本发明涉及分子诊断技术领域，更具体地，涉及一种基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒。
背景技术：
结核分枝杆菌是引起结核病的主要致病菌。根据2018年世界卫生组织全球结核病报告，8个国家的结核病病例数占全球总数的2/3,而我国占到其中第二位(9％)。2018年全球新增约50万利福平耐药结核病病例，其中我国新增耐多药结核病和利福平耐药结核病患者约7万人，因此耐药结核仍然是一项公共卫生威胁。
当前临床上检测结核分枝杆菌利福平耐药常用的方法有细菌培养法和pcr核酸检测法。其中基于培养的药敏检测的主要缺点是耗时长(一般需要28～42天，采用bactcmgit960快速液体培养基也需要10～14天)，操作繁琐，检测成本高。而基于核酸检测的pcr荧光曲线技术具有较高的灵敏度和特异性，但缺点是假阳性率较高。同时，样本中往往含有抑制pcr反应的成分也会导致假阴性的出现，限制了pcr技术的临床应用。由此可见，结核分枝杆菌利福平耐药的的诊断，急需更简洁，灵敏的快速检测方法。
现已经证实结核分枝杆菌利福平耐药与rna聚合酶的β亚基编码基因rpob的突变有关，其中绝大部分(95％)的突变都发生在rpob上的507～533密码利福平耐药决定区域上，通过检测相关区域基因突变情况，就可给出耐药信息。
现有检测结核分枝杆菌利福平耐药的技术检测时间长，检测特异性和灵敏度不够，不利于基层检测人员的普及。
技术实现要素：
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明的首要目的是提供一种用于结核分枝杆菌ropb基因环介导恒温扩增的检测引物组。
本发明的第二个目的是提供一种用于筛查ropb突变区域的分子信标。
本发明的第三个目的是提供一种基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种用于结核分枝杆菌ropb基因环介导恒温扩增的检测引物组，所述检测引物组包括外引物对f3/b3、内引物组fip-1/fip-2/fip-3/fip-4/bip、环引物lb；其中，f3/b3的序列如seqidno：1～2所示，fip-1/fip-2/fip-3/fip-4/bip的序列如seqidno：3～7所示；lb的序列如seqidno：8所示。
本发明还提供一种用于筛查ropb突变区域的分子信标rpob-m1、rpob-m2、rpob-m3、rpob-m4，所述分子信标的序列如seqidno：9～12所示。
本发明还提供一种基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒，含有所述的检测引物组和分子信标。
优选地，所述试剂盒还包括反应液、dna聚合酶、阳性对照和阴性对照。
更优选地，所述反应液包含10mmdntps、10×thermopol反应缓冲液和100mmmgso4水溶液，三者的体积比是7：5：3。
更优选地，所述阳性对照为含有ropb基因dna片段的t载体克隆，所述阴性对照为超纯水。
优选地，试剂盒进行pcr扩增的程序为：
第一步：63℃反应30s；
第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号，45个循环。
优选地，在进行检测前，试剂盒中所述检测引物组、分子信标和反应液混合形成反应混合试剂。
更优选地，所述检测引物组、分子信标和反应液的混合体积比为1：1：20。
本发明还提供利用上述试剂盒进行检测确认结核分枝杆菌是否有利福平耐药性的方法，包括以下步骤：
s1、提取待测样本dna；
s2、配置反应混合试剂：分别制备反应混合试剂a，反应混合试剂b，反应混合试剂c，反应混合试剂d；
其中，反应混合试剂a(22μl，引物组、分子信标和反应液的混合体积比为1：1：20)含有0.2μm外引物对f3/b3、1.6μm内引物对fip-1/bip、0.8μm环引物lb、1μm分子信标rpob-m1、反应液20μl；
反应混合试剂b(22μl，引物组、分子信标和反应液的混合体积比为1：1：20)含有外0.2μm引物对f3/b3、1.6μm内引物对fip-2/bip、0.8μm环引物lb、1μm分子信标rpob-m2、反应液20μl；
反应混合试剂c(22μl，引物组、分子信标和反应液的混合体积比为1：1：20)含有0.2μm外引物对f3/b3、1.6μm内引物对fip-3/bip、0.8μm环引物lb、1μm分子信标rpob-m3、反应液20μl；
反应混合试剂d(22μl，引物组、分子信标和反应液的混合体积比为1：1：20)含有0.2μm外引物对f3/b3、1.6μm内引物对fip-4/bip、0.8μm环引物lb、1μm分子信标rpob-m4、反应液20μl。
s3、构建反应体系：共4个独立的反应体系(分别置于a、b、c、d四管中)，其中反应体系a包含22μl反应混合试剂a、bst聚合酶1μl、待测样本dna模板2μl，总体积为25μl；反应体系b包含22μl反应混合试剂b、bst聚合酶1μl、待测样本dna模板2μl，总体积为25μl；反应体系c包含22μl反应混合试剂c、bst聚合酶1μl、待测样本dna模板2μl，总体积为25μl；反应体系d包含22μl反应混合试剂d、bst聚合酶1μl、待测样本dna模板2μl，总体积为25μl；
s4、pcr扩增：
