本发明属于细菌检测方法技术领域，涉及用于小肠结肠耶尔森菌4个主要致病型o抗原血清型检测的液相芯片及应用。
背景技术：
小肠结肠耶尔森菌是一种革兰阴性的肠道病原菌。它通过粪口传播途径感染人体，除了能引起多种胃肠道疾病外，还可引发心血管系统、呼吸系统、骨骼结蹄组织等疾患，甚至可引起败血症，导致死亡。食品和水源的污染是胃肠型小肠结肠耶尔森菌病的重要原因，其传播途径包括人与人、人与动物、水和食物的传播。全球至少40个国家报道过小肠结肠耶尔森菌的感染，我国历史上也曾爆发过由于该菌的暴发流行，且在日常时有散发病例报道，很多国家均将小肠结肠耶尔森菌列为进出口食品的常规检测项目。
我国于2016年实施的最新的食品微生物学国家标准（gb4789.8-2016）中，规定了利用生物化学方法对食品中小肠结肠耶尔森菌的检验流程，并将血清学鉴定列为选作项目；同年发布的关于出口食品小肠结肠耶尔森菌检测的出入境检验检疫行业标准（snt4525.10-2016）中，推荐使用多位点序列分型（mlst）的方法进行小肠结肠耶尔森菌的检测和溯源，但涉及基因测序和分析，操作工作较为繁琐且所需专业性较强。细菌的血清型与致病性密切相关，同一种内不同血清型细菌的致病性往往存在着很大差异。血清学分型自上世纪30年代开始被广泛使用，至今已有超过80年的历史，可在种/属内将细菌进一步分类，是一种重要的细菌鉴定方法。当前，血清学分型亦是小肠结肠耶尔森菌最常用的检测方法。小肠结肠耶尔森菌根据o抗原的不同，可以分为60多个血清型，其中，o3，o5，o8和o9型是最为常见的致病性血清型。
传统血清学鉴定方法虽被广泛使用，但仍存在诸多缺陷。主要包括：建立血清学分型系统的工作繁琐、周期长；血清的生产和质控较为困难；血清学鉴定的实验过程耗时较长（2-6天）等。建立与传统血清学方法相对应的高通量分子甄别技术，不但可大幅度提高细菌血清型鉴定的速度、准确性和通量，而且可使基于传统血清学鉴定和分子生物学鉴定的各种流行病学数据之间能够有效整合、协调，并可让使用不同细菌鉴定技术的实验室之间能够进行数据交流，从而有利于传染病多层次防控体系的建立。液相芯片是芯片技术与流式细胞术相结合的新技术。即将dna、抗体等附着于微球表面作为探针，在液相中与待测物结合，再加入荧光标记的报道分子，借助流式细胞仪检测微球表面荧光标记物。除了具有高通量、特异性高和灵敏度高等特点外，与传统的固相芯片比较，其还具有信号收集和处理快速、操作简便、成本相对低廉等特点。近年来，随着液相芯片技术的逐渐成熟，其正逐步用于科研和多个分子生物学诊断实验室，并逐渐商业化，显示了较好的应用前景。
细菌表面多糖抗原主要包括o多糖（o抗原）、普通抗原（ca）、胞外多糖抗原、芽孢、以及荚膜多糖（k抗原）等。基于上述表面多糖抗原的多样性，细菌可被分为不同的血清型。同一细菌不同血清型的o抗原多样性，是由于编码合成o抗原的各种酶的基因的遗传多样性决定的，这些基因往往成簇地位于基因组上的固定位点，被称作o抗原基因簇。小肠结肠耶尔森菌4个主要o抗原血清型的基因簇已被破译，这使得以每个基因簇中特异基因为靶标，设计基于分子生物学的分子血清型检测方法成为可能。
技术实现要素：
本发明在分析小肠结肠耶尔森菌o3，o5，o8和o9等4个主要o抗原血清型基因簇和特异基因的基础上，结合bio-rad公司的bio-plex200悬液芯片系统，建立了一套用于检测小肠结肠耶尔森菌上述4种o抗原血清型的悬液芯片检测系统及其检测方法，该检测技术具有准确性好、检测通量高、检测灵敏度高等特点，对于该菌的临床鉴定和流行病学监测具有重要意义。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
可以连接标记有不同荧光染料磁性微球的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸是从小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因、o5型的wzt基因，o8型的wzy基因、以及o9型的per基因中各自选取的一种dna片段。
上述dna片段的核苷酸序列为seqidno:1-4所示如下：
seqid(5'-3')
no:1ccacggattccaagttct用于检测小肠结肠耶尔森菌o3血清型
no:2tccctcaaatgcgtcaag用于检测小肠结肠耶尔森菌o5血清型
no:3cattttcagcagtatcccg用于检测小肠结肠耶尔森菌o8血清型
no:4tatgggcttccatgtaatatg用于检测小肠结肠耶尔森菌o9血清型
本发明进一步公开了所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针在制备用于检测小肠结肠耶尔森菌4个o抗原血清型中至少一种血清型的悬液芯片方面的应用。检测的实验结果显示该悬液芯片可以完成小肠结肠耶尔森菌4个o抗原血清型中至少一种血清型的检测。
