本发明涉及微生物耐药/低敏感技术领域，具体涉及一种艰难梭菌耐药/低敏感进化分支snp标记及菌株类别鉴定方法和应用。
背景技术：
近年来，艰难梭菌(clostridiumdifficile)感染(cdi)在北美及欧洲爆发情况严峻。美国疾病预防控制中心(cdc)在2013年将艰难梭菌感染列为“微生物导致公共健康威胁”紧迫级的首位，2015年发布的数据显示仅在美国每年近50万人感染，年死亡例数高达3万，已开始取代mrsa成为最常见的医院感染病原体，治疗费用高达每年15亿美金。cdi发病率及严重程度在全球范围内呈明显上升趋势，引起全世界的广泛关注。
艰难梭菌可以依据多位点序列分型(multilocussequencetyping，mlst)数据库(http://pubmlst.org/cdifficile)进行clade分支划分，该库根据7个看家基因的多态性确定每个菌株的序列类型(sequencetype，st)，再根据整个物种进化关系将各st分配到5个分支(clade1-clade5)。clade1作为艰难梭菌中传播最广泛、多样性最丰富的菌株，从全球收集的数据来看，clade1占了整个菌群近63.8％的样本，属于多达65.9％种的核糖核酸型(核糖核酸型是通过实验手段利用16s-23s的基因间隔区域多态性的聚合酶链反应的方法分类)。
cdi治愈是疾病传播的关键难题，该菌对常见抗生素如红霉素、克林霉素、氟喹诺酮类均有较高的耐药程度，新型治疗手段如fmt、毒素中和抗体等还在初期阶段，其后期安全性等评估还有待时间验证，目前主要有效治疗药物为甲硝唑和万古霉素，但近年来艰难梭菌对该药物敏感性也持续下降。对耐药菌继续使用抗生素，不但起不到治疗效果，产生资源浪费且耽误临床周期，还有可能造成更严重的耐药突变。
现有的病原菌耐药性检测主要有以下两类技术：(1)通过药敏试验鉴定耐药与否；(2)通过耐药试剂盒等产品鉴定耐药。现有的病原菌耐药性检测技术存在以下问题：(1)药敏试验检测艰难梭菌，培养条件苛刻，实验周期较长，不能满足临床快检的需求。(2)已有耐药试剂盒并不是治疗药物的检测，临床指导意义不大。
技术实现要素：
本发明提供一种艰难梭菌耐药/低敏感进化分支snp标记及菌株类别鉴定方法和应用，不仅仅鉴定耐药/低敏感标记，而且可以鉴定整个耐药/低敏感进化分支，快速准确鉴定耐多种治疗药物和相关药物的艰难梭菌的进化分支，不但可以有效指导临床用药，还为耐药/低敏感病原菌进化溯源提供依据。
根据第一方面，一种实施例中提供一种艰难梭菌耐药/低敏感进化分支snp标记，其中，艰难梭菌是clostridiumdifficileclade1,上述snp标记选自如下表1-3中任一snp标记或它们的任意组合：
表1clade1的274株目标菌株的17个分支特异性snp标记
其中，目标菌株表示对莫西沙星、甲硝唑和万古霉素具有特征性耐药/低敏感率的clade1菌株，其他菌株表示目标菌株以外的clade1菌株；上述参考基因组表示clostridiumdifficilecd196(nc_013315.1)；
表2区分类别1、2和类别3、4、5的56个snp标记
其中，类别1-5表示上述目标菌株按照上述特征性耐药/低敏感率差异区分的五个类别的clade1菌株；上述类别特异性为该类的碱基比例最大的主导碱基与其他类的主导碱基不同；
表3区分类别3、4、5的11个snp标记
根据第二方面，一种实施例中提供一种艰难梭菌菌株类别鉴定方法，该方法包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的如第一方面中的snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株类别。
在优选实施例中，上述方法包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的如第一方面中的表1中的17个分支特异性snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株类别为目标菌株或其他菌株。
在优选实施例中，上述方法还包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的如第一方面中的表2中的56个snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株类别为目标菌株中的类别1、类别2或类别3、4、5。