第一步：63℃反应30s；
第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号，45个循环。
s5、溶解曲线测定采用如下程序：85℃，3min；40℃，3min，升温过程40℃～85℃，升温速率0.1℃/s，同时进行fam、hex，vic和texred四通道采集荧光；
s6、结果判读：
a、b、c、d四管中rpob基因检测结果为阳性且三管中任一通道样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时，说明该样品是结核分枝杆菌，且对利福平耐药。
a、b、c、d四管中rpob基因检测结果无溶解曲线，说明样品不为结核分枝杆菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以rpob基因作为检测靶点，并对该突变区域设计合成四条分子信标探针，通过四条探针的联合作用，利用溶解曲线法实现对突变基因的筛查达到检测结核分枝杆菌利福平耐药的效果；采用本发明的试剂盒进行检测，简单快速，只需要1个小时即可判断样本是否对利福平耐药，同时还能检测样品是否为结核分枝杆菌；灵敏度高，最低可检测100cfu/ml的结核分枝杆菌；本发明设计了四条分子信标探针，基本覆盖了利福平耐药相关基因的突变位点；本发明对于临床使用利福平对肺结核的治疗用药有重要的参考价值，适合推广使用。
附图说明
图1为信标探针检测结核分枝杆菌单碱基突变的典型结果图；其中，图1a为rpob-m1探针；其中曲线1、2、3、4分别表示：511位点ctg突变为ccg，515位点agc>acc，野生型，阴性对照；图1b为rpob-m2探针；其中曲线1、2、3、4分别表示：513位点caa>cca，516位点gac>gtc，野生型，阴性对照；图1c为rpob-m3探针；其中曲线1、2、3、4分别表示：522位点tcg>ttg，526位点cac>tac，野生型，阴性对照；图1d为rpob-m4探针；其中曲线1、2、3、4分别表示：531位点tcg>ttg，531位点tcg>tgg，野生型，阴性对照；
图2为rpob-m1检测耐药结核分枝杆菌灵敏度图，其中曲线1、2、3、4、5、6、7分别表示浓度为105cfu/ml，104cfu/ml，103cfu/ml，102cfu/ml，10cfu/ml耐药结核分枝杆菌溶解曲线，阳性对照及阴性对照；
图3为rpob-m1检测结核分枝杆菌特异性图，其中曲线1、2、3分别为耐药结核分枝杆菌溶解曲线，阳性对照，阴性对照溶解曲线，其他均非结核分枝杆菌模板溶解曲线。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实验例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1结核分枝杆菌利福平耐药恒温扩增结合分子信标技术检测试剂盒的建立
结核分枝杆菌利福平耐药恒温扩增结合分子信标技术检测试剂盒，包括反应试剂a，b，c，d四管，8u/μl的bstdna聚合酶(大片段，neb公司)，阳性对照，阴性对照。其中四管中具体组分如下所示：
反应试剂a管：由外引物f3/b3，内引物fip-1/bip，环引物lb，信标探针rpob-m1，10mmdntps、10×thermopol反应缓冲液和100mmmgso4水溶液组成。
反应试剂b管：由外引物f3/b3，内引物fip-2/bip，环引物lb，信标探针rpob-m2，10mmdntps、10×thermopol反应缓冲液和100mmmgso4水溶液组成。
反应试剂c管：由外引物f3/b3，内引物fip-3/bip，环引物lb，信标探针rpob-m3，10mmdntps、10×thermopol反应缓冲液和100mmmgso4水溶液组成。
反应试剂d管：由外引物f3/b3，内引物fip-4/bip，环引物lb，信标探针rpob-m4，10mmdntps、10×thermopol反应缓冲液和100mmmgso4水溶液组成。
阳性对照为含有结核分枝杆菌rpob部分突变基因dna片段的t载体克隆。
阴性对照为超纯水。
其中，所涉及的引物序列如下：
rpob-f3:gacgttgatcaacatccg(seqidno:1)
rpob-b3:gatctcgtcgctaaccac(seqidno:2)
rpob-fip-1:cgggttgttctggtccatgaagcgatcaaggagttcttc(seqidno:3)
rpob-fip-2:gtgggtcaaccccgacagggcaccagccagctgagccaa(seqidno:4)
rpob-fip-3:cagcgcccgacagtcggcgctatggaccagaacaacccg(seqidno:5)
rpob-fip-4:ctcacgtgacagaccgccggctgtcggggttgacccac(seqidno:6)
rpob-bip:ccaacatcggtctgatcggtacggcgtttcgatgaac(seqidno:7)
rpob-lb:ctcgctgtcggtgtacgc(seqidno:8)。
所涉及的信标探针序列如下所示：
rpob-m1:fam-tagtgtaggctcgcctggctggtgtccacta-bhq2(seqidno:9)