本发明更进一步公开了连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针悬液芯片的制备方法，主要包含以下步骤：
（1）在小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因、o5型的wzt基因，o8型的wzy基因、以及o9型的per基因内部，设计并制备用于多重pcr的dna引物，每个血清型的引物包含上、下游引物各1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；
（2）在小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因、o5型的wzt基因，o8型的wzy基因、以及o9型的per基因内部设计并制备dna探针，每个血清型的探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条dna探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dt）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的磁性微球进行偶联；
（3）利用步骤（2）的特异探针与标记不同荧光染料磁性微球进行偶联；
（4）制备待检测样品的基因组dna，利用步骤（1）制备的引物，进行多重pcr扩增；
（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的探针进行杂交和染色；
（6）将步骤（5）获得的染色后的杂交产物利用bio-plex200悬液芯片系统进行检测；
其中，步骤（1）所述的引物的核苷酸序列如seqidno:5-12所示如下：
seqid(5'-3')
no:5gagtcgttgagggtgagg
扩增小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因的上游引物p1
no:6gatataatcccctctttccat
扩增小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因的下游引物p2
no:7agaaatggtaatggcaaaac
扩增小肠结肠耶尔森菌o5型的wzt基因的上游引物p3
no:8gatagcaaatgccaagcg
扩增小肠结肠耶尔森菌o5型的wzt基因的下游引物p4
no:9ctgatgaacgaggcgagt
扩增小肠结肠耶尔森菌o8型的wzy基因的上游引物p5
no:10tactccgtctgttatgcgg
扩增小肠结肠耶尔森菌o8型的wzy基因的下游引物p6
no:11ggaacggttgctttacact
扩增小肠结肠耶尔森菌o9型的per基因的上游引物p7
no:12ctattattgtcgcaaagagatt
扩增小肠结肠耶尔森菌o9型的per基因的下游引物p8
本发明公开的用于检测小肠结肠耶尔森菌4个o抗原血清型的液相芯片及应用所具有的积极效果在于：
（1）本发明首次建立了基于液相芯片检测系统的，用于重要食源性致病菌-小肠结肠耶尔森菌血清学分子分型的技术手段，填补了该领域的技术空白，可用于小肠结肠耶尔森菌4种主要致病型o抗原血清型菌株的临床鉴定和流行病学监测。
（2）该液相芯片检测体系可在24小时内完成对临床样品的检测，可同时检测4个致病性相关o抗原血清型的小肠结肠耶尔森菌，具有检测时间短和检测通量高的优点。
（3）该液相芯片检测体系对于基因组dna的检测灵敏度可达10pg。
附图说明
图1为本发明对于小肠结肠耶尔森菌4个o抗原血清型检测的结果输出柱状图。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。
实施例1
血清型特异引物的设计和制备
（1）选取小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因、o5型的wzt基因，o8型的wzy基因、以及o9型的per基因为靶基因序列。
（2）将选取的针对不同血清型小肠结肠耶尔森菌的靶基因序列导入引物设计软件primerprimier5.0中，设定参数。其中，选择正义链和互补链输出模式；序列扩增长度150-350bp；haripin：无；dimer：无：falsepriming：无；crossdimer：无。运行程序，得到针对每个血清型的上游和下游特异引物各1条。
（3）将设计好的引物序列发送至赛默飞世尔科技（中国）有限公司，进行dna合成，并利用page纯化，备用。其中，下游引物需要在dna序列的5’端连接生物素基团进行标记。
