物wp对宽体金线蛭的检测限为0.1ng。
本实验例结果表明，本发明的pcr检测试剂盒灵敏度高。
综上，本发明的检测试剂盒同时具有高特异性、稳定性、灵敏度，可有效对宽体金线蛭与其他水蛭进行鉴别。
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<110>泸州百草堂健康产品有限公司
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1.一种鉴别宽体金线蛭的pcr引物，其特征在于：引物序列如seqidno.1～2所示。
2.权利要求1所述引物在制备宽体金线蛭鉴别试剂盒中的用途。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述试剂盒除包括序列如seqidno.1～2所示的引物以外，还包括taqdna聚合酶、dntp、mg2 、pcr反应缓冲液。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于：所述试剂盒工作时的退火温度为60℃。
5.如权利要求2所述的用途，其特征在于：所述试剂盒是将宽体金线蛭与日本医蛭、尖细金线蛭、菲牛蛭相区分的试剂盒。
6.一种鉴别宽体金线蛭的pcr检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括序列如seqidno.1～2所示的引物。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括taqdna聚合酶、dntp、mg2 、pcr反应缓冲液。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒工作时的退火温度为60℃。
9.权利要求1所述的引物在鉴别宽体金线蛭中的用途。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于：所述引物用于区分宽体金线蛭与日本医蛭、尖细金线蛭、菲牛蛭。
技术总结