rpob-m2:cy3-cactgcgggttgtgctggaccaccaacagtg-bhq2(seqidno:10)
rpob-m3:tet-gctactgtmggtcaaccccaacawgtagc-bhq2(seqidno:11)
rpob-m4:vic-tagtgcagcgccaacagtcggcgctcacta-bhq2(seqidno:12)。
实施例2样本中结核分枝杆菌利福平耐药的检测方法
利用实施例1的试剂盒检测结核分枝杆菌利福平耐药，本实施例的待检测样品是疑似为含有结核分枝杆菌的痰液样品，也可以是已鉴定为结核分枝杆菌患者的支气管灌洗液或其他样品，或者是分离的分枝杆菌，具体包括以下步骤：
(1)样本处理
在痰样中加入3倍体积的4％的naoh溶液，旋涡震荡均匀，室温下放置15min，然后吸取1ml加入带旋盖的离心管中。12000rpm离心5min，去上清液。加入0.9％的nacl或生理盐水1ml，混匀，12000rpm离心5min，去上清液。加入100μl的dna提取液，100℃加热10min，加热后立即冷却10min；12000rpm离心2min，将上清液转移至新的离心管中备用，上清液即为恒温扩增的dna模板。
(2)实时荧光环介导等温扩增反应
试剂准备：
a、对于a管：扩增体系为25μl：22μl反应液，1μl的bstdna聚合酶，2μl的核酸模板，22μl反应液的组成为：0.2μm外引物f3/b3，1.6μm内引物fip-1/bip，0.8μm环引物lb，1μm信标探针rpob-m1，20μl反应液(10mmdntps、10×thermopol反应缓冲液和100mmmgso4水溶液)组成。
b、对于b管：扩增体系为25μl：22μl反应液，1μl的bstdna聚合酶，2μl的核酸模板，22μl反应液的组成为：0.2μm外引物f3/b3，1.6μm内引物fip-2/bip，0.8μm环引物lb，1μm信标探针rpob-m2，20μl反应液(10mmdntps、10×thermopol反应缓冲液和100mmmgso4水溶液)组成。
c、对于c管：扩增体系为25μl：22μl反应液，1μl的bstdna聚合酶，2μl的核酸模板，22μl反应液的组成为：0.2μm外引物f3/b3，1.6μm内引物fip-3/bip，0.8μm环引物lb，1μm信标探针rpob-m3，20μl反应液(10mmdntps、10×thermopol反应缓冲液和100mmmgso4水溶液)组成。
d、对于d管：扩增体系为25μl：22μl反应液，1μl的bstdna聚合酶，2μl的核酸模板，22μl反应液的组成为：0.2μm外引物f3/b3，1.6μm内引物fip-4/bip，0.8μm环引物lb，1μm信标探针rpob-m4，20μl反应液(10mmdntps、10×thermopol反应缓冲液和100mmmgso4水溶液)组成。
扩增程序：63℃反应30s；扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，45个循环。
(3)溶解曲线测定
溶解程序为：85℃，3min；40℃，3min；升温过程40℃～85℃，升温速率0.2℃/s，同时进行fam、hex、vic和texred四通道采集荧光。
(4)结果判读
将反应管置于荧光pcr仪中，实时读取荧光信号，根据检测结果和溶解曲线测定tm值结果进行判断：当4个通道样品中的tm值与阳性对照的熔点一致(误差不超过1℃)时判断为野生型，当a、b、c、d四管中rpob基因检测结果为阳性且四管中任一通道样品的熔点低于阳性对照2℃及以上时，判断为突变型，样本对利福平耐药。其中各管中所测tm值如下所示，由于使用仪器的差异导致其值可能误差为±1℃，具体如下：反应体系a中fam通道野生型对照峰tm值为69℃±1℃，反应体系b中cy3通道野生型对照峰tm值为68℃±1℃，反应体系c中tet通道野生型对照峰tm值为71℃±1℃反应体系d中vic通道野生型对照峰tm值为65℃±1℃。
实施例3环介导等温扩增结合分子信标检测利福平结核分枝杆菌灵敏度实验
以确定利福平耐药结核分枝杆菌为研究对象，采用十倍浓度梯度稀释法将初始浓度为105cfu/ml的菌液稀释至104、103、102、10cfu/ml，同时设置阳性对照(含有rpob耐药决定区域片段载体)及阴性对照(去离子水)，按照实施例2中的反应体系构建的检测方法，以确定该体系的敏感性。结果如图2所示，从图中可以看出，样品中结核分枝杆菌的浓度均高于102cfu/ml的在a管中均出现了rpob基因检测阳性，溶解曲线测定tm值低于阳性对照2℃以上，呈现阳性结果。结果表明：建立的检测结核分枝杆菌利福平耐药的恒温扩增结合分子信标法可检测样品中102cfu/ml的利福平耐药的结核分枝杆菌。
实施例4环介导等温扩增结合分子信标检测利福平结核分枝杆菌特异性实验
用实施例2的方法分别对耐药结核分枝杆菌，鸟分枝杆菌、土地分枝杆菌、施氏分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、戈登分枝杆菌、龟脓分枝杆菌、偶然分枝杆菌、草分枝杆菌、巴西诺卡氏、北京棒杆菌、肺炎球菌、嗜肺军团菌、百日咳博德特氏菌进行核酸模板提取检测，阴性对照(超纯水)。结果显示，仅有耐药结核分枝杆菌出现正常溶解峰信号，15株非结核分枝杆菌和阴性对照均无非特异性信号。如此表明，设计的引物和分子信标探针具有较高的特异性。