实施例2
血清型特异探针的设计和制备
（1）选取小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因、o5型的wzt基因，o8型的wzy基因、以及o9型的per基因为靶基因序列。
（2）将选取的各个血清型的靶基因序列导入引物设计软件primerprimier5.0中，设定参数。其中，只选择正义链输出模式；haripin：无；dimer：无：falsepriming：无；crossdimer：无。序列的位置位于实施例1中上、下游引物位置以内。运行程序，得到针对每个血清型的1条特异探针。
（3）将设计好的探针序列发送至赛默飞世尔科技（中国）有限公司，进行dna合成，同时在序列的5’末端连接12个碳原子作为连接臂，并在最后1个碳原子末端连接1个氨基基团，利用page纯化，备用。
实施例3
特异探针与微球的偶联（需要避光操作）
（1）涡旋仪上以最高转速悬浮微球30s，核对微球、探针编号，进行标记。
（2）取80微升微球于1.5ml离心管中，12000转/分钟，离心2分钟。
（3）弃上清，用10微升浓度为0.1mol/l的2-（n-吗啡啉）乙磺酸溶液（mes）（ph4.5）重悬，彻底涡旋，使微球分散；
（4）加入2微升探针（提前置于室温））和6微升新鲜配制的浓度为10mg/ml的1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液（edc）,混匀，室温黑暗孵育30分钟（每隔15min振荡混匀一番）。
（5）再加6微升新鲜配制的10mg/ml的edc溶液混匀，室温黑暗孵育30分钟。
（6）加入1毫升浓度为0.02%的吐温20溶液（tween-20），混匀，12000转/分钟，离心2分钟。
（7）弃上清，加入1毫升浓度为0.1%的十二烷基硫酸钠溶液（sds），重悬沉淀40秒，12000转/分钟，离心2分钟。
（8）弃上清，加入25微升的tris-edta缓冲液（ph8.0），重悬沉淀，高速涡旋30秒，4度并黑暗储存待用。
实施例4
多重pcr体系的建立
（1）首先利用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组dna提取试剂盒（产品号dp302），按照其操作步骤进行细菌基因组dna的提取。
（2）取上述基因组dna提取液0.5微升为模板，加入pcr反应混合液中。pcr反应混合液成分见表1。
表1.pcr反应混合液成分
（3）将反应混合物置于pcr仪（biometra）中，设定循环参数并运行。循环参数如下：
实施例5
多重pcr产物与探针-微球偶联产物的杂交
（1）将全部准备好的探针-微球偶联产物，最大转速涡旋混匀，每种探针-微球偶联产物取2微升混合，用1.5×tmac杂交缓冲液稀释250倍，振荡混匀。
（2）取上述探针-微球混合液33微升，加入多重pcr产物17微升，形成共50微升的杂交反应体系。空白对照则加17微升的tris-edta缓冲液（ph8.0）代替pcr产物。
（3）将上述杂交反应体系置于pcr仪中，设定反应参数并运行。反应参数如下：
实施例6
杂交产物的洗涤与染色
（1）将pcr管中的杂交产物转移到96孔板中，12000转/分钟，离心1分钟，加入70微升的1×tmac缓冲液洗涤2次，每次洗涤后12000转/分钟，离心1分钟。
（2）利用1×tmac缓冲液将streptavidin-pe荧光素稀释250倍，每孔中加入80微升稀释后的荧光素溶液。
（3）将96孔板置于杂交炉中，55℃，500转/分钟，震荡反应30分钟。
实施例7
杂交产物的上机检测（利用bio-plex200悬液芯片系统）
（1）打开仪器电源和连接电脑的电源，点击电脑桌面的bio-plexmanager按钮，进入软件界面。
（2）在仪器配套的mcv板中加入ddh2o和70%异丙醇溶液，置于机器中后，点击软件界面的startup按钮，后根据界面提示点击warmup按钮进行预热，一般预热30分钟。
（3）预热结束后，在mcv板中加入编号为cal1和cal2的校正液，点击calibrate按钮，进行仪器的校正。其中cal1和cal2校正液在加入前需恢复至室温，并斡旋混合30秒以上。
（4）校正完成后，点击工具栏的new按钮，打开方法编辑protocol窗口，按照提示填入微球编号和对应的探针编号。编辑结束后，点击formatplate按钮，按照96孔板的加样顺序依次设定检测背景（b）和待检样本（x）的检测位置。取出仪器中的mcv板，加入盛有样品的96孔板，点击runprotocol按钮开始检测。
（5）上述程序完成后，根据软件界面提示，保存数据为excel表格，用于后续分析。
点击工具栏的shutdown按钮，按照屏幕提示进行操作，提示结束后先关闭电脑的bio-plexmanager程序，再关闭机器电源和电脑电源。