在优选实施例中，上述方法还包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的如第一方面中的表3中的11个snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断上述艰难梭菌菌株类别为目标菌株中的类别3、类别4或类别5。
在优选实施例中，上述方法通过使用用于特异性扩增上述snp标记位点所在基因组区域的引物扩增上述区域，并通过测序获取上述snp标记位点的碱基信息。
根据第三方面，一种实施例中提供一种用于特异性扩增如第一方面中的上述snp标记所在基因组区域的引物，上述引物包括正向引物和反向引物，上述正向引物和反向引物分别特异性结合上述snp标记两侧的基因组正反链。
在优选实施例中，上述引物上带有荧光标签，上述引物用于荧光定量pcr。
在优选实施例中，上述引物作为杂交探针，用于固定于芯片上以捕获上述snp标记所在基因组区域的序列。
根据第四方面，一种实施例中提供一种如第一方面中的snp标记或如第三方面中的引物在艰难梭菌菌株类别鉴定中的用途。
根据第五方面，一种实施例中提供一种试剂盒，该试剂盒包括引物，上述引物包括正向引物和反向引物，上述正向引物和反向引物分别特异性结合如第一方面中的snp标记两侧的基因组正反链，用于特异性扩增上述snp标记所在基因组区域。
在优选实施例中，上述试剂盒还包括上述引物以外的pcr扩增组分。
本发明不仅仅鉴定耐药/低敏感标记，而且可以鉴定整个耐药/低敏感进化分支，快速准确鉴定耐多种治疗药物和相关药物的艰难梭菌的进化分支，不但可以有效指导临床用药，还为耐药/低敏感病原菌进化溯源提供依据。
附图说明
图1为本发明实施例中274个clade1菌株的类别(sublineage)进化关系及耐药/低敏感情况图，其中，进化树外部的灰色注释代表耐药/低敏感菌株，从里到外分别是莫西沙星(mox)、甲硝唑(met)和万古霉素(van)耐药/低敏感。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本发明基于全球30个国家收集的1474株艰难梭菌菌株，进行研究而得到。具体而言，包括以下过程：
(1)通过全基因组高深度测序，snp鉴定(以clostridiumdifficilecd196(nc_013315.1)为参考基因组)等生物信息分析策略构建出整个菌群的进化关系。
(2)对所有菌株做3类药(莫西沙星mox、甲硝唑met、万古霉素van，其中莫西沙星属于氟喹诺酮类抗生素，与艰难梭菌的爆发有密切关系，后两种药物是目前的一线治疗药物)的药敏实验，分别得到抗性或敏感表型。
(3)结合上述两步基因型与表型对应关系进行耐药/低敏感进化分支标记的鉴定，具体包括：
a)从进化树上挑选有明显耐药/低敏感特征差异的clade1代表菌株(274株)；
b)对274株菌株构建ml进化树，并根据耐药/低敏感表型特征差异分为5个类别(sublineages)，如图1和表4所示。
表4274株目标菌株5个类别的耐药/低敏感率差异
该群体整体的耐药/低敏感率处于中低水平，但细分的5个类别的耐药/低敏感率却存在显著差异，准确精细区分这几类分支能够更有效指导临床抗生素的使用。如上表，mox的耐药/低敏感率在类别1、4中远低于平均水平，其他类别则都高于87％；met的耐药/低敏感率在类别1、3、4中不到6％，而在类别5中高于平均值近8倍；万古霉素的耐药/低敏感率在类别2中高达93％，比其他类别高出2倍，因此该一线药物对该类别有较低的疗效。
c)层级挑选各分类的snp标记
从全部1474株样本中提取可以区分出274株目标菌株的snp标记，如表1所示。其中，目标菌株表示对莫西沙星、甲硝唑和万古霉素具有特征性耐药/低敏感率(如表1所示)的clade1菌株，其他菌株表示目标菌株以外的菌株；参考基因组表示clostridiumdifficilecd196(nc_013315.1)。
对表1中17个分支特异性snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息进行鉴定，能够判断待检测艰难梭菌属于目标菌株或其他菌株。如位点1204937位置上碱基为c则有93.0％概率(274*92％/(274*92％ 1200*14.2％))为目标菌株，为t则有98％的概率(1200*85.8％/(274*8％ 1200*85.8％))为其他菌株。其余标记同理，同时也可多个标记任意数目组合使用提高区分准确率。