序列表
<110>广州迪澳生物科技有限公司
广州迪澳医疗科技有限公司
<120>一种基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒
<130>zm201344zl
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>1
gacgttgatcaacatccg18
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>2
gatctcgtcgctaaccac18
<210>3
<211>39
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>3
cgggttgttctggtccatgaagcgatcaaggagttcttc39
<210>4
<211>39
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>4
gtgggtcaaccccgacagggcaccagccagctgagccaa39
<210>5
<211>39
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>5
cagcgcccgacagtcggcgctatggaccagaacaacccg39
<210>6
<211>38
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>6
ctcacgtgacagaccgccggctgtcggggttgacccac38
<210>7
<211>37
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>7
ccaacatcggtctgatcggtacggcgtttcgatgaac37
<210>8
<211>18
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>8
ctcgctgtcggtgtacgc18
<210>9
<211>31
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>9
tagtgtaggctcgcctggctggtgtccacta31
<210>10
<211>31
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>10
cactgcgggttgtgctggaccaccaacagtg31
<210>11
<211>29
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>11
gctactgtmggtcaaccccaacawgtagc29
<210>12
<211>30
<212>dna
<213>tuberclebacillus
<400>12
tagtgcagcgccaacagtcggcgctcacta30
1.一种用于结核分枝杆菌ropb基因环介导恒温扩增的检测引物组，其特征在于，所述检测引物组包括外引物对f3/b3、内引物组fip-1/fip-2/fip-3/fip-4/bip、环引物lb；其中，f3/b3的序列如seqidno：1～2所示，fip-1/fip-2/fip-3/fip-4/bip的序列如seqidno：3～7所示；lb的序列如seqidno：8所示。
2.一种用于筛查ropb突变区域的分子信标，其特征在于，所述分子信标的序列如seqidno：9～12所示。
3.一种基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的检测引物组和权利要求2所述的分子信标。
4.根据权利要求3所述的基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒，其特征在于，还包括反应液、dna聚合酶、阳性对照和阴性对照。
5.根据权利要求4所述的基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒，其特征在于，所述反应液包含10mmdntps、10×thermopol反应缓冲液和100mmmgso4水溶液，三者的体积比是7：5：3。
6.根据权利要求4所述的基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为含有ropb基因dna片段的t载体克隆，所述阴性对照为超纯水。
7.根据权利要求4所述的基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒，其特征在于，pcr扩增程序为：
第一步：63℃反应30s；
第二步扩增循环：63℃反应15s，63℃反应45s，采集荧光信号，45个循环。
8.根据权利要求4所述的基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒，其特征在于，所述检测引物组、分子信标和反应液混合形成反应混合试剂。
9.根据权利要求8所述的基于恒温法检测结核分枝杆菌利福平耐药的试剂盒，其特征在于，所述检测引物组、分子信标和反应液的混合体积比为1：1：20。
技术总结