检测结果表明：本发明的液相芯片可以实现对4个小肠结肠耶尔森菌o抗原血清型中至少一种血清型的检测。
实施例8
灵敏度检测
（1）将每个血清型的小肠结肠耶尔森菌菌株接种至5mllb培养基中，22℃，180转/分钟的摇床中过夜培养，收集2ml菌体。
（2）利用天根生化科技（北京）有限公司的细菌基因组dna提取试剂盒（产品号dp302），按照其操作步骤进行细菌基因组dna的提取。
（3）用nanodropod仪对提取的基因组浓度进行测定，并依次逐级梯度稀释。如此，加入对应反应体系的基因组dna分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg和1pg。
（4）按照实施例3的反应步骤进行实时荧光pcr反应，结果表明：对于基因组dna的检测灵敏度为10pg。
sequencelisting
<110>南开大学
<120>用于检测小肠结肠耶尔森菌4个主要o抗原血清型的液相芯片及应用
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ctattattgtcgcaaagagatt22
1.可以连接标记有不同荧光染料磁性微球的寡核苷酸探针，其特征在于该寡核苷酸是从小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因、o5型的wzt基因，o8型的wzy基因、以及o9型的per基因中各自选取的一种dna片段；所述dna片段的核苷酸序列为seqidno:1-4所示如下：
seqid(5'-3')
no:1ccacggattccaagttct用于检测小肠结肠耶尔森菌o3血清型
no:2tccctcaaatgcgtcaag用于检测小肠结肠耶尔森菌o5血清型
no:3cattttcagcagtatcccg用于检测小肠结肠耶尔森菌o8血清型
no:4tatgggcttccatgtaatatg用于检测小肠结肠耶尔森菌o9血清型。
2.权利要求1所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针在制备用于检测小肠结肠耶尔森菌4个主要的o抗原血清型中至少一种血清型方面的应用。
3.权利要求1所述连接在标记有不同荧光染料磁性微球上的寡核苷酸探针悬液芯片的制备方法，主要包含以下步骤：
（1）在小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因、o5型的wzt基因，o8型的wzy基因、以及o9型的per基因内部，设计并制备用于多重pcr的dna引物，每个血清型的引物包含上、下游引物各1对，且下游引物利用生物素基团进行标记；
（2）在小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因、o5型的wzt基因，o8型的wzy基因、以及o9型的per基因内部设计并制备dna探针，每个血清型的探针在基因上的位置均位于对应的上、下游引物之间，每条dna探针在5'末端均加入15个胸腺嘧啶核苷酸（dt）作为连接臂，并在连接臂末端加入氨基基团进行修饰，以便与带有羟基基团的磁性微球进行偶联；
（3）利用步骤（2）特异探针与含有不同荧光染料的磁性微球进行偶联；
（4）制备待检测样品的基因组dna，利用步骤（1）制备的引物，进行多重pcr扩增；
（5）利用步骤（4）获得扩增产物与步骤（3）获得的偶联微球的探针进行杂交和染色；
（6）将步骤（5）获得的染色后的杂交产物利用bio-plex200悬液芯片系统进行检测；
其中，步骤（1）所述的引物的核苷酸序列如seqidno:5-12所示如下：
seqid(5'-3')
no:5gagtcgttgagggtgagg
扩增小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因的上游引物p1
no:6gatataatcccctctttccat
扩增小肠结肠耶尔森菌o3型的wbbu基因的下游引物p2
no:7agaaatggtaatggcaaaac
扩增小肠结肠耶尔森菌o5型的wzt基因的上游引物p3
no:8gatagcaaatgccaagcg
扩增小肠结肠耶尔森菌o5型的wzt基因的下游引物p4
no:9ctgatgaacgaggcgagt
扩增小肠结肠耶尔森菌o8型的wzy基因的上游引物p5
no:10tactccgtctgttatgcgg
扩增小肠结肠耶尔森菌o8型的wzy基因的下游引物p6
no:11ggaacggttgctttacact
扩增小肠结肠耶尔森菌o9型的per基因的上游引物p7
no:12ctattattgtcgcaaagagatt
扩增小肠结肠耶尔森菌o9型的per基因的下游引物p8。
技术总结