表1clade1的274株目标菌株的17个分支特异性snp标记
从274株目标菌株内部提取出可以区分5个类别(sublineage)的snp标记。
具体而言，由于类别3、4、5的进化关系较近，与类别1、2一起找snp标记会导致差异碱基不存在，所以利用层级筛选的方法：
首先，挑选区分类别1、2和类别3、4、5的snp标记，结果如表2所示。
通过表2可以明确区分(100％)类别1、2和类别3、4、5，如位点1031179为c则100％概率为类别3、4、5，为t则为类别1或类别2；其他snp标记使用方法同理。另外，类别1没有直接特异性的位点，则可通过组合方式来鉴定，如1031179位点为t则鉴定为类别1或类别2，再结合位点107599，如果为g则是类别1，为a则是类别2，以此类推，可取任意可行性组合达到区分每一类的目的。
表2区分类别1、2和类别3、4、5的56个snp标记
其中，类别特异性为该类的碱基比例最大的主导碱基与其他类的主导碱基不同。
其次，挑选区分类别3、4、5的snp标记，结果如表3所示。
通过表3可以进一步区分类别3、4、5。snp标记的使用方法同上，如1199741位点为t，则有98.7％的概率((128*96.9％ 25*100％)/(128*96.9％ 25*100％ 18*11.1％))为类别3和类别4，位点为c则有80.1％概率(18*88.9％/(18*88.9％ 128*3.1％))为类别5。其他snp标记同理，此外类别3没有直接特异性位点，则可以通过组合位点的方式来鉴定，如通过其他位点鉴定先鉴定出属于类别3或类别4，再结合位点6310进一步区分出这两类。
表3区分类别3、4、5的11个snp标记
因此根据应用场景，单独使用或组合应用上述所得snp标记，对不同类别菌株进行区分、鉴定。
本发明中，各snp标记的具体挑选步骤如下：
(1)遍历全基因组snp位点，若各分类菌株在该位点频率最高的碱基都相同，则去除该位点；
(2)若该位点存在未知信息(如由于测序错误或测序覆盖率不足，某一菌株在该位点的碱基未知)，则去除该位点；
(3)根据剩余位点的碱基类型及碱基频率信息，选取在同一类菌株中主要碱基的频率大于一定阈值(如80％或100％等)的snp位点，作为区分不同类别菌株的标记；
(4)根据应用场景，单独使用或组合应用上一步所得snp标记，对不同类别菌株进行区分、鉴定；
(5)根据菌株类别判定结果，得到所在类别的耐药/低敏感概率。
基于本发明的snp标记，本发明的一种实施例中提供一种艰难梭菌菌株类别鉴定方法，该方法包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的如本发明中的snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断艰难梭菌菌株类别。
在具体实施例中，获取待鉴定艰难梭菌菌株的如本发明中的表1中的17个分支特异性snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断艰难梭菌菌株类别为目标菌株或其他菌株。
进一步，在具体实施例中，获取待鉴定艰难梭菌菌株的如本发明中的表2中的56个snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断艰难梭菌菌株类别为目标菌株中的类别1、类别2或类别3、4、5。
更进一步，在具体实施例中，获取待鉴定艰难梭菌菌株的如本发明中的表3中的11个snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据上述碱基信息判断艰难梭菌菌株类别为目标菌株中的类别3、类别4或类别5。
具体而言，在具体实施例中，可以通过使用特异性扩增本发明的snp标记位点所在基因组区域的引物进行扩增，并通过测序获取snp标记位点的碱基信息。
本发明的一种实施例中提供一种用于特异性扩增如本发明中的snp标记所在基因组区域的引物，包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物分别特异性结合snp标记两侧的基因组正反链。本发明中，引物按照本领域常规设计即可，没有特别限制。
如下表5示出了检测部分snp标记位点的正向引物和反向引物，以及引物对应的类别特异性。表5.snp标记的pcr引物
表5中，snp位点为艰难梭菌cd196菌株基因组上的位置；引物序列中snp标记位点以下划线标注；用于同一snp标记位点鉴定的两对引物共享一条反向引物，仅在正向引物的3’端最后一位碱基有区别。
表5中的引物，在实际应用时，可分别在识别同一snp标记位点的两对引物上添加不同颜色的荧光标签，根据qpcr过程中两种颜色荧光的区别来判断菌株类别；也可以用常规pcr对序列进行扩增，然后使用质谱或测序手段进行snp标记位点鉴定；还可以将引物改造为杂交探针，用于dna芯片中。
本发明的snp标记和引物均可用于艰难梭菌菌株类别鉴定。因此，本发明的一种实施例中提供一种如本发明中的snp标记或如本发明中的引物在艰难梭菌菌株类别鉴定中的用途。
本发明的一种实施例中提供一种试剂盒，该试剂盒包括引物，其包括正向引物和反向引物，正向引物和反向引物分别特异性结合如本发明中的snp标记两侧的基因组正反链，用于特异性扩增snp标记所在基因组区域。
在其他优选实施例中，本发明的试剂盒还包括引物以外的pcr扩增组分，例如dna聚合酶、pcr缓冲液等。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
1.一种艰难梭菌耐药/低敏感进化分支snp标记，其特征在于，所述艰难梭菌是clostridiumdifficileclade1，所述snp标记选自如下表1-3中任一snp标记或它们的任意组合：
表1clade1的274株目标菌株的17个分支特异性snp标记
其中，目标菌株表示对莫西沙星、甲硝唑和万古霉素具有特征性耐药/低敏感率的clade1菌株，其他菌株表示目标菌株以外的clade1菌株；所述参考基因组表示clostridiumdifficilecd196(nc_013315.1)；
表2区分类别1、2和类别3、4、5的56个snp标记
其中，类别1-5表示所述目标菌株按照所述特征性耐药/低敏感率差异区分的五个类别的clade1菌株；所述类别特异性为该类的碱基比例最大的主导碱基与其他类的主导碱基不同；
表3区分类别3、4、5的11个snp标记
2.一种艰难梭菌菌株类别鉴定方法，其特征在于，所述方法包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的权利要求1中snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株类别。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的权利要求1的表1中的17个分支特异性snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株类别为目标菌株或其他菌株。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的权利要求1的表2中的56个snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株类别为目标菌株中的类别1、类别2或类别3、4、5。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：获取待鉴定艰难梭菌菌株的权利要求1的表3中的11个snp标记中至少一个snp标记位点的碱基信息；以及，根据所述碱基信息判断所述艰难梭菌菌株类别为目标菌株中的类别3、类别4或类别5。
6.根据权利要求2至5任一项所述的方法，其特征在于，所述方法通过使用用于特异性扩增所述snp标记位点所在基因组区域的引物扩增所述区域，并通过测序获取所述snp标记位点的碱基信息。
7.一种用于特异性扩增权利要求1中所述snp标记所在基因组区域的引物，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物分别特异性结合所述snp标记两侧的基因组正反链；
优选地，所述引物上带有荧光标签，所述引物用于荧光定量pcr。
8.根据权利要求7所述的引物，其特征在于，所述引物作为杂交探针，用于固定于芯片上以捕获所述snp标记所在基因组区域的序列。
9.权利要求1所述的snp标记或权利要求7或8所述的引物在艰难梭菌菌株类别鉴定中的用途。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物分别特异性结合权利要求1中所述snp标记两侧的基因组正反链，用于特异性扩增所述snp标记所在基因组区域；
任选地，所述试剂盒还包括所述引物以外的pcr扩增组分。
技术总结